楊雷亮，管 維，孫麗霞，吳穎兒，單振菊，王章根，陳定虎

（1. 中山海關(guān)技術(shù)中心，廣東 中山 528403; 2. 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400）

【研究意義】香蕉為芭蕉科芭蕉屬植物，全年可收獲，是熱帶地區(qū)的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，也是世界鮮果貿(mào)易量最大的水果。香蕉細(xì)菌性枯萎病是由青枯菌Ralstonia solanacearum2號小種侵染香蕉所引起的毀滅性土傳真菌病害，是香蕉生產(chǎn)中危害最嚴(yán)重的病害之一［1-3］。由于該病防治困難，因此對該病菌的分子生物學(xué)早期檢測在生產(chǎn)上的意義重大，一種快速簡便、準(zhǔn)確靈敏的檢驗(yàn)檢疫方法自然是目前迫切被需要。【前人研究進(jìn)展】目前檢測鑒定該病菌的方法主要包括形態(tài)鑒定、生理生化型鑒定，分子生物學(xué)鑒定。分子生物學(xué)鑒定分為PCR法、熒光PCR法和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法等；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Loop-meadiated isothermal amplification, LAMP）技術(shù)是指利用2對針對目標(biāo)基因設(shè)計(jì)特異性引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，恒溫條件下高效擴(kuò)增基因的新技術(shù)［4-9］。目前，LAMP技術(shù)在檢測細(xì)菌［10-18］、動植物病毒［19-22］、寄生蟲［23］，真菌［24-26］、轉(zhuǎn)基因食品［27-28］、食物源成分［29-30］、生物工程［31］等領(lǐng)域均有應(yīng)用，發(fā)展前景非常樂觀。針對香蕉真菌性枯萎病菌已有熒光PCR檢測方法［32］和LAMP檢測方法［33］的報(bào)道，而對香蕉細(xì)菌性枯萎病的定性檢測，我國學(xué)者還是圍繞在如何讓該病病原菌目標(biāo)基因成功擴(kuò)增或者對其特異性基因信號進(jìn)行放大開展研究工作。漆艷香等根據(jù)香蕉細(xì)菌性枯萎病菌16SrDNA的保守區(qū)序列，在基因擴(kuò)增片段區(qū)間應(yīng)用引物和探針設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光PCR引物，再在引物對基因的擴(kuò)增區(qū)間內(nèi)找出具有穩(wěn)定性的點(diǎn)突變區(qū)設(shè)計(jì)特異性探針，建立了對香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法［34］。王念武等根據(jù)該菌的特異插入序列ISRso19設(shè)計(jì)了滾環(huán)擴(kuò)增的鎖式探針，并對超分支滾環(huán)擴(kuò)增的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了靈敏度極高的香蕉細(xì)菌性枯萎病菌超分支滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)。該檢測技術(shù)能從相似的9種病原菌中特異性地檢測出香蕉細(xì)菌性枯萎病菌，對DNA的檢測的最低濃度為500 fg/μL，遠(yuǎn)高于普通PCR的靈敏度［35］。目前未見關(guān)于LAMP檢測應(yīng)用于香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)是使用實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增裝置實(shí)時(shí)監(jiān)測LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行分析的方法，該方法比普通LAMP方法更為靈敏可靠，采用了不必在反應(yīng)完開蓋檢測的方法，使反應(yīng)產(chǎn)物不易被污染。早期檢測中需要解決樣品所含低含量及重干擾病菌組織的難題，而實(shí)時(shí)熒光LAMP能比較好地解決這一問題。【擬解決的關(guān)鍵問題】本實(shí)驗(yàn)擬建立該病菌的熒光LAMP檢測體系，設(shè)計(jì)香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的LAMP引物；以DNA為模板，在不同屬內(nèi)及其近似種間進(jìn)行引物的特異性、靈敏度和重復(fù)性驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試病原菌 香蕉細(xì)菌性枯萎病菌Ralstonia solanacearum（race 2），RS2；煙草青枯病菌R. solanacearum（race 1），RS1；馬鈴薯青枯病菌R. solanacearum（race 3），RS3；丁香假單胞菌Pseudomonus syranguepv.syingae，PSS；苜蓿萎蔫病菌Clavibacter michiganensissubsp.insidiosus，CMI；玉米細(xì)菌性枯萎病菌Pantoea stewartiisubsp.stewartii，PS；梨火疫病菌Erwinia amylovora，EA；菜豆枯萎病菌Curtobacterium flaccumfacienspv.flaccumfaciens，CF，由中國檢科院植檢所趙文軍研究員惠贈。

