楊 坤 欒 波 馬 楠 劉 可 劉 軍 劉 娜 顧 斌 張 維

口腔微環(huán)境是一個(gè)共生功能體，口腔正常菌群之間以及它們與宿主之間相互依存，共同構(gòu)成了動(dòng)態(tài)平衡的口腔生態(tài)系[1]。牙體、牙周、黏膜、頜面部組織，甚至種植體常常出現(xiàn)感染性疾病會(huì)打破這種平衡。研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)[2]和大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)等可引起口腔頜面部感染[3,4]，變形鏈球菌(Streptococcus mutans，S.mutans)、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)[5]和伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，Aa)等致病菌是導(dǎo)致齲病[6,7]和牙周病[8]發(fā)生的主要原因。近年來(lái)，抗生素(如四環(huán)素)常常用來(lái)預(yù)防和治療因細(xì)菌感染引起的牙齦炎、牙周炎、口腔潰瘍、拔牙和種植體術(shù)后創(chuàng)面感染等問(wèn)題。眾所周知，長(zhǎng)時(shí)間使用抗生素會(huì)引起細(xì)菌耐藥性和生物安全性問(wèn)題[9]，尤其不適用于糖尿病等慢性病患者。然而，當(dāng)前市面上并沒(méi)有替代藥物或醫(yī)療器械可用。研究表明，抗菌多肽和ε-聚-L-賴氨酸具有殺菌能力強(qiáng)，抑菌譜廣，安全性高[10,11]及不產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，抗菌肽制成的藥物對(duì)牙周炎治療效果顯著，但其穩(wěn)定性，生產(chǎn)成本及安全性問(wèn)題還有待于研究及摸索[12,13],ε-聚-L-賴氨酸的合成機(jī)理及抑菌機(jī)制尚未揭示清楚，阻礙其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，因此本文旨在合成一種具有優(yōu)異生物安全性能的陽(yáng)離子型聚氨基酸(Cationic polyamino acid，CPAA)，分子鏈中含有堿性氨基酸，通過(guò)分子鏈中大量氨基與細(xì)菌作用，達(dá)到抑制主要口腔致病菌的效果，減少抗生素等抗菌藥物在口腔細(xì)菌感染領(lǐng)域的應(yīng)用。

1.材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 (1)昆明小鼠(SPF 級(jí))和黃金地鼠(SPF 級(jí))由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：11400700368604、1100111911 022806；(2)豚鼠(普通級(jí))由北京金牧陽(yáng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司提供，試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2015-0005，動(dòng)物合格證編號(hào)：11804800014706。

1.1.2 主要試劑與實(shí)驗(yàn)儀器 羥乙基纖維素(美國(guó)陶氏，藥典)、厭氧工作站(Gene Science，E200)、超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，SHP-250 型)、高壓蒸汽滅菌鍋、核磁1H-NMR(布魯克公司)、凝膠滲透色譜(Agilent Technologies，1260)。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株 本實(shí)驗(yàn)使用的金黃色葡萄球菌ATCC 6538、大腸桿菌ATCC 25922、變形鏈球菌ATCC 25175、牙齦卟啉單胞菌ATCC 33277、伴放線放線桿菌ATCC 29523 由中國(guó)科學(xué)院理化技術(shù)研究所抗菌檢測(cè)中心提供。

1.3 陽(yáng)離子型聚氨基酸(CPAA)的制備

(1)N(ε)-芐氧羧基-L-賴氨酸環(huán)內(nèi)酸酐(N(ε)-Carbobenzoxy-L-lysine N-Carboxyanhydride，NCA)合成：N(ε)-芐氧羰基-L-賴氨酸(Lys(Z))懸浮于四氫呋喃(Tetrahydrofuran,THF)，50℃密閉條件下與三光氣反應(yīng)，生成Lys(Z)-NCA(a)[14]，采用同樣法在60℃下生成纈氨酸-NCA(b)；(2)聚合反應(yīng)：利用六甲基二硅氮烷(Hexamethyldisilazane，HMDS)可控活性引發(fā)聚合的特性[15,16]，開(kāi)環(huán)聚合合成共聚物c，具體反應(yīng)過(guò)程為在25℃通氮?dú)猓瑢MDS 加入到含a 的DMF 溶液中，反應(yīng)3 d 后加入含b 的DMF 溶液，接著反應(yīng)3 d后再次加入含a 的DMF 溶液，繼續(xù)反應(yīng)3 d 后用甲基叔丁醚析出產(chǎn)物c；(4)脫保護(hù)基：將c 溶解于三氟乙酸，25℃下加入HBr/乙酸溶液反應(yīng)1～3 h，得到產(chǎn)物d；(5)純化：用離子交換樹(shù)脂純化產(chǎn)物d，最終獲得陽(yáng)離子型聚氨基酸CPAA 材料e(圖1)。

