溫丹丹 呂亞林 丁 芳 陳珊珊 韓 笑

近年來慢性炎癥反應(yīng)機制對主動脈瘤(Aortic Aneurysm，AA)的影響頗受關(guān)注。炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為炎癥細胞的趨化，其中以巨噬細胞的作用最為突出[1]。巨噬細胞可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)大量表達，MMPs 參與膠原蛋白和彈力纖維的破壞，最終導(dǎo)致AA 的形成和發(fā)展[2]。慢性牙周炎(chronic periodontitis)是由菌斑微生物所引起的牙齒周圍支持組織的慢性感染性疾病，其中革蘭陰性菌發(fā)揮重要作用。牙周細菌可以通過咀嚼和刷牙從齦溝釋放到血液中，菌體及其產(chǎn)物以及大量的炎癥介質(zhì)不斷進入血液循環(huán)并擴散至其他遠隔器官，繼而與心血管系統(tǒng)的組織發(fā)生相互作用。在心血管疾病如動脈粥樣硬化、動脈瘤等病理標(biāo)本中檢測到牙周細菌，提示心血管疾病與牙周炎癥密切相關(guān)[3,4]。本實驗通過對不同牙周狀況伴主動脈瘤的患者進行牙周檢查及瘤體組織檢測分析，初步探究牙周狀況對主動脈瘤的影響。

1.材料與方法

1.1 研究對象與實驗材料

1.1.1 研究對象 選取2014 年1 月～2018 年6 月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院大血管外科住院的主動脈瘤患者74 例，其中男性58 例，女性16 例，年齡54～85 歲，平均(66.9±7.6)歲，所有患者經(jīng)CT 檢查主動脈直徑大于正常值50%，并接受主動脈瘤手術(shù)。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：

(1)6 個月內(nèi)無牙周系統(tǒng)治療史，3 個月內(nèi)未連續(xù)使用抗生素；(2)排除假性動脈瘤，動脈夾層；(3)無系統(tǒng)性疾病，如惡性腫瘤、糖尿病、肝炎、呼吸及血液系統(tǒng)疾病；(4)女性不在月經(jīng)期、妊娠期或哺乳期；(5)無其他慢性感染性疾病。

所有患者臨床試驗前均簽署知情同意書。本研究開始前獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(倫理編號：2012001X 和2015011X)。

1.1.2 器材及試劑 組化筆(GT1001，Gene tech，中國)，病理切片機(RM2016，上海徠卡儀器有限公司，中國)，顯微鏡(XSP-C204，CIC，中國)。CD68 一抗(66231-1-Ig，proteintech，中國)，MCP-1 一 抗(Ab9669，Abcam，中 國)，TLR4 一抗(Ab22048，Abcam，中國)，ICAM-1一抗(60299-1-Ig，proteintech，中國)，山羊抗兔鼠通用二抗(K5007，DAKO，中國)，組化試劑盒DAB 顯色劑(G1211，Servicebio，中國)。

1.2 研究內(nèi)容 對所有研究對象在術(shù)前進行牙周臨床檢查及分組，并行問卷調(diào)查，在術(shù)中采集瘤體組織標(biāo)本福爾馬林固定，后行HE 染色及CD68、ICAM-1、TLR-4、MCP-1 的免疫組織化學(xué)染色。

1.2.1 牙周臨床檢查及分組

(1)牙周臨床檢查：檢查并記錄每位受檢者全口牙周狀況，記錄每顆牙6 個位點：頰側(cè)近中、中央、遠中及舌側(cè)近中、中央、遠中的牙周探診深度(Probing depth,PD)和附著喪失(Attachment Loss,AL)，同時記錄全口缺失牙數(shù)(不包括4 顆第三磨牙)情況。拍攝全口曲面斷層片，以顯示全口牙齒的牙槽骨吸收程度和類型。所有受檢者的牙周檢查均由同一位經(jīng)驗豐富的牙周專科醫(yī)師完成。

(2)研究對象分組：根據(jù)牙周檢查情況將研究對象分為2 組，即：

A 組：牙齦炎及輕度牙周炎伴主動脈瘤組：患主動脈瘤且伴有牙齦炎或輕度牙周炎者。

牙周健康或牙齦炎：平均附著喪失(attachment loss，AL)≤0.5mm、鄰面AL≥3mm 的位點數(shù)為0，失牙數(shù)(除第三磨牙或正畸需要的拔牙、外傷或重度齲失牙及先天性缺牙外的失牙)不超過2 顆[5]。

