李 敏 張繼要 董 偉 趙亞梅 羅 強

鄭州大學第一附屬醫(yī)院兒科（河南鄭州 450000）

結(jié)節(jié)性硬化癥（tuberous sclerosis complex，TSC）是一種由外胚層組織和器官發(fā)育異常導致的遺傳性疾病，可累及全身多個系統(tǒng)和器官，引起皮膚、腦、腎臟等器官病變。其遺傳學特征為常染色體顯性遺傳，但自發(fā)突變率高，家族遺傳約占30%～40%，散發(fā)病例則可達60%～70%。目前已知致病變異基因為TSC1和TSC 2[1]。2012年最新TSC診斷共識提出將組織中TSC 1或TSC 2基因變異作為TSC的一項獨立診斷標準[2]，凸顯基因檢測在TSC診斷中的價值。TSC臨床表現(xiàn)個體差異大，基因變異多樣，外顯率不一，無熱點突變，目前尚不能根據(jù)患兒基因型準確推斷其臨床表型。本研究通過分析5個家系患者的臨床表現(xiàn)及基因檢測結(jié)果，以豐富TSC基因變異譜，并尋找TSC基因變異規(guī)律，進一步明確臨床表型與基因型的關(guān)系，有助于早期識別TSC。

1 臨床資料

5個家系之間無血緣關(guān)系，患兒父母均非近親結(jié)婚，來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院兒科住院部及門診。

先證者1，男，3月齡。出生時腹、腰部及手臂各見一色素脫失斑，直徑最大約6 mm，1月齡開始出現(xiàn)抽搐，表現(xiàn)為痙攣性發(fā)作。體格檢查：追視、追聽尚可，抬頭不穩(wěn)，無明顯發(fā)育落后。腦電圖提示兩側(cè)額、中央、頂、枕、顳區(qū)可見癇性波發(fā)放；頭顱CT檢查可見右側(cè)顳葉片狀高密度影?；純耗赣H軀干可見色素脫失斑，兩個姨母均有癲癇病史。

先證者2，女，3歲。1年余前出現(xiàn)間斷抽搐，表現(xiàn)為局灶性發(fā)作性繼發(fā)全面強直-陣攣發(fā)作，曾口服丙戊酸鎂緩釋片、奧卡西平，但控制欠佳。患兒3月齡會抬頭，8月齡會坐，1歲3月齡會走，智力發(fā)育稍落后于同齡人。體格檢查：鼻翼兩側(cè)散在血管纖維瘤，左側(cè)背部分別可見直徑3 mm、5 mm皮膚色素脫失斑。動態(tài)腦電圖提示發(fā)作期全導可見異常癇性波發(fā)放；頭顱CT示皮質(zhì)下多發(fā)鈣化灶?；純焊改阁w健，無類似疾病家族史。

先證者3，男，4月齡。3月齡時以局灶性癲癇發(fā)作起病，發(fā)作頻繁，約十余次/天，未出現(xiàn)智力落后情況。入院檢查血氨、乳酸、同型半胱氨酸、肝腎功能無異常；動態(tài)腦電圖示兩側(cè)額、中央、頂、枕、顳區(qū)可見癇性波發(fā)放；頭顱CT檢查未見鈣化灶。患兒父母及姐姐體健，無類似疾病家族史。

先證者4，男，10月齡。出生20余天發(fā)現(xiàn)顏面、胸、腹、背部散在片狀色素脫失斑，最大約15 mm；3月齡時出現(xiàn)癲癇性痙攣發(fā)作，逐漸出現(xiàn)語言、運動、智力發(fā)育落后，8月齡會坐，現(xiàn)不能扶站，不會認人。視頻腦電圖監(jiān)測到臨床痙攣性發(fā)作，伴高波幅爆發(fā)低電壓抑制；顱腦CT示左側(cè)半卵圓中心、雙側(cè)基底節(jié)區(qū)、雙側(cè)側(cè)腦室下多發(fā)鈣化灶；心臟彩超提示左室假腱索。患兒母親全身散在色素脫失斑，左側(cè)頸部散在血管纖維瘤，28歲時行腎臟占位手術(shù)（具體不詳）；患兒哥哥2歲時出現(xiàn)癲癇，面部可見散在血管纖維瘤，口服抗癲癇藥物治療控制可，現(xiàn)9歲，智力落后；患兒姐姐及父親體健。