圖1 陽(yáng)離子型聚氨基酸CPPA 合成路線圖

1.4 抑菌性能評(píng)價(jià)

1.4.1 測(cè)試樣品制備 CPPA 溶液：將CPPA懸于滅菌水中，配制成所需濃度的CPPA 溶液；CPPA 凝膠：將CPPA 溶液中加入羥乙基纖維素(增稠劑，已通過(guò)美國(guó)藥典)，配制成含量為0.1%w/w CPPA 凝膠(CPPA 含量，實(shí)際應(yīng)用中的含量)。

1.4.2 最小抑菌濃度(MIC) 采用固體培養(yǎng)基稀釋法，將不同濃度的CPPA 溶液加于融化后冷卻至45 ℃的定量瓊脂培養(yǎng)基中，混合均勻，傾注平板，瓊脂凝固后即為含不同濃度CPPA 的培養(yǎng)基。分別接種2 μL 107CFU/mL 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌于瓊脂培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)24 h，觀察待測(cè)菌的生長(zhǎng)情況。

1.4.3 CPPA 凝膠抑菌性能 參考GB 15979-2002《一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》附錄C4 對(duì)CPPA 凝膠的抑菌性能進(jìn)行測(cè)試。取0.6 mL CPPA凝膠，將其涂在平皿底部2 cm×3 cm 區(qū)域，取0.1 mL 濃度約為105CFU/mL 的菌液(測(cè)試菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌、伴放線放線桿菌)，接種作用時(shí)間為2、5、10 和20 min。到時(shí)間后，加入4.3 mL PBS 進(jìn)行中止，再分別進(jìn)行逐級(jí)稀釋，針對(duì)不同接觸時(shí)間的試液，在不同梯度進(jìn)行平板活菌計(jì)數(shù)，得各試液的活菌濃度，抑菌率按公式計(jì)算。

抑菌率=(原菌數(shù)-活菌數(shù))/(原菌數(shù))×100%

1.5 安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)

1.5.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 參照16886.5 醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)，取生長(zhǎng)旺盛的L929，用胰蛋白酶消化成細(xì)胞懸液后，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105個(gè)細(xì)胞/mL，將配置好的細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板，分別設(shè)陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各設(shè)6 孔，每孔接種100 μL 細(xì)胞懸液，然后將96 孔板放置于5%CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去原培養(yǎng)液。陰性對(duì)照組加入細(xì)胞培養(yǎng)溶液。實(shí)驗(yàn)組加入試驗(yàn)樣品浸提液，每孔100 μL，置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換培養(yǎng)液后，將96 孔板放置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，然后每孔加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的MTT溶液50 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入100 μL 異丙醇溶液，震蕩平板，在酶標(biāo)儀570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度OD 值(參考650 nm)，計(jì)算相對(duì)增殖率(relative growth rate，RGR，RGR=實(shí)驗(yàn)組OD 值/陰性對(duì)照組OD 值×100%)。

1.5.2 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 參照消毒技術(shù)規(guī)范(2002 版)2.3.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)。先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以CPPA 溶液5000、4000、2000 和1000 mg/kg 劑量分組進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)給藥，找出其粗略致死劑量范圍，然后再設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量分組。

主試驗(yàn)：昆明小鼠，雌性各半，隨機(jī)分組，每組10 只。采用灌胃方式將受試物一次給予動(dòng)物。染毒后觀察動(dòng)物的中毒表現(xiàn)和死亡數(shù)及死亡時(shí)間，并對(duì)死亡動(dòng)物和觀察期滿處死動(dòng)物進(jìn)行尸體解剖，肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)有異常的組織或臟器，尚需進(jìn)一步作組織病理學(xué)檢查。觀察時(shí)間14d。