輕度牙周炎即牙周袋深度≤4mm，附著喪失1～2mm，x 線片顯示牙槽骨吸收不超過根長的1/3。

B 組：中、重度牙周炎伴主動脈瘤組：患主動脈瘤，具有中、重度牙周炎者。

中、重度牙周炎指口內(nèi)余留牙＞16 顆，PD≥4mm、CAL≥3mm，牙槽骨吸收達牙根長30%以上的牙齒≥全口牙數(shù)的30%，且至少有2 顆牙的PD≥5mm，CAL≥3mm，分布于2 個不同象限。

1.2.2 問卷調(diào)查 所有受試者在動脈瘤手術(shù)前均接受詳細的問卷調(diào)查，內(nèi)容包括個人一般情況如年齡、性別、體重、吸煙、飲酒情況等。

1.2.3 瘤體組織采集、處理及檢測 所有受試者術(shù)中動脈瘤瘤體組織離體后立即放入無菌病理袋內(nèi)，福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋切片，脫蠟至水，行HE 染色及CD68、ICAM-1、TLR-4、MCP-1 的免疫組織化學(xué)染色(按試劑盒說明書操作)，后于光學(xué)顯微鏡下觀察，用Image Pro Plus 6.0 軟件分析瘤體組織中各因子的表達情況。所有處理及檢測均于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心肺研究所完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，符合正態(tài)分布的兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，不符合正態(tài)分布則用Mann-Whitney U 非參數(shù)檢驗；計量資料用Pearson 卡方檢驗和Fisher 精確檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 牙周狀況及分組情況 74 例主動脈瘤患者中無牙周健康患者，其中患有牙齦炎及輕度牙周炎患者20 例，即為A 組；患中、重度牙周炎患者54 例，即為B 組。各組牙周探診深度、附著喪失、影像學(xué)骨喪失量及缺牙數(shù)情況如下表(表1)，兩組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表1 各組臨床牙周檢測及分組情況

2.2 一般資料比較 一般情況資料分析顯示：年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙和飲酒比例在A、B兩組間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)(表2)。

表2 各組一般情況臨床資料比較

2.3 病理學(xué)分析

2.3.1 HE 染色 HE 染色結(jié)果表明，B 組較A 的動脈壁結(jié)構(gòu)不規(guī)則，多數(shù)伴有炎癥細胞浸潤，平滑肌細胞走形紊亂且部分溶解消失，彈性纖維層明顯變薄并走形不規(guī)則。

圖1 各組主動脈瘤患者瘤體組織HE 染色(×40)

2.3.2 免疫組織化學(xué)檢測 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明，在動脈瘤的外膜和中膜中可見炎性細胞浸潤(圖2)，B 組中CD68 標(biāo)記的巨噬細胞數(shù)、ICAM-1 表達量及TLR4 陽性染色細胞數(shù)均高于A 組(P＜0.05)，而MCP-1 在兩組瘤體組織中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(圖2，3，表3)

圖2 各組主動脈瘤患者瘤體免疫組織化學(xué)染色(×200)

圖3 各組主動脈瘤患者瘤體免疫組織化學(xué)染色表達比較

表3 腹動脈瘤組織中CD68、ICAM-1、MCP-1、TLR-4 的表達

3.討論

慢性炎癥細胞浸潤是AA 病變的典型特征，由病原微生物引起的感染性炎癥可起到促進AA 發(fā)展的作用。牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周組織的感染性疾病，許多流行病學(xué)研究指出牙周致病菌參與全身性疾病的發(fā)展，其中心血管疾病被認(rèn)為是與牙周細菌感染密切相關(guān)的疾病[6]。Lockhart 提出了支持牙周疾病和心血管疾病相關(guān)的科學(xué)論點[7]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)牙周病是外周血管疾病的重要獨立危險因素[8]，Meta 分析顯示在調(diào)整了其他危險因素如吸煙、糖尿病、飲酒、肥胖和高血壓因素之后，牙周炎是冠心病的獨立危險因素[9]。本研究對74 例不同牙周狀況的主動脈瘤患者進行年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、吸煙和飲酒的一般臨床資料調(diào)查，發(fā)現(xiàn)以上因素比較并無統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在探究中重度牙周炎與AA 間的關(guān)系時排除了上述因素對于實驗結(jié)果的影響。

