袁曉龍，徐丹同，曹浩男，熊浩銘，曾檢華，陳子韜，張 哲，李加琪

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學(xué)與分子育種重點實驗室/國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510642；2.廣東省實驗動物重點實驗室/廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東 廣州 510663；3.廣東壹號食品股份有限公司，廣東 廣州 510620）

【研究意義】母豬初情期是指母豬第一次發(fā)情并排卵的過程，是母豬性成熟和獲得繁殖能力的標(biāo)志［1］。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，須挑選優(yōu)質(zhì)后備母豬更新母豬群、補充生產(chǎn)。初情期越早，母豬就能越早進(jìn)行配種和進(jìn)入繁殖服役年限，且表現(xiàn)出更高的繁殖性能［2-3］。雖然母豬初情期日齡是中等遺傳力的重要經(jīng)濟(jì)性狀，其遺傳改良必將提高豬場的經(jīng)濟(jì)效益，但其啟動的機(jī)制仍不清楚。本研究擬篩選影響母豬初情期啟動的候選基因，為母豬初情期日齡的遺傳改良提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】母豬初情期的啟動是在性腺軸（下丘腦-垂體-卵巢）的調(diào)控下完成的，即母豬第一次卵泡成熟時，由下丘腦分泌促性腺激素釋放激素刺激垂體分泌卵泡刺激素和促黃體素，卵巢在促性腺激素的作用下分泌睪酮、雌激素和孕激素，成熟卵泡進(jìn)行排卵，進(jìn)而啟動母豬的第一次發(fā)情并達(dá)到性成熟［4］。學(xué)者已嘗試通過多種方法篩選和鑒定影響母豬初情啟動的重要候選基因，例如Yang等［5］和Holl等［6］利用微衛(wèi)星技術(shù)初步鑒定了影響母豬初情期日齡的候選數(shù)量性狀基因座，李平華等［7］通過對白色杜洛克×二花臉雜交的F2代群體的母豬進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，初步篩選了LIN28B、TMEM38B、RAB23等影響初情期日齡的重要候選基因?！颈狙芯壳腥朦c】當(dāng)前已有一些研究篩選和鑒定了許多影響母豬初情期日齡的基因，但已有的候選基因不足以解析母豬初情期啟動的機(jī)制以及改良母豬的初情期日齡?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以杜洛克豬群體為研究對象，利用商業(yè)芯片和混合線性模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，篩選影響母豬初情期日齡的潛在分子標(biāo)記和候選基因，不僅為進(jìn)一步解析母豬的初情期啟動機(jī)制提供一定水平的理論依據(jù)，還能為母豬初情期啟動日齡的遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗收集了福建某國家核心種豬場共571頭杜洛克母豬的初情日齡、出生日期、產(chǎn)仔數(shù)和窩重等生產(chǎn)記錄。試驗個體健康，發(fā)育狀況良好，均采用半開放式欄舍飼養(yǎng)。所有豬只的日糧營養(yǎng)水平一致，自由飲水。

1.2 初情期日齡測定及方法

挑選該場160日齡左右杜洛克母豬進(jìn)行查情，每天9∶00和16∶00各觀察1次。根據(jù)母豬陰門檢查及壓背后的靜立反應(yīng)來判斷母豬發(fā)情狀況［8］，記錄初情期日齡。

1.3 基因組DNA提取及全基因組芯片分型

采集杜洛克母豬耳組織，使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit（Version 4.0）進(jìn)行基因組DNA抽提，并用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，采用NanoDrop 2000進(jìn)行質(zhì)量評估。合格的基因組DNA利用Illumina PorcineSNP60 BeadChip或GeneSeek GGP-Porcine Chip進(jìn)行全基因組芯片分型。兩款芯片所包含的SNP位點不同，共有的SNP位點被保留，并使用BEAGLE軟件［9］對缺失位點進(jìn)行填充。使用PLINK軟件［10］對SNP位點進(jìn)行質(zhì)量評估，剔除檢出率＜90%、次等位基因頻率＜1%以及顯著偏離哈迪-溫伯格平衡的位點，得到30 281個SNP位點用于后續(xù)研究。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析

