神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（neuroendocrine neoplasm，NE?Ns）是一種起源于彌漫性神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的異質(zhì)性腫瘤。胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（gastroenteropancreat?ic neuroendocrine neoplasms，GEP-NENs）是一類發(fā)病率最高的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[1]。根據(jù)胚胎來源，可將GEP-NENs 分為前腸（胃十二指腸和胰腺）、中腸（空腸、回腸、盲腸和闌尾）和后腸（遠端結(jié)腸和直腸）腫瘤。目前，GEP-NENs的診斷主要依靠組織活檢技術(shù)及影像學檢查。但現(xiàn)行的組織活檢技術(shù)在GEP-NENs中存在許多局限，如：無法對特殊部位進行組織活檢，反復取樣活檢對患者創(chuàng)傷較大，腫瘤異質(zhì)性較大，單個轉(zhuǎn)移部位的活檢結(jié)果無法反映腫瘤整體特點。此外，組織活檢很難對患者病情進行動態(tài)監(jiān)測。而影像學檢測手段仍然以內(nèi)鏡、CT、MRI 結(jié)合18F-PET/CT為主，導致大部分患者缺乏對生長抑素受體的檢測并暴露于輻射中，同時影像學手段不易發(fā)現(xiàn)隱匿性轉(zhuǎn)移灶或術(shù)后微小殘留灶。因此開發(fā)新的檢測技術(shù)對于GEP-NENs診斷勢在必行。

液體活檢是一種快速、方便、無創(chuàng)的檢測技術(shù)，其優(yōu)勢在于可以通過非侵入性的方法獲取患者的血液、尿液和糞便等樣本進行診斷，并且能實時、精準地反應患者的整體情況。目前液體活檢常用的檢測樣本為患者的血液，主要的檢測物包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤RNA（包括NETest及microRNA）和循環(huán)腫瘤細胞（circulat?ing tumor cells，CTCs）[2]。本文就GEP-NENs 診斷手段中傳統(tǒng)生物標志物的局限及液體活檢技術(shù)的應用現(xiàn)狀進行綜述。

1 傳統(tǒng)生物標志物的局限

神經(jīng)內(nèi)分泌細胞和GEP-NENs 可向循環(huán)系統(tǒng)中分泌肽、胺和其他分子，這些分子可作為生物標志物用于疾病診斷和病情監(jiān)測。其中非特異性循環(huán)腫瘤標志物包括嗜鉻粒蛋白A（chromogranin，CgA）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）等。但受某些疾病及藥物影響，其敏感性和特異性均不高。CgA的靈敏度在32%～92%之間，特異性在50%以下[3]。NSE 敏感性僅39%～43%，特異性僅65%～73%。因此僅能用作輔助診斷，不能單獨作為診斷和評價療效的指標。特異性循環(huán)腫瘤標志物包括5-羥基吲哚乙酸、胰島素、胃泌素、血管活性腸肽、促腎上皮質(zhì)激素、甲狀旁腺激素和生長激素釋放激素等。相比于非特異性循環(huán)腫瘤標志物，這些生物標志物的特異性稍高，但由于GEP-NENs的臨床癥狀缺乏特異性，不能僅憑單一循環(huán)腫瘤標志物進行診斷，往往需要協(xié)同影像學及組織活檢等手段進行診斷。因此，若能探索新的循環(huán)腫瘤標志物以輔助診斷和治療，將為GEP-NENs患者帶來極大獲益。

2 ctDNA在GEP-NENs中的應用

2.1 ctDNA的概述

ctDNA 在1948年首次被描述，主要由凋亡或壞死的細胞在血液中所釋放的短核酸片段組成[4]。研究表明ctDNA應用廣泛，如腫瘤診斷、微創(chuàng)分子分析、治療監(jiān)測、殘留疾病檢測和耐藥突變識別。檢測ctD?NA的技術(shù)主要包括1999年起提出的數(shù)字PCR（dP?CR）[5]、液滴數(shù)字PCR（ddPCR）[6]以及聯(lián)合流式技術(shù)及dPCR 技術(shù)的乳液微滴數(shù)字分析技術(shù)（BEAM?ing）[7]。2012年起隨著測序技術(shù)的發(fā)展，定向測序方法如標記擴增深度測序技術(shù)、全基因組測序、全外顯子組測序及下一代基因測序技術(shù)成為檢測ctDNA的主要手段[8]。