1.1.2 擴(kuò)增儀器和試劑 擴(kuò)增儀器采用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，試劑盒采用廣州迪奧生物科技有限公司DNA擴(kuò)增試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增法）。

1.1.3 引物合成 選擇香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的特異插入序列ISRso19序列，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，使用PrimerExplorerV5在線設(shè)計(jì)外引物RS2-F3-2、RS2-B3-2， 內(nèi) 引 物 RS2-FIP-2、RS2-BIP-2，其序列見表1，由廣州生工生物技術(shù)工程股份有限公司合成。

表1 LAMP引物序列Table 1 Sequence of primers for LAMP

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取和濃度測量 所得菌種經(jīng)濃度梯度劃線分離、純化后接種到NA平板上，800 mL裂解液中挑取細(xì)菌群落總數(shù)10個(gè)，進(jìn)行DNA提取，定容至100 μL，即定容至100 CFU/mL。DNA提取采用Wizard Genomic DNA Purification Kit（Promega Corporation, Madison , WI ,USA），提取前用液氮充分研磨，提取后用Nano Drop1000型核酸微量測定儀（Thermo Fisher Scientific Inc.Waltham，MA，USA）測定核酸濃度。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光LAMP對RS2及其近似種特異性評價(jià) 反應(yīng)擴(kuò)增體系為：總量25 μL，含有DNA 2 μL，2×RM 反應(yīng)母液 12.5 μL，5 μmol/L F3 引物1 μL，5 μmol/L B3 引物 1 μL，10 μmol/L FIP 引物1 μL，10 μmol/L BIP 引 物 1 μL，8 U/μL BstDNA酶 1 μL，熒光染料 0.5 μL，最后加入 20 μL 密封液。擴(kuò)增參數(shù)為 63 ℃30 s、63 ℃ 15 s、63 ℃ 45 s，熒光收集階段設(shè)置為60個(gè)循環(huán)。將8種待測菌種DNA分別配制反應(yīng)體系溶液，同時(shí)設(shè)置陰性對照CK1～CK3與空白對照CK4，采用相同參數(shù)進(jìn)行上機(jī)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光LAMP對不同濃度RS2靈敏度評價(jià) 樣品DNA濃度梯度：將濃度為1 CFU/mL的RS2 DNA提取液按照10倍比依次系列稀釋到10-7倍。將不同濃度DNA分別構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光LAMP反應(yīng)體系，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)，并設(shè)置陰性對照。反應(yīng)體系組成與參數(shù)不變，利用ABI 7500型熒光定量PCR儀的自帶軟件進(jìn)行結(jié)果分析，自動生成擴(kuò)增曲線，根據(jù)所得曲線判斷檢測的陰陽性。若有“S”型擴(kuò)增曲線，則檢測結(jié)果判斷為陽性（有核酸擴(kuò)增）；若無“S”型擴(kuò)增曲線，結(jié)果則判斷為陰性（無核酸擴(kuò)增）。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光LAMP對RS2重復(fù)性評價(jià) 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)采用的DNA模板濃度為1 CFU/mL，每個(gè)反應(yīng)體系的模板DNA加入量均為2 μL，重復(fù)組數(shù)設(shè)置為4個(gè)，設(shè)置陰性對照與空白對照。實(shí)驗(yàn)采用同一批模板DNA，每個(gè)處理3次重復(fù)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光LAMP對RS2及其近似種特異性檢測結(jié)果Fig. 1 Results of specificity of real-time fluorescence LAMP detection to RS2 and allied species