先證者5，女，2歲。生后四肢即可見色素脫失斑，2月齡時家屬覺患兒面部表情呆滯，5月齡時面部出現(xiàn)散在血管纖維瘤，8月齡時以癲癇性痙攣發(fā)作起病，現(xiàn)智力、運動發(fā)育落后。頭顱CT示腦室管膜下可見多發(fā)鈣化灶。患兒母親10余歲時出現(xiàn)癲癇，口服抗癲癇藥物（具體不詳）后未再發(fā)作，現(xiàn)可見面部血管纖維瘤；哥哥可見面部血管纖維瘤；父親體健。

為進一步明確診斷，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，患兒及其家屬簽署知情同意書后對家系1、5先證者及其家系成員進行全外顯子測序，家系2、3、4先證者行癲癇及相關(guān)疾病基因檢測，所有具有臨床意義的變異采用Sanger測序進行驗證。先證者1的TSC 1基因存在c.2074 C＞T雜合無義變異，2074位堿基由胞嘧啶（C）改變?yōu)樾叵汆祝═），TSC1蛋白692號密碼子由精氨酸替換為終止密碼子，為自發(fā)變異（圖1）。先證者2及其父親的TSC 2基因存在c.2545+10 C＞T雜合變異，編碼區(qū)第2545號核苷酸后內(nèi)含子中第 10位核苷酸由C變?yōu)門，為剪切變異（圖2）。先證者3及其母親、姐姐的TSC1基因存在c.2497C＞T雜合無義變異，導致編譯第833號氨基酸Gln的密碼子變?yōu)榻K止密碼子（圖3）。先證者4及其母親、姐姐、哥哥的TSC 2基因存在c.4375C＞T雜合無義變異，導致編譯第1459號氨基酸Arg的密碼子變?yōu)榻K止密碼子（圖4），其致病性尚未見文獻報道。先證者5未發(fā)現(xiàn)異常變異。家系1、3的TSC1變異為無義變異，使蛋白質(zhì)截斷，均為已報道的致病性變異；家系2、4分別為剪切變異、無義變異，檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫（human gene mutation datebase，HGMD），其致病性尚未見文獻報道，經(jīng)Mutation Taster蛋白功能軟件預(yù)測，c.4375C＞T為很可能致?。╠isease-causing-automatic），ACMG評級為致??；c.2545+10C＞T為有可能致?。╠isease-causing），結(jié)合先證者典型的結(jié)節(jié)性硬化癥臨床表現(xiàn)，判定為致病性變異。

圖2 家系2 TSC2 基因chr:2124400 c.2545+10C＞T外顯子測序圖

圖3 家系3 TSC1 基因chr9:135776981 c.2497C＞T外顯子測序圖

圖4 家系4 TSC2 基因chr16:2134598c.4375C＞T外顯子測序圖

2 討論

T S C是一種少見的遺傳性神經(jīng)皮膚綜合征，以常染色體顯性遺傳方式遺傳，發(fā)病率約為1/10000～1/6000[2-3]。TSC1或TSC2功能缺失性雜合變異為其致病原因。TSC1位于第9號染色體，包含23個外顯子，TSC2位于16號染色體上，包含 42個外顯子，兩者分別編碼錯構(gòu)瘤蛋白和馬鈴薯球蛋白[4]。兩種編碼產(chǎn)物在細胞內(nèi)與TBC1結(jié)構(gòu)域家族成員7（TBC1D7）形成一個蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物具有三磷酸鳥苷激活蛋白（guanosinetriphosphate activating protein，GAP）作用，作用于哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路，通過PI 3 K/AKT信號轉(zhuǎn)導通路和Ras/有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導通路，負向調(diào)節(jié)下游Rheb蛋白，并抑制其信號傳遞功能，進而抑制基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，從而調(diào)控細胞周期、凋亡和自噬及細胞骨架重組[5]。TSC1或TSC2基因變異時，蛋白復(fù)合物的功能受到影響，失去對mTOR信號通路的抑制作用，對細胞生長、增殖、代謝抑制作用減弱，進而引起多器官功能損害[6]。