2.2 ctDNA能夠提高診斷的準確性

目前對于GEP-NENs 中ctDNA的研究主要集中于識別ctDNA中的突變基因或轉(zhuǎn)錄譜，以提高診斷的準確性。Boons等[9]在1例依據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2010 標準被定義為G3級患者的血液和組織中均檢測到了DAXX 的缺失，依據(jù)WHO2017 重新修訂的標準，該患者經(jīng)病理證實被定義為分化良好的神經(jīng)內(nèi)分泌瘤（neuroendocrine tumor，NET），這說明基于液體活檢檢測同樣可以對神經(jīng)內(nèi)分泌癌（neuroendocrine carcinoma，NEC）和分化良好的G3 NET患者進行更好的劃分。2016年歐洲神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤學會（ENETS）大會上有報道提出，利用全外顯子組測序可以在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（pancreatic neuroendocrineneo?plasm，pNENs）患者的血液中檢測到ctDNA的突變，且與組織學檢測到的突變一致[10]。目前針對pNENs分子研究中發(fā)現(xiàn)的突變基因除了DAXX 外還包括MEN1和ATRX[11]。針對小腸神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤（small intestinal neuroendocrine neoplasm，siNENs）的研究中發(fā)現(xiàn)8%的患者發(fā)生CDKN1B突變[12]。盡管目前有關(guān)ctDNA 在GEP-NENs 診斷方面的研究取得了一定的成果，但大多數(shù)研究仍處于初級階段，缺乏大數(shù)據(jù)驗證及理論支持，仍需高質(zhì)量研究以增加其可信度。

2.3 ctDNA能夠指導治療并實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測

傳統(tǒng)組織活檢的并發(fā)癥發(fā)生率較高，且往往難以獲得足夠的組織材料用于基因組分析（失敗率為10%～30%）。反復及多部位穿刺為患者帶來了身心壓力及經(jīng)濟損失，為疾病的動態(tài)監(jiān)測造成了障礙。ctDNA具有指導治療并實現(xiàn)動態(tài)監(jiān)測的作用，但目前的研究主要為個案報導。Wang等[13]利用ctDNA檢測發(fā)現(xiàn)，1例轉(zhuǎn)移性非典型性類癌患者中存在ALK異位，在使用ALK抑制劑阿來替尼后患者腫瘤持續(xù)縮小。Klempner 等[14]在1例直腸神經(jīng)內(nèi)分泌癌患者的尿液中檢測到了BRAF V600E突變，且該患者在使用BRAF/MEK抑制劑后，癥狀得到明顯的改善。除了對ctDNA的研究，Boons 等[9]對10例pNENs 患者的腫瘤特異性無細胞DNA（cell-free DNA，cfDNA）進行檢測。研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移患者中，腫瘤組織的拷貝數(shù)變異分布與cfDNA顯著相關(guān)，因此cfDNA可能與患者的預后相關(guān)。檢測血液中DNA甲基化的研究仍然在探索中。

ctDNA的檢測具有無創(chuàng)、取材方便等優(yōu)勢，為不能進行腫瘤活檢的患者提供檢測機會。同時隨著檢測技術(shù)的提高，其準確性也得到驗證，為替代重復有創(chuàng)活檢以實現(xiàn)病情動態(tài)監(jiān)測提供了可能。但ctDNA的檢測需要大量的腫瘤DNA釋放和腫瘤相關(guān)突變的存在，這導致了NENs患者檢測的局限性。因此目前針對ctDNA 在GEP-NENs 應用的探索仍然集中于發(fā)現(xiàn)新的突變基因，尚缺乏統(tǒng)一的定量標準，且檢測成本過高以至于在一定時間內(nèi)難以在臨床實踐中推廣。因此開發(fā)新的檢測技術(shù)，尋找新的突變基因，統(tǒng)一定量標準，降低檢測成本是未來需要研究探索的方向。

