劉肖烽 李舒然 李六林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，晉中030800）

酥梨（Pyrus bretschneideri cv.Suli）是我國(guó)種植的主要果樹樹種之一，歷史悠久[1-2]。近幾年，部分酥梨果實(shí)上發(fā)現(xiàn)果頂部位硬度極大且回縮明顯，生產(chǎn)上稱之為“鐵頭病”，病果失去商品價(jià)值[3]。目前關(guān)于鐵頭病的研究集中于發(fā)病原因，其發(fā)生可能與樹體本身以及果園管理[4]、水分脅迫[5]、葉片和果實(shí)水分利用率有關(guān)[6]，且有研究認(rèn)為果實(shí)膨大期為發(fā)病關(guān)鍵時(shí)期[7]。Wang等[8]進(jìn)一步研究認(rèn)為鐵頭病是由于果實(shí)缺鈣引起。組織結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)病果實(shí)石細(xì)胞團(tuán)直徑變大[9-11]。但未發(fā)現(xiàn)有對(duì)病果果頂部位回縮以及鐵頭病影響下果肉組織細(xì)胞活性狀況的研究。

本研究利用中性紅、伊文斯藍(lán)、紅墨水、FDA對(duì)病果細(xì)胞活性進(jìn)行鑒定，旨在探明鐵頭病對(duì)果肉組織活性的影響，為鐵頭病的研究提供參考依據(jù)。細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整的植物組織，活性越強(qiáng)，中性紅染色程度越強(qiáng)[12]，F(xiàn)DA在細(xì)胞內(nèi)形成綠色熒光強(qiáng)度越強(qiáng)[13]，而不會(huì)被伊文斯藍(lán)[14]和紅墨水[15]染色。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)地點(diǎn)位于山西省祁縣修善村，在村中選取正常果園與發(fā)病果園。兩個(gè)果園常規(guī)管理，樹齡為10年生以上。正常果園沒有鐵頭病發(fā)生，發(fā)病果園均為連續(xù)3年發(fā)病，且發(fā)病率最高達(dá)40%。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 伊文斯藍(lán)染色 參照史華平[14]等的方法略有改進(jìn)。用水果刀垂直于酥梨果實(shí)赤道面縱切，取果實(shí)中部約1 mm厚果片。浸泡于0.4 mol/L甘露醇中，之后立即放入濃度為0.025%的伊文斯藍(lán)染液中浸染7 min，取出洗凈后放入緩沖液中洗脫，拍照并計(jì)算顏色值。

1.2.2 紅墨水染色 材料處理方法同1.2.1，將果片放入濃度為5%的紅墨水[16]中染7 min，洗凈、洗脫后拍照并計(jì)算顏色值。

1.2.3 中性紅染色 材料處理方法同1.2.1，將果實(shí)放入濃度為0.005%的中性紅[12]溶液中浸染7 min，取出洗凈后進(jìn)行洗脫，拍照并計(jì)算顏色值。

1.2.4 FDA染色 參照黃譯瑾[17]等的方法略有改進(jìn)。分別于正常果實(shí)果肩、果頂部位和病果果肩、果頂部位進(jìn)行徒手切片，放置于濃度為0.01%FDA溶液中，25℃黑暗環(huán)境下放置7 min，之后用熒光顯微鏡（Nikon Ni-U、Nikon C-HGFI熒光發(fā)射源、Nikon-Fi3相機(jī)）觀察染色結(jié)果，藍(lán)光激發(fā)，目鏡為10×，物鏡為4×。選取5個(gè)區(qū)域計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用ImagePro Plus計(jì)算中性紅、伊文斯藍(lán)、紅墨水染色顏色值與FDA的熒光強(qiáng)度。用Origin 2018和Office Excel 2010進(jìn)行柱形圖制作。用SAS8e進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中性紅、伊文斯藍(lán)和紅墨水檢測(cè)鐵頭病果實(shí)與正常果實(shí)活性