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光LAMP對RS2及其近似種特異性評價(jià)

實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測結(jié)果（圖1）表明，1號樣品（RS2）出現(xiàn)明顯擴(kuò)增信號且曲線平滑，其余樣品均未出現(xiàn)擴(kuò)增信號。故特異性實(shí)驗(yàn)證明熒光LAMP體系能夠明顯區(qū)分RS2與RS1、RS3、PSS、CMI、PS、EA、CF等近似種，并證明所選的靶基因與所設(shè)計(jì)的引物適配與香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的定性檢測實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)時(shí)熒光LAMP對不同濃度RS2靈敏度評價(jià)

目標(biāo)菌株（RS2）DNA系列濃度的熒光LAMP結(jié)果（圖2）表明，RS2菌株DNA在1、10-1、10-2CFU/mL 3個(gè)稀釋濃度都得到陽性結(jié)果，而10-3到10-7的稀釋濃度得到的是陰性結(jié)果的線條，故實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測RS2的DNA靈敏度可達(dá)10-2稀釋度，即濃度為0.01 CFU/mL。經(jīng)核酸微量測定儀的測定，所提RS2菌株DNA原液濃度為 70.2 ng/μL，10-2稀釋濃度為 0.702 ng/μL。

圖2 實(shí)時(shí)熒光LAMP對不同濃度RS2菌DNA靈敏度檢測結(jié)果Fig. 2 Results of sensitivity of real-time fluorescence LAMP detection to DNA of RS2 with different concentrations

圖3 實(shí)時(shí)熒光LAMP對RS2重復(fù)性檢測結(jié)果Fig. 3 Results of repeatability of real-time fluorescent LAMP detection to RS2

2.3 實(shí)時(shí)熒光LAMP對RS2重復(fù)性評價(jià)

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，除陰性對照與空白對照外，樣品組4個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)體系的檢測結(jié)果都能出現(xiàn)“S”型曲線，說明本實(shí)驗(yàn)所建立的方法對RS2的DNA檢測具有較高的重復(fù)性，結(jié)果穩(wěn)定性好，實(shí)驗(yàn)方法可靠。

3 討論

關(guān)于香蕉細(xì)菌性枯萎病菌的LAMP檢測并未見報(bào)道，而LAMP方法作為一種新的快速檢測手段在檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，近幾年來出現(xiàn)了井噴式的態(tài)勢，并且陸續(xù)有一大批關(guān)于LAMP方法的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布。同樣是在香蕉病原菌檢測上，由真菌古巴尖胞鐮刀菌引起的真菌性枯萎病，已經(jīng)有LAMP檢測的報(bào)道［33,36］。而實(shí)時(shí)熒光LAMP是在LAMP檢測的基礎(chǔ)上使用熒光信號檢測儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)采集，免除了電泳過程，所使用的信號采集有濁度儀和實(shí)時(shí)熒光PCR儀等［37］，其所使用的檢測引物和普通LAMP檢測使用的引物相同。本研究所設(shè)計(jì)的LAMP引物同樣適用于普通LAMP檢測，可以不使用大型的檢測設(shè)備，而僅使用水浴鍋和顏色終點(diǎn)判斷進(jìn)行野外快速初篩。但由于考慮到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)LAMP檢測如果開蓋電泳容易產(chǎn)生氣溶膠污染，因氣溶膠污染而導(dǎo)致的假陽性問題一直能夠持續(xù)幾周乃至幾個(gè)月，屬于實(shí)驗(yàn)室污染的重要事故，故而采用不必開蓋的實(shí)時(shí)熒光LAMP方法，且同樣該檢測體系也可用濁度儀等設(shè)備進(jìn)行檢測信號采集。