本研究使用GEMMA軟件［11］構(gòu)建混合線性模型進(jìn)行GWAS分析，模型如下：

式中，Y為每個個體的初情期日齡表型；α是固定效應(yīng)，包括年份和季節(jié)；β為每一個SNP位點的替代效應(yīng)；μ為隨機(jī)效應(yīng)并符合μ～N（0,Gσμ2），其中G為基因組親緣關(guān)系矩陣；W、X和Z分別為α、β和μ的關(guān)聯(lián)矩陣；e為隨機(jī)殘差并符合e～N（0,Iσe2），其中 I為單位陣。

1.5 候選基因篩選和功能富集分析

本研究根據(jù)P值選擇最顯著的10個SNP位點，并將這些SNP位點上下游200 kb內(nèi)的基因篩選為潛在影響初情期日齡的基因，并對這些候選基因進(jìn)行生物學(xué)進(jìn)程Gene Ontology（GO）富集分析［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 初情期日齡的描述性統(tǒng)計

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，571頭杜洛克母豬的初情期日齡最早為173 d，最晚為291 d，平均為224 d。從圖1可見，杜洛克母豬的初情期日齡表型值符合正態(tài)分布（Shapiro-Wilk Test，W = 0.96737，P=4.509×10-10）。

圖1 杜洛克母豬初情期日齡Fig. 1 Age at puberty of Duroc sows

圖2 不同初情期日齡母豬的平均窩產(chǎn)仔數(shù)和平均初生窩重Fig. 2 Average litter size and average newborn litter weight of Duroc sows with different ages at puberty

2.2 初情期日齡與繁殖性能的關(guān)系

為探索杜洛克母豬初情期日齡與其繁殖性能的關(guān)系，分析了具有初情期日齡和繁殖記錄的433頭杜洛克母豬的數(shù)據(jù)。根據(jù)杜洛克母豬初情期日齡的分布，把杜洛克母豬分為3組，即初情期較早組（≤190 d）、初情期適中組（191～250 d）、初情期較晚組（≥251 d），并分別統(tǒng)計3組母豬1～4胎的平均窩產(chǎn)活仔數(shù)和平均初生窩重。如圖2所示，雖然各組間經(jīng)Student’st檢驗，P值并沒有達(dá)到顯著閾值，但初情期日齡較早的母豬的平均窩產(chǎn)仔數(shù)和平均初生窩重高于初情期適中和較晚組母豬；在第四胎時，初情期日齡較早的母豬的平均窩產(chǎn)仔數(shù)和平均初生窩重高于初情期適中組母豬，初情期日齡適中組的母豬的平均窩產(chǎn)仔數(shù)和平均初生窩重高于初情期較晚組的母豬。結(jié)果表明初情期越早的母豬可能表現(xiàn)出更高的窩產(chǎn)仔數(shù)和平均窩重。

2.3 全基因組關(guān)聯(lián)分析

通過全基因組關(guān)聯(lián)分析，未篩選到達(dá)到顯著閾值的SNP位點（P≤10-（0.05/30281），圖3）；繼續(xù)篩選P值最小的10個位點，發(fā)現(xiàn)這些位點主要分布在2、4、5、7、12號等染色體上（圖3，表1）。10個SNP位點上下游200 kb內(nèi)的基因包含ABCC8、BCAR3、NELL2、NSF等基因（表1），這些基因的主要功能是ATP binding、第二性征發(fā)育、激素分泌的調(diào)控等生物學(xué)進(jìn)程（表1）。

圖3 杜洛克母豬初情期日齡全基因組關(guān)聯(lián)分析Fig. 3 Genome-wide association analysis for age at puberty of Duroc sows

