章海鑫，付輝云，張燕萍，張愛芳，陶志英，王 生，余智杰

( 江西省水產(chǎn)科學研究所，江西 南昌 330039 )

目前，草魚(Ctenopharyngodonidellus)精養(yǎng)池塘水體一般為封閉或半封閉，養(yǎng)殖密度高、投喂量大，水體營養(yǎng)鹽的利用率不高，僅有少量餌料能被草魚吸收利用，殘餌、排泄物與殘骸等則通過物理、化學和生物作用逐漸沉降到水底淤泥中[1]。養(yǎng)殖水體與外界交換很少，沉積的營養(yǎng)鹽主要靠自身消解，此能力直接決定了沉積營養(yǎng)鹽的存在形式及其對養(yǎng)殖草魚和環(huán)境的影響程度[2]。參與底泥沉積營養(yǎng)鹽作用的底泥微生態(tài)系統(tǒng)扮演著重要的角色，不僅參與養(yǎng)殖系統(tǒng)中有機質(zhì)、無機鹽等物質(zhì)的循環(huán)代謝及能量代謝，也影響?zhàn)B殖動物消化系統(tǒng)微生物菌群結(jié)構(gòu)[3]。底泥微生態(tài)系統(tǒng)的演替一直貫穿于整個群落發(fā)展的始終。微生物具有較短的代時且對環(huán)境變化較為敏感，所以在池塘養(yǎng)殖過程中，底泥微生物群落結(jié)構(gòu)的變化能夠及時反映環(huán)境的變化，并且影響水產(chǎn)品的質(zhì)量[4]。因此，可以通過探明微生物群落之間的演替關系來評估和判斷養(yǎng)殖環(huán)境的變化。

草魚養(yǎng)殖池塘底泥微生物群落的研究已有很多，如程瑩寅等[3]用16S rDNA克隆文庫的方法分析主養(yǎng)草魚池塘底泥微生物群落結(jié)構(gòu)，Han等[5]使

用同樣的方法分析混養(yǎng)有草魚、異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)和團頭魴(Megalobramaamblycephala)的池塘底泥中微生物的主要群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢種群。以上兩種養(yǎng)殖模式下，池塘底泥微生物主要是變形菌門、厚壁菌門和分類地位未定的種類。此外，唐凌等[4]分析了不同年份草魚池塘底泥群落結(jié)構(gòu)，也從養(yǎng)殖模式上分析了成都平原主養(yǎng)草魚并搭配鯽魚(Carassiusauratus)池塘底泥中細菌的群落結(jié)構(gòu)[6]；張植強等[7]則使用PCR-DGGE技術分析了草魚和烏鱧(Channaargus)養(yǎng)殖圍隔中沉積物的微生物群落結(jié)構(gòu)。以上這些研究均使用16S rDNA克隆文庫和PCR-DGGE技術分析底泥群落結(jié)構(gòu)，而且均為一次性的分析底泥微生物群落結(jié)構(gòu)，并未分析底泥微生物群落在時間維度上的變化。但在草魚養(yǎng)殖周期中，環(huán)境會發(fā)生一定的變化，影響底泥的微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，分析草魚養(yǎng)殖池塘底泥微生物群落結(jié)構(gòu)隨養(yǎng)殖時間的變化情況對指導草魚養(yǎng)殖和分析微生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)作用有重要的意義。筆者利用MiSeq測序技術逐月分析草魚養(yǎng)殖池塘底泥微生物群落結(jié)構(gòu)，以期查明草魚養(yǎng)殖過程中底泥微生物群落的變化情況和池

塘底泥生態(tài)的變化。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 池塘養(yǎng)殖信息

樣品采集池塘為南昌市南昌縣蔣巷鎮(zhèn)同一養(yǎng)殖戶、同樣養(yǎng)殖模式[套養(yǎng)彭澤鯽(C.auratus)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙魚(Aristichthysnobilis)]的3口草魚精養(yǎng)池塘，均投喂全價配合飼料(表1)。

表1 池塘養(yǎng)殖情況

1.1.2 樣品采集

2018年4—11月，每月采集樣品。表層底泥樣品(約200 g)用彼得森采泥器采集，暫時保存在干冰采樣箱中，24 h內(nèi)帶回實驗室，于冰箱-80 ℃保存。

1.2 DNA提取、擴增和測序

分別稱取每月平行的3口池塘的底泥0.5 g，用土壤DNA提取試劑盒(OMEGA Soil DNA Kit，D5625)提取，提取后混合為1個樣。16S rRNA基因V3～V4區(qū)擴增引物為：341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠檢測后，利用膠回收試劑盒(QIAGEN)回收目的條帶。然后使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒(Illumina)進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量, 用HiSeq2500(北京諾禾致源公司)測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

1.3.1 序列處理

參照文獻[8]的方法，采用Illumina HiSeq測序平臺得到原始數(shù)據(jù)，然后進行拼接和質(zhì)控，得到有效數(shù)據(jù)，再進行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。然后基于有效數(shù)據(jù)進行運算分類單元(OTUs)聚類。

