秦 瑩 董 晶 王 超 孫晉虎 王 冕 鄭紀(jì)偉

口腔癌是常見的惡性腫瘤之一，其中，90%為上皮源性鱗狀細(xì)胞癌，即口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)[1]，現(xiàn)在臨床上治療鱗癌的方法仍以手術(shù)為主，但受口腔固有解剖結(jié)構(gòu)的限制及鱗癌可通過淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性，單純的手術(shù)常難以達(dá)到滿意的效果，患者的5 年生存率仍舊比較低[2]。這使得探尋積極有限的化療藥物成為一種必要。

二甲雙胍(metformin)作為雙胍類的口服降糖藥，被臨床上廣泛用于治療2 型糖尿病[3]，劉洪臣[4]等人發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠一定程度上改善因糖尿病引起的骨改建失衡。后人們逐漸發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能夠降低糖尿病患者罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[5]，并在一定程度上降低了與癌相關(guān)的患者死亡率[6]，這提示二甲雙胍具有一定的抗癌作用[7]，隨著研究的深入，不斷有學(xué)者發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能顯著抑制肺癌、乳腺癌、前列腺癌等一系列腫瘤細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)凋亡[8,9]，而目前對(duì)于二甲雙胍在口腔癌方面抗癌作用的研究仍舊比較少見，對(duì)OSCC 遷移、侵襲的機(jī)制研究不夠充分。

本實(shí)驗(yàn)擬以O(shè)SCC 細(xì)胞作為研究的對(duì)象，在體外研究不同濃度(0、5、10、20、40mmol/L)二甲雙胍作用下細(xì)胞遷移、侵襲能力的變化，并探討其可能的作用機(jī)制，為臨床上篩選出更優(yōu)良的治療藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株由江蘇省南京醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng)，徐州醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物研究中心保存。

1.2 主要試劑 DMEM/F12 培養(yǎng)基(上海立菲生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；無噬菌體低內(nèi)毒素胎牛血清(杭州四季青公司，中國(guó))；二甲雙胍(calbiochem 公司，德國(guó))；MMP-2(Proteintech 公司，美國(guó))；Transwell 小室(Costar 公司，美國(guó))；matrigel(corning 公司，美國(guó))；CCK8 試劑盒(碧云天生物科技有限公司，中國(guó))；BCA 蛋白定量試劑盒(南京凱基生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó))；兔二抗(徐州醫(yī)科大學(xué)，中國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 OSCC 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 口腔鱗狀細(xì)胞癌HN4 細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100ng/mL 鏈霉素的DMEM/F12 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃，含5%CO2的濕潤(rùn)無菌環(huán)境中，0.25%胰蛋白酶消化傳代，1～2d換液，2～3d 傳代1 次。所有用于實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。實(shí)驗(yàn)中共分為5 組，分別加入二甲雙胍使培養(yǎng)基中的藥物濃度為0、5、10、20、40mmol/L，其中，二甲雙胍濃度為0mmol/L 組作為實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照組。

1.3.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 通過胰酶消化收集細(xì)胞，按2.5×106/孔的密度接種于預(yù)先劃好水平線的6 孔培養(yǎng)板中，每孔板中加入培養(yǎng)液1mL，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)數(shù)時(shí)候后，更換無血清培養(yǎng)基使細(xì)胞“饑餓”24h，用200uL 的槍頭垂直于水平線一直線，形成一長(zhǎng)條狀的無細(xì)胞“空白”區(qū)域，以PBS 沖洗掉脫落的細(xì)胞，分別加入1ml 含0、5、10、20、40mmol/L 的二甲雙胍培養(yǎng)基。分別在孵育0h、12h、24h 時(shí)采集圖像。用IMAGE PRO PLUS 在圖像劃痕中五個(gè)不同位置，測(cè)量細(xì)胞“空白”區(qū)域的面積，根據(jù)圖像高度，計(jì)算出對(duì)應(yīng)寬度，并計(jì)算6 個(gè)不同位置的平均寬度。用細(xì)胞遷移指數(shù)(migration index,MI)來表示細(xì)胞遷移速度的快慢。計(jì)算公式：MI=100%×(W0-Wt)/W0。其中劃痕后立即采集圖像(0h)時(shí)劃痕所致的“空白”區(qū)域?qū)挾葹閃0，t h 后劃痕“空白”區(qū)域測(cè)量出的寬度為Wt。