1.5.3 皮膚變態(tài)反應(yīng)——豚鼠最大劑量試驗(yàn)豚鼠，每組動(dòng)物數(shù)10 只，雌雄各半。參照GB 7919-1987 化妝品安全性評(píng)價(jià)程序和方法3.1.2.3皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)中豚鼠最大劑量試驗(yàn)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組受試物為0.1%w/w CPPA 凝膠。第一次致敏：陰性、陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別注射0.1 mL 對(duì)應(yīng)的樣品，如圖2 所示；二次誘導(dǎo)：注射后第8 天，在2 cm×4 cm 紗布上涂上適當(dāng)賦形劑配制的受試物，將其貼在注射部位，持續(xù)封閉固定48 h。對(duì)照組：僅用賦形劑注射；激發(fā)接觸：末次致敏后14 d，分別用2 cm×2 cm 的濾紙涂抹受試物，再次貼敷在兩側(cè)去毛區(qū)，持續(xù)封閉和固定24 h。激發(fā)接觸后24、48 和72 h 后，觀察反應(yīng)，并對(duì)其進(jìn)行皮膚反應(yīng)強(qiáng)度評(píng)分。

圖2 最大劑量致敏試驗(yàn)注射位點(diǎn)示意圖

1.5.4 口腔黏膜刺激試驗(yàn) 健康金黃色地鼠，每組動(dòng)物數(shù)3 只。參照16886.10 刺激與皮膚致敏試驗(yàn)。翻轉(zhuǎn)地鼠頰囊用生理鹽水沖洗后，無(wú)異常，用棉球浸透樣品(0.1%w/w CPPA 凝膠)，放入動(dòng)物的一側(cè)頰囊內(nèi)，另一側(cè)頰囊含生理鹽水的棉球作為陰性對(duì)照。接觸時(shí)間10 min，接觸后除去項(xiàng)圈和棉球，用生理鹽水沖洗頰囊(不要污染另一側(cè)頰囊)。每小時(shí)重復(fù)上述步驟，共4 h。取出棉球后肉眼觀察頰囊，按記分系統(tǒng)判定動(dòng)物每一觀察期頰囊表面紅斑反應(yīng)記分。末次接觸后24 h 肉眼觀察頰囊，無(wú)痛處死地鼠。取頰囊有代表性部位的組織樣品，放入4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，厚度5 mm，HE 染色，光鏡下觀察黏膜組織是否有病理改變。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS14.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P＜0.05 表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1 陽(yáng)離子型聚氨基酸CPPA 通過(guò)陰離子聚合方法成功制得陽(yáng)離子型聚氨基酸CPPA，并對(duì)其進(jìn)行1H-NMR 測(cè)試。結(jié)果如圖3 所示：以D2O 為溶劑，δ 0.80-0.86(-CH3)，δ 1.38-1.62(-CH2-)，δ 2.93-2.94(-CH2-)，δ 4.24(-CH-)。圖3 中1-3位置有6 個(gè)H(賴氨酸支鏈)和5-6 位置上有6 個(gè)H(纈氨酸支鏈)，賴氨酸與纈氨酸結(jié)構(gòu)單元的峰面積比3.68∶1；4 位置上有2 個(gè)H(賴氨酸支鏈)和5-6 位置上有6 個(gè)H(纈氨酸支鏈)，賴氨酸與纈氨酸結(jié)構(gòu)單元的峰面積比3.66∶1。因此我們獲得CPPA 為([C6H12ON2·HCl]3.67[C5H9ON])n。通過(guò)GPC 測(cè)試，以水為流動(dòng)相，得到Mn(數(shù)均分子量)=7574 g/mol，PD=1.095，n 約為11。

圖3 陽(yáng)離子型聚氨基酸CPPA 及其核磁氫譜

2.2 抑菌性能

2.2.1 CPPA 的最小抑菌濃度 采用瓊脂稀釋法[17]，對(duì)1000、500、250、125、62.5 μg/mL 5 個(gè)濃度梯度的CPPA 的抑菌性能進(jìn)行試驗(yàn)。從圖4 看出CPPA 對(duì)條件性致病菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最小抑菌濃度(MIC)值的范圍為500～1000μg/mL。