圖1 正常果實(shí)、鐵頭病果實(shí)和煮沸的正常果實(shí)染色

中性紅對(duì)正常果實(shí)和鐵頭病果實(shí)染色深（圖1 A-B），顏色值分別為 1 214.807和 1 210.139，無顯著差異(圖2)，但是顯著高于對(duì)煮沸后果實(shí)染色的顏色值13.121（圖1C和圖2）。

伊文斯藍(lán)與紅墨水對(duì)正常果實(shí)與鐵頭病果實(shí)染色均較淺，主要是果肉表層部分組織被染色（圖1 D-E），而對(duì)經(jīng)煮沸后的果實(shí)染色極深（圖1 F）。正常果實(shí)與鐵頭病果實(shí)被伊文斯藍(lán)與紅墨水染色后顏色值均無顯著差異，但是均顯著低于被對(duì)應(yīng)染液染過的煮沸后果實(shí)的顏色值（圖 2）。

圖2 正常果實(shí)、鐵頭病果實(shí)和煮沸的正常果實(shí)整體染色分析

2.2 FDA檢測(cè)鐵頭病果實(shí)與正常果實(shí)果肩與果頂部位組織活性

正常果實(shí)果頂部位熒光分布均勻(圖3 a-a1)，鐵頭病果實(shí)果頂部位熒光分布密集，細(xì)胞集中分布(圖3 c-c1)。正常果肩與鐵頭病果肩部位熒光分布狀況相似(圖3 b-b1和圖3 d-d1)，正常果實(shí)果肩與果頂、鐵頭病果實(shí)果肩與果頂熒光強(qiáng)度分別為 59.930、58.394、58.682 和 60.272，無顯著差異(圖4)。

圖3 正常果實(shí)與鐵頭病果實(shí)各部位FDA熒光

圖4 正常果實(shí)與鐵頭病果實(shí)FDA染色分析

3 討論與結(jié)論

紅墨水與伊文斯藍(lán)對(duì)正常果實(shí)與鐵頭病果實(shí)染色結(jié)果顯示，正常果實(shí)與鐵頭病果實(shí)被染色程度基本相同，沒有顯著差異。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確與直觀，對(duì)煮沸過的正常果實(shí)也進(jìn)行相應(yīng)染色，顏色值顯著低于正常果實(shí)與鐵頭病果實(shí)被染色對(duì)應(yīng)的顏色值。就果肉細(xì)胞活性而言，鐵頭病果實(shí)與正常果實(shí)無顯著差異。鐵頭病并未對(duì)果實(shí)細(xì)胞活性造成顯著影響，未導(dǎo)致果肉細(xì)胞死亡。在染色過程中病果組織與正常果組織表面均被染色是由于在制作切片過程中表層果肉細(xì)胞受到損傷。伊文斯藍(lán)染色尤為明顯，是由于除機(jī)械損傷外，伊文斯藍(lán)有其本身的顏色殘留，而這部分顏色殘留并不是由于細(xì)胞死亡造成的，因此在對(duì)組織染色時(shí)，紅墨水染色比伊文斯藍(lán)染色更加準(zhǔn)確。

中性紅對(duì)正常果實(shí)與鐵頭病果實(shí)染色顏色值無顯著差異，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確與直觀，對(duì)煮沸過的正常果實(shí)也進(jìn)行染色，顏色值顯著低于正常果實(shí)與鐵頭病果實(shí)顏色值。表明鐵頭病沒有造成果實(shí)組織壞死。在FDA染色中，正常果實(shí)與鐵頭病果實(shí)各部位熒光強(qiáng)度均無顯著差異，鐵頭病并沒有影響果實(shí)的細(xì)胞活性。鐵頭病果實(shí)果頂部位細(xì)胞排列緊密，這可能是鐵頭病果實(shí)果頂部位硬度大的原因之一。

綜上所述，鐵頭病對(duì)果實(shí)各部位果肉組織活性無顯著影響，病果果頂回縮的現(xiàn)象不是果頂部位細(xì)胞死亡造成的。