目前已發(fā)現(xiàn)TSC 1和TSC 2基因8種變異類型，1 000多個變異位點。在所有TSC變異中，TSC 2約占70%，TSC 1約占20%，約10%～20%未檢測出突變。TSC1變異絕大多數(shù)為無義變異和移碼變異，TSC2變異以錯義變異最為常見，其次為大片段的缺失或重組[5,7]。本研究中2例TSC 1變異患兒均為無義變異，TSC2無義變異、剪切變異各1例，未見大片段缺失，1例未檢測到致病變異，與既往報道的變異規(guī)律不完全相符，考慮與樣本量較少有關(guān)。其中家系2和家系4為新發(fā)現(xiàn)的TSC 2變異，查閱文獻其致病性均未見報道（參考數(shù)據(jù)庫：HGMD Pro及PubMed），但二家系的先證者及其親屬的臨床表型與基因變異相吻合，經(jīng)預(yù)測蛋白質(zhì)功能受到影響，因此判定為新發(fā)現(xiàn)的TSC致病性變異。

有文獻報道，超過一半的TSC變異為自發(fā)變異，而TSC自發(fā)變異中至少15%為體細胞嵌合體，約1%為生殖細胞嵌合體[8]。體細胞嵌合體的親代臨床癥狀輕微，而子代卻可能有嚴重的癥狀；生殖細胞嵌合體的親代幾乎沒有癥狀，而在子代可以檢測到與親代相同的致病變異。本研究中先證者1的臨床表現(xiàn)嚴重，其父母均未檢測出相應(yīng)變異，但母親有輕微的皮膚表現(xiàn)，因此家系1可能為體細胞嵌合體，但先證者的2個姨母均有癲癇病史，未進行相關(guān)基因檢測，尚不能明確是否家族性遺傳。先證者5有典型的皮膚色素脫失斑、癲癇發(fā)作及智力低下表現(xiàn)，但未檢測到變異。由于目前普通基因檢測技術(shù)尚不能檢測出嵌合體變異，推測其亦可能為嵌合體變異；此外可能存在未檢測到的第3種變異基因、表觀遺傳修飾效應(yīng)導致的轉(zhuǎn)錄沉默及未能檢測出的內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)域發(fā)生的變異[9]。

TSC的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且有年齡依賴性，在兒童常以癲癇發(fā)作和皮膚色素脫失斑起病。癲癇發(fā)作形式多樣，其中嬰兒痙攣癥多見，常伴智力發(fā)育落后[10]。既往研究發(fā)現(xiàn)，TSC2變異的臨床表現(xiàn)較TSC1變異嚴重，癲癇發(fā)生率更高，起病年齡更早，以嬰兒痙攣癥起病的概率更大，更容易遺留智力損害[11-12]。本研究中的先證者均以癲癇為首診癥狀，起病年齡小，但TSC1變異者的平均發(fā)病年齡低于TSC2，且癲癇發(fā)作控制較TSC2欠佳，與既往報道不完全一致，推測癲癇預(yù)后與基因變異類型本身無關(guān)，而與起病的發(fā)作形式有關(guān)。由于TSC 2變異個體中嬰兒痙攣癥發(fā)生率更多，導致臨床表現(xiàn)更加嚴重。TSC1、TSC2及無變異個體各有1例顱內(nèi)多發(fā)鈣化灶，且均以癲癇性痙攣發(fā)作起病，推測TSC 2變異個體更容易表現(xiàn)為癲癇性痙攣發(fā)作，可能與顱內(nèi)鈣化灶發(fā)生率高有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，無變異和TSC2變異個體更容易發(fā)生肺和腎臟病變[13]，但臨床表現(xiàn)較TSC2變異個體輕；與TSC1致病變異者相比，除更嚴重的腎和肺受累外，臨床表現(xiàn)沒有顯著性差異[14]。本研究中5個家系的先證者均未見心臟、腎臟、肺部等其他病變，考慮與患兒年齡尚小有關(guān)，待進一步隨訪。

本研究中家系2、3的先證者致病變異分別來自其父親、母親，但其父母均無相似臨床表現(xiàn)，家系4的先證者及其母親、哥哥、姐姐具有相同的致病變異，但臨床表現(xiàn)差異明顯，3個家系均存在臨床表現(xiàn)異質(zhì)性、明顯外顯率不全的情況，這可能與一定的發(fā)病年齡依賴性、第二次打擊的出現(xiàn)、體細胞突變以及尚未發(fā)現(xiàn)的基因修飾物有關(guān)[15]。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)2個新的致病性TSC變異位點，1例為自發(fā)變異，豐富了國內(nèi)的TSC突變譜，同一家系具有相同變異位點的個體臨床表現(xiàn)可各不相同，為TSC研究提供了新的臨床資料。基因檢測作為一種重要的檢測手段，對TSC尤其是無典型臨床表現(xiàn)患兒的早期診斷、早期干預(yù)治療進而提高患兒的預(yù)后及生存質(zhì)量有重要價值。