牙周炎患者體內(nèi)與血管內(nèi)皮功能障礙和心血管事件相關(guān)的炎癥標(biāo)志物如C 反應(yīng)蛋白，腫瘤壞死因子-α，白細胞介素(interleukin，IL)等水平升高[10]。Dietrich T 等研究得出：與未患牙周炎患者相比，牙周狀況較差的牙周炎患者冠狀動脈疾病發(fā)生率更高，這種影響?yīng)毩⒂谄渌汛_定的心血管危險因素[11]。Beck 等研究中也發(fā)現(xiàn)，牙周袋深度、牙槽骨喪失量與冠心病和腦出血密切相關(guān)[12]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在排除年齡、性別、吸煙及高血壓、糖尿病等影響因素后發(fā)現(xiàn)：AA 患者較非主動脈瘤患者牙周炎患病率更高，牙周狀況更差；且在伴牙周炎的AA 患者的瘤體組織中可檢測到相應(yīng)的牙周致病菌[13,14]。本研究HE 染色結(jié)果表明牙周炎癥越重AA 動脈壁結(jié)構(gòu)越不規(guī)則，炎細胞浸潤越明顯，動脈壁破壞越嚴(yán)重，進一步驗證了牙周炎與AA 間的關(guān)系。

相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)，口腔細菌在AA 的發(fā)生發(fā)展中也起到一定促進作用，巨噬細胞在AA 病變的炎癥浸潤中至關(guān)重要，而CD68 通常高表達于巨噬細胞。不同的牙周致病菌會誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生不同的炎癥反應(yīng)，P.g 有較強的誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞產(chǎn)生單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的能力[15]。Koizumi 等也發(fā)現(xiàn)P.g 誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達ICAM-1 的能力強于其他牙周致病菌[16]，從而增加內(nèi)皮細胞的通透性，促進炎癥細胞的趨化。此外Toll 樣受體與牙周炎密切相關(guān)[17]，Toll 樣受體-4(toll-like receptor 4，TLR4)信號通路在牙周炎相關(guān)的心腦血管疾病發(fā)生和發(fā)展中起重要作用，研究顯示TLR-4 能促進動脈粥樣硬化時泡沫細胞的形成，并導(dǎo)致粥樣硬化斑塊的破裂[18]，TLR-2 及TLR-4 能夠調(diào)節(jié)外周血中單核細胞對于炎癥因子的反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)時巨噬細胞的浸潤中起到重要作用[19]。本研究通過對不同牙周狀態(tài)的AA 患者的瘤體組織進行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)中重度牙周炎患者瘤體組織中CD68 表達增加，病變區(qū)域細胞間黏附分子ICAM-1 表達增加，并可見TLR-4 及趨化因子的陽性細胞染色增多，表明病變區(qū)域炎癥反應(yīng)的增加。ICAM-1 誘導(dǎo)了巨噬細胞在動脈壁的粘附、浸潤,巨噬細胞可能誘導(dǎo)MMPs 大量表達，進一步使動脈壁彈力纖維降解,促進AA 的發(fā)展；同時，TLR4 的激活可導(dǎo)致NF-κB 活化誘發(fā)血管炎癥反應(yīng)，進一步促進巨噬細胞的在瘤體管壁的浸潤。這與上述主動脈瘤與牙周致病菌相關(guān)的炎性因子表達是相一致的。但本研究中，雖然與中重度牙周炎的AA 患者比牙齦炎或輕度牙周炎的AA 患者MCP-1 陽性染色細胞數(shù)量較多，但MCP-1 陽性染色在兩組間并無統(tǒng)計學(xué)差異，關(guān)于瘤體巨噬細胞浸潤過程中MCP-1 所發(fā)揮的作用，還有待進一步探究。

綜上所述，中、重度牙周炎癥狀態(tài)可能誘導(dǎo)了巨噬細胞趨化和炎性細胞因子表達的增加，促進主動脈壁的損傷，從而促進AA 的發(fā)展。但二者間具體的作用機制還有待進一步研究。因此，適度的牙周炎癥的控制如牙周干預(yù)治療及口腔衛(wèi)生宣教等，對于主動脈瘤患者來說是十分有益的。