3 ctRNA在GEP-NENs中的應用

3.1 NETest在GEP-NENs診斷中的意義

除了避免多次活檢，在臨床實踐中還需考慮如何早診斷“隱匿”部位的原發(fā)腫瘤，以及生長抑素受體低表達所致的影像學不易識別的微小肝轉(zhuǎn)移灶。因此除了對影像學技術(shù)的開發(fā)，NETest是目前較有前景的檢測手段，其通過對2個GEP-NENs的微陣列數(shù)據(jù)集和1個包含正常腫瘤組織以及其他癌組織的微陣列數(shù)據(jù)集進行網(wǎng)絡(luò)互作，排除正常組織基因及與其他癌種相同的基因，最終可在外周血中檢測到51個針對NENs 的候選基因。目前的檢測方法是從全血中分離mRNA，利用PCR 檢測cDNA的產(chǎn)生[15]。51個轉(zhuǎn)錄本被列入NETest 中[16-17]，最終結(jié)果用NE?Test 得分（0～100 分）表示[18-19]。評分標準：≤20 分診斷為正常，21～40 分診斷為疾病穩(wěn)定，41～100 分診斷為進行性發(fā)病[20-22]。在GEP-NENs患者的診斷中，NETest 的敏感性和特異性均＞90%，較CgA和胰抑素顯示出了良好的優(yōu)越性[17]。同時也為GEP-NENs 特別是siNENs這種隱匿部位的早診帶來了機遇。

3.2 NETest相較于影像學的優(yōu)勢

NETest 具有極高的敏感性，能識別所有類型的NENs。在確診陽性的患者中，相較于68Ga-SSA PET/CT，NETest 診斷的準確性達到98%，說明NETests 可能具有生長抑素成像的輔助價值[23]。一項來自美國的真實世界研究（NCT02270567）證明NETest可以預測患者對生長抑素類似物（somatostatin analogues，SSA）治療的療效，準確性達到100%，可減少50%影像檢查的使用[21，23]，同時還可以對使用SSA的患者進行動態(tài)監(jiān)測。此外，NETest可以檢測到影像學或單個生物標記無法檢測到，但經(jīng)組織學證實的隱匿性肝轉(zhuǎn)移疾病[24]。這彌補了影像學檢查的不足，證明NETest 具有早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶和術(shù)后殘留灶的優(yōu)勢。Laskaratos 等[25]對34例接受原發(fā)部位手術(shù)的siNENs患者腸系膜纖維化（mesenteric fibrosis，MF）進行評估，結(jié)果顯示NETest-纖維小體對顯微鏡下MF 的檢測準確率為100%。因此NETest 對于放射學標準檢測圖像陰性的MF 患者是一種有前途的非侵入性生物標志物。

3.3 NETest對于預后的判斷

NETest也可以判斷腫瘤活性從而判斷療效及預后。依據(jù)NETest可將腫瘤活性分為低、中、高三種類型，其中低活性組評分≤40分，中活性組評分41～79分，高活性組評分80～100分。真實世界研究（NCT02270567）中納入100例患者，其中68%為GEP-NENs，該研究對患者進行了為期6～12個月的隨訪，結(jié)果顯示腫瘤活性低的患者可能獲得更好的療效和預后[20-23]。多肽受體介導的放射性核素治療（peptide receptor radionuclide therapy，PRRT）一般被用于治療轉(zhuǎn)移性或者不可手術(shù)的患者，研究證明NETest還可被用于評價預測對PRRT治療的反應[24]。一項納入35例pNENs及siNENs患者的NETest檢測結(jié)果顯示術(shù)前所有患者的NETest均升高，而CgA升高的僅14例。并且術(shù)后NETest有下降趨勢：從（80±5）分降至（29±5）分（P＜0.0001），術(shù)后NETest數(shù)據(jù)監(jiān)測顯示R0切除的患者中有4例回升，且6個月后經(jīng)影像學證實為復發(fā)[26]。一項研究對13例接受原發(fā)性腫瘤和/或腸系膜腫塊手術(shù)切除的siNENs患者，進行術(shù)前術(shù)后的NETest和CgA的監(jiān)測并與影像學檢查進行對比，結(jié)果顯示siNENs患者經(jīng)根治性手術(shù)治療后NETest評分明顯降低，即NETest評分能準確評價siNENs患者的手術(shù)療效，且術(shù)后監(jiān)測NETest可以識別腫瘤殘留并及早發(fā)現(xiàn)病情進展[27]。

NETest是目前最具前景的循環(huán)標志物之一，在診斷中具有早期診斷及發(fā)現(xiàn)隱匿病灶的優(yōu)勢，在治療方面能準確預測藥物療效和實現(xiàn)病情動態(tài)監(jiān)測，同時能對患者的預后進行判斷。但是由于其成本較高導致了其臨床應用的局限性，且其實際應用仍需大樣本數(shù)據(jù)的評估。因此，如何提高檢測技術(shù)，降低檢測成本是NETest未來發(fā)展的方向。

