胡冬冬 劉韜 石少波 黃燕 梁颯 胡丹

[摘要] 目的 探討丹曲林（DTL）對慢性心力衰竭（CHF）大鼠心室細(xì)胞鈣運(yùn)轉(zhuǎn)及心功能的影響。 方法 將57只雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、CHF組和干預(yù)組（n = 19），分別給予生理鹽水、異丙腎上腺素（ISO）及ISO+DTL連續(xù)注射2周。干預(yù)2周后，行血流動力學(xué)和血清腦鈉肽（BNP）水平檢測。分離心室細(xì)胞，采用動緣探測系統(tǒng)記錄心肌細(xì)胞收縮;心肌細(xì)胞鈣熒光染料Fura-2 AM孵育后記錄心室細(xì)胞鈣瞬變（CaT），測量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣容量（[Ca2+]SR）。Western blot檢測心室Ryanodine 2型受體（RyR2）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵（SERC2a）及受磷蛋白（PLB）表達(dá)量。結(jié)果 與對照組比較，CHF組左室舒張末期壓力（LVEDP）、血清BNP水平、心室細(xì)胞舒張期Ca2+水平（[Ca2+]i）均顯著升高（P < 0.01），CaT衰減時(shí)間、心室細(xì)胞收縮達(dá)峰時(shí)間（TP）及細(xì)胞舒張50%時(shí)間（TR50）均顯著延長（P < 0.01），而左室收縮末期壓力（LVESP）、心室收縮期壓力上升及舒張期下降最大速度（±dP/dtmax）、心室細(xì)胞收縮百分比、CaT幅度、[Ca2+]SR、心室RyR2及SERCA2a表達(dá)量均顯著降低（P < 0.01）。與CHF組比較，干預(yù)組LVEDP、血清BNP水平、[Ca2+]i均顯著降低（P < 0.01），CaT衰減時(shí)間、TP及TR50均顯著縮短（P < 0.01），而LVESP、±dP/dtmax、心室細(xì)胞收縮百分比、CaT幅度、[Ca2+]SR、心室RyR2及SERCA2a表達(dá)量均顯著升高（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 DTL干預(yù)可改善CHF大鼠心功能，可能與DTL修復(fù)心室細(xì)胞鈣運(yùn)轉(zhuǎn)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 心力衰竭;丹曲林;鈣運(yùn)轉(zhuǎn)

[中圖分類號] R541? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（b）-0004-05

Effects of Dantrolene on calcium handling of ventricular myocytes and cardiac function in rats with chronic heart failure

HU Dongdong? ?LIU Tao? ?SHI Shaobo? ?HUANG Yan? ?LIANG Sa? ?HU Dan

Department of Cardiology， People′s Hospital of Wuhan University? Cardiovascular Research Institute of Wuhan University Hubei Key Laboratory of Cardiology， Hubei Province， Wuhan? ?430060， China

[Abstract] Objective To discuss the effects of Dantrolene （DTL） on calcium handling of ventricular myocytes and cardiac function in rats with chronic heart failure （CHF）. Methods According to the random number table method， 57 adult male SD rats were assigned to control group， CHF group and intervention group （n = 19）， which were given normal saline， Isoproterenol （ISO）， and ISO+DTL， for 2 weeks. Two-week later， the hemodynamic parameters and serum B-type natriuretic peptide （BNP） level were measured. The ventricular myocytes were isolated， then the cell contractility was automatically detected by the video edge-detector system. The calcium transient （CaT） and sarcoplasmic reticulum （SR） calcium content （[Ca2+]SR） were recorded by loading cardiomyocytes with Fura-2 AM. The protein levels of ryanodine receptor 2 （RyR2）， SR Ca2+-ATPase （SERCA2a） and phospholamban （PLB） were detected by Western blot. Results Compared with control group， left ventricular end diastolic pressure （LVEDP）， serum BNP level， diastolic intracellular Ca2+ level （[Ca2+]i） were significantly increased in CHF group （P < 0.01）， decay time constant （tau） of CaT， time to peak （TP） of cell contraction， time to 50% cell relaxation （TR50） were significantly extended in CHF group （P < 0.01）， while left ventricular end systolic pressure （LVESP）， ±dP/dtmax， cell shortening percentage， CaT amplitude， [Ca2+]SR， the protein levels of RyR2 and SERCA2a were significantly decreased in CHF group （P < 0.01）. Compared with CHF group， LVEDP， serum BNP level， [Ca2+]i， decay time constant of CaT were significantly decreased in intervention group （P < 0.01）， decay time constant of CaT， TP of cell contraction， TR50 were significantly shortened in intervention group （P < 0.01）， whereas， LVESP， ±dP/dtmax， cell shortening percentage， CaT amplitude， [Ca2+]SR， the protein level of RyR2 and SERCA2a were markedly increased in intervention group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion DTL treatment can improve cardiac function in rats with CHF， which may be related to the repair of calcium handling of ventricular myocytes by DTL.