1.3.2 統(tǒng)計分析

利用Uparse軟件對所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類，以97%的一致性將序列聚類成運算分類單元。根據(jù)運算分類單元聚類結(jié)果對每個運算分類單元的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息。根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個樣品在門和種2個分類級別上最大豐度前10的物種，生成物種相對豐度柱形累加圖。對所有樣品的運算分類單元進行豐度分析、Alpha多樣性分析等，以得到樣品內(nèi)物種豐富度和均勻度信息等。使用QIIME軟件(Version 1.7.0)計算Alpha多樣性指數(shù)，包括ACE 指數(shù)、Chao1指數(shù)等豐富度指數(shù)。選用ANOSIM統(tǒng)計分析方法檢驗分組樣品的物種組成和群落結(jié)果的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果與多樣性分析

樣品原始序列為53 276～71 351條，得到最終的有效數(shù)據(jù)序列為47 743～65 233條，可歸納為14 027～21 098個運算分類單元(表2)。

表2 數(shù)據(jù)和運算分類單元數(shù)目統(tǒng)計

樣品序列多樣性分析結(jié)果見表3。物種豐富度指數(shù)ACE和chao1指數(shù)分別為8602.39～18 313.78和8471.27～17 863.10，5月最高，11月其次，10月和9月最低，其余月差別不大。物種數(shù)高峰出現(xiàn)在5月和11月，物種數(shù)低峰出現(xiàn)在10月和9月。10月和9月Shannon指數(shù)最低，5月最高，其次分別為4、6、7、11、8月等。綜上，4、5、6月多樣性高于其余月份。

2.2 菌群結(jié)構(gòu)分析

8個月的樣品中檢測到的微生物歸屬見表4。5月細菌總數(shù)最豐富，歸屬于60個門、148個綱、293個目、390個科、551個屬。10月細菌總數(shù)最少，歸屬于54個門、124個綱、251個目、328個科、398個屬。其余月介于兩者之間。

表4 4—11月樣品中檢測到門、綱、目、科、屬的種類數(shù)

主要門為變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、放線菌門、Nitrospinae、藍細菌門、螺旋體門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門、疣微菌門、廣古菌門12門類，在4—11月的樣品檢測量均超過1%，5、7、9月還有Patescibacteria，檢測量超過1%，10月和11月藍細菌門檢測量不超過1%，但10月梭桿菌門超過1%，而11月Latescibacteria超過1%。其余未超過1%的門主要是棒狀桿菌門、迷蹤菌門、Calditrichaeota、芽單胞菌門、纖維桿菌門、紫細菌門和Dependentiae等。在優(yōu)勢門(豐度超過10%)中，變形菌門是所有樣品中最大的優(yōu)勢菌群，豐度均超過了35%。綠彎菌門和擬桿菌門是4、7月的優(yōu)勢菌群，擬桿菌門和酸桿菌門是5月的優(yōu)勢菌群，擬桿菌門、綠彎菌門和酸桿菌門是6月的優(yōu)勢菌群，酸桿菌門是8月的優(yōu)勢菌群，綠彎菌門和酸桿菌門是9—11月的優(yōu)勢菌群。其他是未能確定門的和門分類比例較少的門(圖1)。ANOSIM檢驗結(jié)果表明，底泥月間差異不顯著(P>0.05)，微生物群落結(jié)構(gòu)組成大體相同，只有少量細菌在數(shù)量上存在較小差別。月份間菌群在種類和數(shù)量方面存在一定差異，但整體結(jié)構(gòu)差異不顯著。

圖1 樣品中基于門水平的菌群相對豐度分析

2.3 微生物種結(jié)構(gòu)組成

樣品中豐度最高的10個運算分類單元代表了主要微生物類型。4—11月樣品中10個最高運算分類單元代表的種(屬)見表5。地桿菌(Geobacter)、Desulfatiglans、Candidatuscompetibacter和厭氧粘細菌(Anaeromyxobacter)在4—11月的樣品中均有存在，且豐度大。除10月外，脫氯單胞菌(Dechloromonas)、螺旋體(Spirochaeta-2)和Crenothrix在其他月樣品中豐度均在前10。其中地桿菌在4、5、6、7月的樣品中豐度均最大，8、9、10、11月豐度波動變化。Desulfatiglans在4—9月是一個豐度逐漸上升的過程，8、9月豐度最大，后開始下降，11月又最大。10月豐度前10菌種組成與其他月的差別較大，豐度最大的是C.competibacter。脫氯單胞菌、螺旋體在其他月中有，但在10月豐度未超過10%。