圖4 含不同濃度CPPA 瓊脂對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響

2.2.2 CPPA 凝膠的抑菌性能 將0.1%w/w CPPA 凝膠分別與含不同菌株的菌液作用考察其不同作用時(shí)間對(duì)細(xì)菌的抑菌效果，如圖5 所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPPA 凝膠與細(xì)菌共培養(yǎng)2、5、10 和20 min 后，對(duì)大腸桿菌的抑菌率分別是36%、63%、57%和＞99%，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌率分別是39%、60%、85%和＞99%，對(duì)變形鏈球菌作用的抑菌率分別是62%、＞99%、＞99%和＞99%，對(duì)牙齦卟啉單胞菌的抑菌率分別是34%、58%、88%和98%，與伴放線放線桿菌的抑菌率分別是35%、52%、89%和＞99%。證明僅僅含0.1%w/w CPPA凝膠對(duì)條件致病菌(大腸桿菌和金黃色葡萄球菌)和口腔致病菌(變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌和伴放線放線桿菌)有著優(yōu)異的抑菌能力，僅僅含0.1%w/w CPPA 凝膠共培養(yǎng)時(shí)間20 min 就可以殺死98%的主要口腔致病細(xì)菌。

2.3 生物安全性評(píng)價(jià)

2.3.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) MTT 比色法結(jié)果表明，0.1%w/w CPPA 凝膠相對(duì)增值率(RGR)為88%，與陰性對(duì)照組(B)無(wú)顯著性差異(圖6)，說(shuō)明此凝膠無(wú)細(xì)胞毒性。

2.3.2 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn) 參照消毒技術(shù)規(guī)范(2002 版)2.3.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)。以CPPA 溶液5000、4000、2000、1000 mg/kg 劑量分組進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)給藥，找出其粗略致死劑量范圍，然后再設(shè)計(jì)正式試驗(yàn)的劑量分組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)口染毒后，最大劑量組5000 mg/kg 無(wú)出現(xiàn)中毒癥狀和死亡情況。觀察期14 d 結(jié)束后，進(jìn)行大體病理解剖，主要臟器亦未見(jiàn)異常。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，CPPA 對(duì)雌雄大鼠急性經(jīng)口LD50 均大于5000 mg/kg，屬于無(wú)毒類物質(zhì)[18]。

2.3.3 皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)(豚鼠最大劑量試驗(yàn))進(jìn)一步利用豚鼠最大劑量試驗(yàn)評(píng)價(jià)0.1%w/w CPPA凝膠的生物安全性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在去除敷貼24、48 和72 h 后，2%甲醛陽(yáng)性對(duì)照組致敏和激發(fā)期間均出現(xiàn)紅斑和水腫，每只動(dòng)物皮膚刺激反應(yīng)積分均為＞1，致敏率為100%，為強(qiáng)致敏物質(zhì)(表1)，而CPPA 凝膠組與陰性對(duì)照組在皮內(nèi)注射激發(fā)期間基本一致，豚鼠狀態(tài)良好，動(dòng)物的活動(dòng)、采食、飲水、排糞、排尿、體重及外觀等亦未出現(xiàn)異常，在封閉敷貼24 h 后，兩組動(dòng)物局部激發(fā)部位均未發(fā)現(xiàn)有紅斑和水腫；激發(fā)結(jié)束后24、48 和72 h，觀察皮膚反應(yīng)均未發(fā)現(xiàn)有紅斑和水腫，每只動(dòng)物皮膚刺激反應(yīng)積分為0，致敏率為0%，無(wú)潛在致敏性。

圖5 CPPA 凝膠對(duì)口腔致病菌的抑菌率

圖6 0.1%w/w CPPA 凝膠的細(xì)胞毒性

表1 CPPA 凝膠致豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)皮膚反應(yīng)強(qiáng)度評(píng)分結(jié)果