[Key words] Heart failure; Dantrolene; Calcium handling

慢性心力衰竭（CHF）是心血管疾病發(fā)展的終末階段，嚴(yán)重危害人類健康。心肌細(xì)胞鈣運(yùn)轉(zhuǎn)異常是CHF發(fā)生的重要機(jī)制[1-4]。丹曲林（DTL）是一種Ryanodine受體（RyR）穩(wěn)定劑，臨床上常用于惡性高熱的治療。有證據(jù)顯示，DTL具有修復(fù)心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的作用[5-7]。本研究通過DTL持續(xù)干預(yù)CHF大鼠，探討DTL對CHF大鼠心室細(xì)胞Ca2+運(yùn)轉(zhuǎn)及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

Ⅱ型膠原酶（美國Worthington公司，222-938-1）;鈣熒光指示劑Fura-2 AM（美國Invitrogen公司，E0801A）;戊巴比妥鈉（武漢眾一生物，774080）;普通臺式液配方（mmol/L）：NaCl 130、KCl 5.4、CaCl2 1.8、MgCl2 1.0、Na2HPO4 0.3、HEPES 10.0和Glucose 10.0，NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4;異丙腎上腺素（ISO）、DTL、ryanodine 2型受體（RyR2）抗體（英國Abcam公司，gr324870-4）、肌漿網(wǎng)鈣泵（SERCA2a）抗體（英國Abcam公司，gr318-2545-3）及受磷蛋白（PLB）抗體（英國Abcam公司，gr3207682-3）;血流動力學(xué)檢測換能導(dǎo)管（美國Millar公司，型號：micro-tip）;血流動力學(xué)記錄PowerLab采集系統(tǒng)及分析軟件Chart 7.0軟件（澳大利亞AD公司，型號：4SP）;心肌細(xì)胞邊緣探測及鈣成像系統(tǒng)（美國Ionoptix公司，型號：6.5.1.92）;大鼠腦鈉肽（BNP）-32酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（武漢華聯(lián)科生物，437YNZJ3BT）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

雄性SD大鼠（n = 57），購自武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心，體重200～250 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對照組、CHF組和干預(yù)組（n = 19）。參照文獻(xiàn)[8-9]，CHF組給予ISO[5 mg/（kg·d）]腹腔注射，干預(yù)組腹腔注射ISO[5 mg/（kg·d）]和DTL[2 mg/（kg·d）]，對照組則注射生理鹽水[1 mL/（kg·d）]，所有藥物連續(xù)注射2周。

1.3 血流動力學(xué)評價(jià)

每組選取8只動物麻醉后，分離右頸總動脈，將一根2F的換能導(dǎo)管插入右頸總動脈直至左心室。穩(wěn)定10 min后，采用PowerLab/4SP系統(tǒng)和Chart 7.0軟件開始記錄心內(nèi)壓力信號和心率，測量左室收縮末期壓力（LVESP）、左室舒張末期壓力（LVEDP）、心室收縮期壓力最大上升速度（+dP/dtmax）及舒張期壓力最大下降速度（-dP/dtmax），用以評價(jià)心功能。