表5 4—11月樣品豐度最高的10個運算分類單元

3 討 論

3.1 池塘底泥菌群結(jié)構(gòu)月度變化

雖然ANOSIM檢驗得出底泥月間微生物群落結(jié)構(gòu)差異不顯著(P>0.05)，而且張植強等[7]在草魚圍隔沉積物中也得到菌落結(jié)構(gòu)變化不顯著的結(jié)果；同樣Zhou等[9]認為，池塘底泥微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的原因是有機物的沉積量超過了池塘的凈化能力。但本研究發(fā)現(xiàn)，ACE和Chao1指數(shù)月度差異較大，Shannon指數(shù)也有一定的差異，這與史麗娜等[10,12]的結(jié)果類似，茍小蘭等[11]同樣得到異育銀鯽養(yǎng)殖池塘多樣性存在月度變化的情況，說明草魚池塘底泥微生物群落處于動態(tài)演替過程。唐凌等[4]發(fā)現(xiàn)，池塘經(jīng)養(yǎng)殖4年后微生物菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了演替，而本研究未發(fā)現(xiàn)群落結(jié)構(gòu)月度間的顯著性差異，可能是演化的時間不長。同樣，由本研究各月樣品優(yōu)勢門組成的變化也可以看到微生物群落的緩慢演替現(xiàn)象；雖然各月最大優(yōu)勢類群與程瑩寅等[3,13]報導的一致，均為變形菌門，但本研究中各月除了變形菌門外，其他優(yōu)勢門的構(gòu)成存在差異。茍小蘭等[11-12]的試驗得到了底泥豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)會隨著時間的推移而降低的結(jié)論，而本試驗中所得結(jié)果是豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)存在波動變化的趨勢，并在10月降至最低，11月有升高。原因可能除分析方法差異外，養(yǎng)殖過程中飼料投喂的增加—降低過程，也會導致對菌群結(jié)構(gòu)定向馴化由弱到強再變?nèi)醯倪^程。

(續(xù)表5)

3.2 菌屬對草魚底泥生態(tài)的影響

豐富度最高的10個運算分類單元有助于了解樣品中所含的主要微生物類型。一般認為，在有機物含量豐富的水體中，變形菌門，特別是δ-變形菌類群的數(shù)量增多[14]，而本研究中豐富度最高的10個運算分類單元均來源于變形菌門，這可能是大多高密度養(yǎng)殖池塘底泥微生物優(yōu)勢種均為變形菌門的原因。4—7月地桿菌豐度最高，8—11月則是脫硫酸鹽橡菌豐度最高。地桿菌屬于δ-變形桿菌綱，是最早發(fā)現(xiàn)的可以完全氧化有機物并獲得能量用于生長的異化鐵還原菌之一，廣泛存在于各種厭氧環(huán)境中，可以利用Fe(Ⅲ)和乙酸作為電子供體[15-16]。Moon等[17]認為，有機物的積累能刺激地桿菌大量富集。說明殘餌、排泄等使得池塘底泥有機物在4—7月持續(xù)遞增，而且池塘底部存在溶解氧缺少的問題。8月以后地桿菌豐度出現(xiàn)波動的原因之一可能是生物(草魚等)擾動使Fe(Ⅲ)反復活化[15]。同時也發(fā)現(xiàn)有另一種呼吸性鐵還原菌——厭氧粘細菌[18]在所有樣品中均有出現(xiàn)，它與地桿菌對氧化鐵的利用具有差別，其能夠偶聯(lián)乙酸鹽氧化，進行還原鐵礦的呼吸代謝。地桿菌和厭氧粘細菌均能夠在厭氧條件下抑制甲烷產(chǎn)生[15-18]，這也可以解釋許多草魚養(yǎng)殖池塘在缺氧時，底部時常產(chǎn)生氣泡，但慢慢氣泡會減少的現(xiàn)象。隨著養(yǎng)殖殘餌和排泄物等有機物的大量增加，底泥硫化物的含量也增加，所以8—11月樣品中Desulfatiglans豐度高于地桿菌。Desulfatiglans是Suzuki[19]于2014年分離的一種與脫硫小桿菌(Desulfobacterium)緊密聯(lián)系，但又與脫硫小桿菌屬中其他種明顯不同的新種，其主要功能是通過硫酸鹽還原的方式脫除硫酸鹽[20]。自8月開始，Desulfatiglans的豐度超過地桿菌，一度豐度最高，說明硫化物的累積量達到高峰，這也間接解釋了許多養(yǎng)殖池塘在養(yǎng)殖中后期容易出現(xiàn)硫化氫的現(xiàn)象。在4—9月豐度較高的脫氯單胞菌和Crenothrix在10月樣品中豐度未進前10，而10月豐度最高的是C.competibacter。脫氯單胞菌屬于兼性反硝化細菌，可以在有氧和無氧條件下礦化各種單環(huán)芳香化合物，將苯轉(zhuǎn)化成二氧化碳[21],還具有反硝化除磷的功能[22-24]；Crenothrix則是2017年[25]新分離的一種能夠氧化甲烷的細菌，屬于兼性細菌，可以在有氧和無氧條件下將甲烷氧化成二氧化碳，也具有減少硝酸鹽向亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化的功能。由此可知，10月草魚養(yǎng)殖池底泥中芳香族化合物及甲烷的產(chǎn)生得到一定的控制或者減少。而此時磷的含量累計到最高，所以C.competibacter處于領先優(yōu)勢，因其屬于聚糖菌，主要使用碳源除磷，在厭氧條件下將揮發(fā)性脂肪酸轉(zhuǎn)化成聚羥基脂肪酸，在有氧條件下可以將聚羥基脂肪酸氧化成二氧化碳或轉(zhuǎn)化成糖原[26]。