1.3.3 體外transwell 小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將Matrigel 膠4℃過夜融化后用無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基按1∶4 比例稀釋，以50ul/孔在Transwell上室進(jìn)行鋪膠，37℃放置過夜后使其凝固。上室中加入100uL 總量約5×105的HN4 細(xì)胞，并加入二甲雙胍使上室中藥物濃度為0、5、10、20、40mmol/L，下室中加入600uL 含10%FBS 的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h 后將小室用PBS 洗2 次，甲醇固定15min，清洗2 次，加入0.1%的結(jié)晶紫染色5min。用棉花棒擦凈上層的細(xì)胞，在顯微鏡下隨機(jī)選擇6 個(gè)視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)。

1.3.4 蛋白提取和免疫印跡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OSCC 細(xì)胞等數(shù)目接種于10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入不含血清含不同濃度二甲雙胍的細(xì)胞培養(yǎng)基，干預(yù)48h 后，加入細(xì)胞裂解液200ul，冰浴30min 后細(xì)胞刮刮凈收集入EP 管中，14000r/min，4℃離心5min 后吸取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，定量上樣進(jìn)行10%聚丙烯酸凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉，一抗4℃搖床孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育2h 后，洗膜后應(yīng)用Odyssey 紅外激光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行條帶掃描，Image J 進(jìn)行灰度值分析，以β-actin 作為內(nèi)參，計(jì)算出目的蛋白和內(nèi)參灰度值的比值相對(duì)灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)包軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料以±s 表示，多樣本量之間采用單因素方差分析(ANOVN)，多組間的兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 二甲雙胍體外對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響 在劃痕實(shí)驗(yàn)過程中，所有組別的細(xì)胞都向著劃痕空白區(qū)域發(fā)生了遷移現(xiàn)象(見圖1)，空白對(duì)照組中OSCC 向著“空白”區(qū)域爬行速度較快，經(jīng)過24h 培養(yǎng)后，劃痕寬度明顯變窄。而經(jīng)二甲雙胍作用后，劃痕“空白”區(qū)域修復(fù)明顯減慢。在12h時(shí)，空白對(duì)照組與二甲雙胍各濃度組(5、10、20、40mmol/L)的遷移指數(shù)分別為(47.65±5.21)%、(23.33±3.21)%、(19.86±4.74)%、(11.19±4.73)%、(8.64±2.26)%，各藥物作用組與空白間相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥物作用24 h 后，細(xì)胞的遷移指數(shù)分別為(79.86±3.66)%、(41.61±1.23)%、(31.86±3.63)%、(24.59±5.60)%、(11.40±2.15)%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析任意2 組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示不同濃度的二甲雙胍均可抑制OSCC 的遷移能力，且作用24h 后隨著藥物濃度的增加，這種抑制遷移的作用越明顯。

2.2 二甲雙胍體外對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)顯示(如圖2)，隨著藥物作用濃度的增加，穿過transwell 上室到達(dá)下室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，0 mml/L 的對(duì)照組中在24h 穿過的細(xì)胞數(shù)為(30±9),而藥物組5mmol/L、10 mmol/L、20mmol/L、40mmol/L 在相同時(shí)間內(nèi)穿過基底膜平均每個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)分別為(23±6)、(16±4)、(9±4)、(3±2)，均與0mmol/L 的空白對(duì)照組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),且任意2 個(gè)不同濃度的藥物組間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。即細(xì)胞的侵襲能力隨藥物濃度的升高呈下降趨勢(shì)。