1.4 血清BNP水平檢測

動物完成血流動力學(xué)實(shí)驗(yàn)后，自心臟取血2 mL，血液室溫靜置1 h后給予5000 r/min（r = 8 cm）離心5 min制備血清。采用BNP-32酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒檢測血清BNP水平。具體檢測步驟按照相關(guān)說明書進(jìn)行，每個樣本測量2次，以pg/mL表示。

1.5 心肌細(xì)胞分離

每組選取6只動物肝素化（400 U，腹腔注射）10 min后麻醉開胸，剪下心臟，行主動脈插管后連接于離體心臟Langendorff系統(tǒng)。參照文獻(xiàn)[10]，采用Ⅱ型膠原酶灌注法進(jìn)行心室肌細(xì)胞分離。將收集的心室細(xì)胞逐步復(fù)鈣（終濃度為1 mmol/L Ca2+），用于鈣成像實(shí)驗(yàn)。

1.6 心肌細(xì)胞收縮力及鈣成像實(shí)驗(yàn)

每組選取15個心肌細(xì)胞，應(yīng)用可視化動緣探測系統(tǒng)及鈣熒光顯微鏡進(jìn)行心室細(xì)胞收縮力及鈣成像實(shí)驗(yàn)。心肌細(xì)胞肌小節(jié)收縮幅度由系統(tǒng)自動采集及分析。參照既往研究行鈣成像實(shí)驗(yàn)[10]，通過一對鉑金電極發(fā)放場刺激（1 Hz，2倍起搏閾值，脈寬2 ms），記錄8個連續(xù)的心室細(xì)胞鈣瞬變（CaT）。選取5個CaT計(jì)算平均值，參照既往研究[11]測量心室細(xì)胞舒張期Ca2+濃度（[Ca2+]i）、CaT幅度及CaT衰減時(shí)間。此外，參照既往文獻(xiàn)[12]，采用咖啡因誘導(dǎo)的CaT評價(jià)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣容量（[Ca2+]SR），步驟如下：心室細(xì)胞完成Fura-2 AM負(fù)載后，給予1 Hz場刺激2 min，隨后停止刺激，于細(xì)胞正上方滴入咖啡因（10 mmol/L），記錄咖啡因誘發(fā)的CaT，測量CaT幅度用以評價(jià)[Ca2+]SR。

1.7 鈣運(yùn)轉(zhuǎn)關(guān)鍵蛋白表達(dá)量檢測

每組選取5只動物麻醉后開胸，剪下心臟，取左心室組織放置于-80℃冰箱保存。使用RIPA裂解緩沖液提取心肌標(biāo)本總蛋白，隨后進(jìn)行蛋白濃度的測定。各樣品取50 μg蛋白上樣電泳，根據(jù)蛋白分子量配制相應(yīng)使用的PAGE膠電泳。對心室RyR2、SERCA2a及PLB表達(dá)量進(jìn)行Western blot檢測。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖均采用Graphpad prism 5.0軟件。本研究中連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單向方差分析進(jìn)行多組間比較，采用Tukey post hoc檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較

與對照組比較，CHF組LVESP及±dP/dtmax顯著降低，而LVEDP和血清BNP水平顯著升高（P < 0.01）。與CHF組比較，干預(yù)組LVESP及±dP/dtmax顯著升高，而LVEDP和血清BNP水平則顯著降低（P < 0.01）。見圖1。

2.2 各組大鼠心室細(xì)胞機(jī)械功能指標(biāo)比較

與對照組比較，CHF組心室細(xì)胞收縮達(dá)峰時(shí)間（TP）及心肌細(xì)胞舒張50%時(shí)間（TR50）均顯著延長（P < 0.01），而心室細(xì)胞收縮百分比顯著降低（P < 0.01）。與CHF組比較，干預(yù)組心室細(xì)胞TP及TR50均顯著縮短（P < 0.01），而心室細(xì)胞收縮百分比顯著升高（P < 0.01）。見圖2。