2.3.4 口腔黏膜刺激試驗(yàn) 肉眼觀察，去除實(shí)驗(yàn)材料，1 h、2 h、3 h 和4 h 給藥前及末次給藥24 h 肉眼觀察口腔頰囊均未見(jiàn)紅斑、充血、出血、腫脹、糜爛、潰瘍等反應(yīng)(表2)。與陰性對(duì)照組無(wú)明顯差異。從組織學(xué)觀察評(píng)價(jià)(表3 和圖7)來(lái)說(shuō)，給藥后的地鼠口腔黏膜上皮完整，顯示上皮連續(xù)，細(xì)胞層次清楚，未見(jiàn)上皮異常反應(yīng)；未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)出血、水腫、異物反應(yīng)等其它異常反應(yīng)。與陰性對(duì)照組相比，無(wú)明顯異常，可以認(rèn)為CPPA凝膠對(duì)地鼠口腔粘膜刺激的組織學(xué)反應(yīng)為無(wú)刺激反應(yīng)[19]。

表2 急性接觸口腔黏膜刺激試驗(yàn)肉眼觀察評(píng)分結(jié)果

表3 急性接觸口腔黏膜刺激試驗(yàn)組織學(xué)評(píng)分結(jié)果

圖7 急性口腔黏膜刺激試驗(yàn)的組織切片

3.討論

鑒于使用抗生素會(huì)引起細(xì)菌耐藥性和生物安全性問(wèn)題[20,21]，當(dāng)前市面上沒(méi)有替代藥物或醫(yī)療器械可用，本研究制備陽(yáng)離子型聚氨基酸(CPPA)材料，研究其對(duì)口腔致病菌抑制作用及其生物安全性，為其在口腔感染防御及治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值提供依據(jù)。

本研究通過(guò)陰離子聚合反應(yīng)成功制備陽(yáng)離子型聚氨基酸材料，原料采用人體自身的氨基酸合成，質(zhì)量安全可控、低價(jià)格和高產(chǎn)量使得其實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化成為可能。合成的聚氨基酸材料表面含有豐富的陽(yáng)離子基團(tuán)，與細(xì)菌細(xì)胞膜上負(fù)電荷之間通過(guò)物理靜電作用而結(jié)合并聚集在質(zhì)膜上，擾亂了質(zhì)膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)原有的排列秩序，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)紊亂，從而達(dá)到抑菌的目的[22]。0.1%w/w CPPA 凝膠對(duì)口腔常見(jiàn)致病菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形鏈球菌、牙齦卟啉單胞菌和伴放線放線桿菌)進(jìn)行抑菌性能測(cè)試結(jié)果說(shuō)明，CPPA 凝膠可在短時(shí)間內(nèi)(20 min)對(duì)口腔常見(jiàn)致病菌有較強(qiáng)的抑制作用(抑菌率＞98%)。由此可推測(cè)，將來(lái)臨床應(yīng)用中將CPPA 用于口腔內(nèi)局部用藥，通過(guò)短時(shí)間的藥物接觸后能抑制口腔致病菌的生長(zhǎng)。在安全性評(píng)價(jià)方面，0.1%w/w CPPA 凝膠無(wú)細(xì)胞毒性，急性經(jīng)口毒性劑量LD50≥5000 mg/kg，屬無(wú)毒級(jí)；最大劑量致敏試驗(yàn)中，豚鼠移去敷貼24、48 和72 h 后，無(wú)紅斑、水腫，致敏率為0，CPPA凝膠無(wú)潛在致敏性；在急性口腔黏膜試驗(yàn)中，無(wú)紅斑，組織無(wú)病變，CPPA 凝膠對(duì)地鼠口腔黏膜無(wú)刺激性。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以初步判定CPPA 具體良好的生物安全性。

綜合以上，研究結(jié)果為進(jìn)一步評(píng)價(jià)陽(yáng)離子型聚氨基酸在口腔感染防治應(yīng)用，以及其在口腔修復(fù)過(guò)程中義齒性口炎的預(yù)防及治療和口腔牙菌斑(齲病和牙周炎)防治中的潛在應(yīng)用價(jià)值，為探討相應(yīng)的臨床上有效的預(yù)防、治療手段和藥物奠定了前期的試驗(yàn)基礎(chǔ)。