表1 前10個潛在SNP位點及其附近基因Table 1 Top 10 potential SNP and the related genes

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)571頭杜洛克母豬的初情期日齡服從正態(tài)分布（Shapiro-Wilk Test，P=4.509×10-10），并且平均初情期日齡為224 d。根據(jù)初情期日齡的早晚，把433頭杜洛克母豬分為3組，與初情期適中組和初情期較晚組相比，從,1～4胎初情期早的母豬具有較高的平均窩產(chǎn)仔數(shù)和平均初生窩重；初情期早的母豬的第四胎的平均窩產(chǎn)仔數(shù)和平均初生窩重高于初情期適中的母豬，而初情期適中母豬的平均窩產(chǎn)仔數(shù)和平均初生窩重高于初情期較晚的母豬。盡管各組間的差異沒有達(dá)到統(tǒng)計顯著水平，但這些結(jié)果表明，初情期早的母豬可能具有相對高的繁殖性能，這與郭紅洲等［13］對大白母豬的研究結(jié)果一致。

利用全基因組芯片數(shù)據(jù)，本研究對571頭杜洛克母豬初情期日齡進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，初步篩選了ABCC8、BCAR3、NELL2和NSF等基因。其中，ABCC8是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)錄蛋白超家族的成員之一［14］。前人研究表明，該基因編碼的蛋白具有調(diào)節(jié)ATP敏感性鉀離子通道和胰島素分泌的作用，當(dāng)ABCC8基因突變，會導(dǎo)致青少年出現(xiàn)肥胖癥狀和性早熟［15］。同時，ABCC8基因與胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤發(fā)生相關(guān)［15-16］。BCAR3是編碼細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)之一，該基因與雌激素異常導(dǎo)致的疾病顯著相關(guān)，比如抗性、乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥［17-18］。BCAR3基因可以調(diào)控乳腺癌細(xì)胞不再依賴雌激素而大量增殖，同時，BCAR3的高表達(dá)量可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥患者的局部間質(zhì)細(xì)胞遷移和侵襲，促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生［19］。NELL2編碼的蛋白是一類糖蛋白，在神經(jīng)細(xì)胞的生長、分化以及腫瘤的發(fā)生中起重要作用，與生物體內(nèi)鈣離子、蛋白質(zhì)和肝素結(jié)合均具有緊密聯(lián)系［20］。研究表明，NELL2基因可調(diào)控促性腺激素釋放激素的分泌，從而調(diào)節(jié)雌性大鼠的初情期啟動［21］。NSF編碼的蛋白是一類與神經(jīng)元疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，參與囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運［22-23］。

本研究沒有直接鑒定出顯著影響母豬初情期日齡的分子標(biāo)記，可能是由于該性狀是復(fù)雜性狀、群體不夠大、SNP芯片密度低造成的，在后續(xù)研究中需繼續(xù)擴(kuò)大群體和提高SNP密度。本研究篩選的潛在SNP位點附近基因的功能富集在類胰島素生長因子與調(diào)控激素分泌的信號通路上，這些信號通路是影響母豬初情期日齡的重要信號通路。本研究結(jié)果表明，這些候選基因可能影響母豬的初情期日齡，但需要進(jìn)一步驗證。

4 結(jié)論

杜洛克母豬的初情期日齡平均為224 d，初情期越早的母豬可能具有越高的繁殖性能；基于全基因組SNP芯片數(shù)據(jù)和全基因組關(guān)聯(lián)分析，篩選到ABCC8、BCAR3、NELL2和NSF等可能影響杜洛克母豬初情期日齡的重要基因，這些基因顯著富集在類胰島素生長因子與調(diào)控激素分泌的信號通路上。本研究結(jié)果不僅為解析母豬初情期啟動的遺傳機(jī)制提供參考，還為母豬初情期日齡的遺傳改良提供一定的理論基礎(chǔ)。