2.3 二甲雙胍對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞MMP-2 表達(dá)的影響 采用不同濃度的二甲雙胍作用于口腔鱗癌細(xì)胞48 h 后，通過Western 印跡法來測(cè)定細(xì)胞中MMP-2 的表達(dá)情況，相對(duì)灰度值分別(0.69±0.01)、(0.62±0.04)、(0.55±0.05)、(0.48±0.04)、(0.38±0.04)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，各藥物濃度組之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3)。

圖1 二甲雙胍體外對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響(*P＜0.05)

圖2 二甲雙胍體外對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞侵襲能力的影響(*P＜0.05)

圖3 二甲雙胍對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞MMP-2 表達(dá)的影響(*P＜0.05)

3.討論

侵襲和轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞的重要特征,也是造成90%癌癥患者死亡的原因[10]，OSCC 作為頭頸部最常見的惡性腫瘤,亦具有一般癌細(xì)胞的上述特征。因而如何對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞侵襲和遷移能力進(jìn)行有效干預(yù)和阻斷，是我們一直以來關(guān)注的重點(diǎn)，且已有研究表明二甲雙胍體外實(shí)驗(yàn)中能夠有效抑制細(xì)胞周期生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，具有作為腫瘤臨床治療輔助用藥的潛力[11,12]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)OSCC 有著較強(qiáng)的抑制作用，在低濃度(5mmol/L)時(shí)，已經(jīng)能夠抑制OSCC 細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而隨著藥物濃度的增加，這種抑制作用愈發(fā)明顯，在藥物濃度達(dá)到40mmol/L 時(shí)，其使OSCC 細(xì)胞的遷移指數(shù)由空白對(duì)照組時(shí)的(79.86±3.66)%降低到了(11.40±2.15)%，也使穿過matrigel 的OSCC 細(xì)胞數(shù)明顯減少。

腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲包括諸多環(huán)節(jié),如何穿越生物學(xué)屏障是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的一項(xiàng)重要步驟[10,13]。腫瘤細(xì)胞可通過降解細(xì)胞外結(jié)締組織間質(zhì)和血管基底膜這些天然屏障的能力依賴于蛋白水解酶的作用。基質(zhì)質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)作為其重要組成成分，在腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及新生血管形成中起著重要的作用[14]。而MMP-2 被認(rèn)為是與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系最為密切的酶類之一[15]。Chien MH 等認(rèn)為MMP-2 可能是治療頭頸部腫瘤的一個(gè)重要靶點(diǎn)[16]，他們發(fā)現(xiàn)紫檀芪(pterostilbene)可通過下調(diào)MMP-2和纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator，u-PA)的表達(dá)來抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌SCC-9 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力[17]。Weng 等[18]也發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、MMP-2、MMP-9參與介導(dǎo)Beclin 1 的細(xì)胞自噬過程，而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力。本實(shí)驗(yàn)通過Western印跡法分析檢測(cè)亦得出了一致的結(jié)論，5、10、20、40mmol/L 二甲雙胍的實(shí)驗(yàn)組中MMP-2 的表達(dá)均較空白對(duì)照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且各實(shí)驗(yàn)組間隨著二甲雙胍作用濃度的增加，MMP-2 的相對(duì)灰度值越低。提示二甲雙胍可以抑制細(xì)胞MMP-2 的表達(dá)，且在研究的藥物濃度范圍內(nèi)，二甲雙胍濃度越高，這種抑制作用越明顯，且與藥物對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲的抑制趨勢(shì)相同。由此可以推測(cè)二甲雙胍可通過抑制MMP-2的產(chǎn)生，而抑制OSCC 細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，二甲雙胍可抑制OSCC 侵襲和遷移作用,可能與下調(diào)MMP-2 的表達(dá)相關(guān)，而探討更為詳細(xì)的作用機(jī)制將成為下一步研究的重點(diǎn)，而對(duì)其機(jī)制的進(jìn)一步揭示將有利于提高臨床上對(duì)OSCC 的治療效果。