3.4 microRNA在GEP-NENs中的應用

microRNA是一種非編碼性小RNA，長度為21～25個核苷酸，可與mRNA的3'UTR 進行特異性相互作用，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后的基因表達。目前多項研究探索microRNA在GEP-NENs中的應用。miR-140和miR-21 在pNENs 中高表達，同時miR-21 的表達與Ki67 指數(shù)和肝轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以通過靶向PDCD4調(diào)節(jié)腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移[28]。在siNENs 中miR-96、miR-182、miR-183、miR196a、miR-200a 等均為高表達[29]。高表達的miR-196與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高有絲分裂計數(shù)、高Ki67 指數(shù)、總生存期（overall survival，OS）和無病生存期（disease-free survival，DFS）降低顯著相關(guān)[30]。此外，部分microRNA的表達下調(diào)也提示腫瘤可能發(fā)生轉(zhuǎn)移，例如miR-133a、miR-1和miR-143-3p 與轉(zhuǎn)移相關(guān)。盡管上述多項研究證實microRNA能夠調(diào)節(jié)GEP-NENs的增殖轉(zhuǎn)移，但是目前對于循環(huán)microRNA的檢測缺乏統(tǒng)一標準，且患者個體差異較大，因此有待繼續(xù)研究[31]。

4 CTCs在GEP-NENs中的應用

絕大部分CTCs 的表面存在上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM），Cell?Search 平臺可通過對EpCAM 的富集來檢測并計數(shù)CTCs。Khan等[32]在2011年首次證實了NENs中存在EpCAM 的表達，并將CTCs 描述為NENs 的循環(huán)腫瘤標志物。CTCs 雖然與腫瘤有直接關(guān)系，但因研究技術(shù)的局限性相關(guān)報道較少。有研究表明CTCs來源于原發(fā)性腫瘤和繼發(fā)性疾病部位，通常與疾病進展相關(guān)。同時，研究顯示在G1、G2 期NENs 中，CTCs 的存在與腫瘤負荷增加及CgA升高有關(guān)，并且與較低的無進展生存期（progression-free survival，PFS）和OS 相關(guān)[33]。此外，CTCs 計數(shù)可對患者的治療療效進行動態(tài)監(jiān)測。一項對138例NENs 轉(zhuǎn)移患者的研究發(fā)現(xiàn)，對CTCs的動態(tài)監(jiān)測有助于預測患者總生存和對于治療的反應性。相較于治療前的基線檢測，治療后CTCs降低50%以上或者檢測不到代表患者的預后更好[33]。此外，CTCs 與生長抑素受體和骨轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系仍在探索。研究發(fā)現(xiàn)CTCs的存在與GEP-NETs骨轉(zhuǎn)移相關(guān)[34]。但CTCs 的敏感性較差，通過Cell?Search平臺搜索顯示，中腸NENs和胰腺NENs患者中CTCs檢出率分別為43%和21%[35]。

綜上所述，CTCs敏感性和特異性較差，因此目前研究仍僅限于患者療效的動態(tài)監(jiān)測及預后的判斷，其診斷方面的研究仍需探索。目前多項研究證實在GEP-NENs中，液體活檢技術(shù)可能是未來最具潛力的診斷手段，但距離臨床應用尚面臨一定的挑戰(zhàn)，其優(yōu)勢和局限見表1。

表1 液體活檢技術(shù)的優(yōu)勢與局限

5 結(jié)語

GEP-NENs 的傳統(tǒng)診斷方法主要為組織病理學檢查和影像學檢查。新興診斷方法如液體活檢的應用彌補了組織活檢和影像學反復取樣及漏診隱匿病灶等不足。液體活檢除用于疾病診斷外，還可用于疾病監(jiān)測及療效判斷。ctDNA、NETest、microRNA和CTCs是目前研究的熱點標志物。其能從更宏觀的角度評價患者的整體情況，相較于組織學和影像學更加精準、方便，為實現(xiàn)GEP-NENs 患者的個體化診療提供了新的機遇。但由于檢測手段的限制以及缺乏大樣本數(shù)據(jù)支持，其臨床實際應用仍具有局限性。對于未來液體活檢的探索應該結(jié)合多學科多角度，積極尋找新的生物標志物，增強檢測靈敏度，提高檢測技術(shù)，降低檢測成本，實現(xiàn)集早診、治療指導和動態(tài)監(jiān)測為一體的診療技術(shù)。