本試驗(yàn)在開展特異性LAMP引物篩選時(shí)，嘗試選用RS2的16SrDNA保守區(qū)序列作為目標(biāo)序列進(jìn)行引物的篩選設(shè)計(jì)，但經(jīng)過多次嘗試，所設(shè)引物并不能對RS2進(jìn)行特異性區(qū)分，而且能擴(kuò)增出所有的青枯菌。由此可以分析確證該菌命名時(shí)是先歸類到青枯菌類，后劃分至茄科勞爾氏菌，這一認(rèn)知過程是基于該菌生理生化特征，并體現(xiàn)于其基因組序列。在細(xì)菌的分子生物學(xué)檢測方法中，常用細(xì)菌16SrDNA保守區(qū)的堿基序列來設(shè)計(jì)引物，從而進(jìn)行細(xì)菌種類的相關(guān)檢測與鑒定。16SrDNA保守區(qū)使用于種間差別比較大的細(xì)菌間的區(qū)分，但對于香蕉性枯萎病菌來說，其相似的race型有5種，相似種及其相似race型的16SrDNA堿基序列幾乎完全相同，故不能用作引物設(shè)計(jì)。

本試驗(yàn)在評價(jià)檢測方法靈敏度時(shí)，采用目標(biāo)病菌DNA為標(biāo)準(zhǔn)樣品，并設(shè)置梯度稀釋度進(jìn)行分析。相比于王念武等［35］采用病菌的質(zhì)粒DNA進(jìn)行HRCA實(shí)驗(yàn)，采用破裂菌體所提的DNA在檢測中受到其他物質(zhì)的干擾會比較多，DNA的純度一定程度上影響檢測實(shí)驗(yàn)的靈敏度。從試驗(yàn)結(jié)果來看，本試驗(yàn)的靈敏度測試可達(dá)0.01 CFU/mL，經(jīng)核酸含量測定儀測試為 702 pg/μL，而漆艷香等［34］采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測靈敏度為24.6 fg/μL，超分支滾環(huán)擴(kuò)增更是能達(dá)500 fg/μL。故熒光LAMP法并不是最靈敏的檢測方法，但其高效、穩(wěn)定與不易污染的特點(diǎn)非常適用于青枯菌生理小種的定性檢測，相比于傳統(tǒng)LAMP與普通PCR還是具備一定優(yōu)勢。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，采用一系列稀釋度的DNA檢測靈敏度時(shí)，就其結(jié)果判斷時(shí)，肉眼判斷往往存在模棱兩可的情況，尤其是在條帶模糊不清的情況之下，而儀器判斷就在此時(shí)顯示了良好的分辨率和區(qū)分效果，熒光LAMP檢測的靈敏度優(yōu)于普通LAMP方法，與其他研究者的觀點(diǎn)一致［12,38］。另外，本試驗(yàn)建立的方法可能并不是最靈敏的檢測方法，但卻更為穩(wěn)定，不易污染；相比于傳統(tǒng)LAMP方法和接種鑒定生理小種方法更為靈敏和高效。另外，在進(jìn)行靈敏度測試時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同濃度的模板檢測結(jié)果顯示“S”型曲線到達(dá)平臺期的高度不同，說明最終的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物積累量不同，擴(kuò)增的效率有所不同，可能是擴(kuò)增體系中初始量的極其細(xì)微差別造成的。初始極其細(xì)微的差別在經(jīng)過LAMP擴(kuò)增后所導(dǎo)致產(chǎn)物積累量的差別應(yīng)當(dāng)是逐步拉大的，且與出現(xiàn)平臺期的早晚有直接關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究使用了LAMP檢測方法，該方法在香蕉細(xì)菌性枯萎病菌檢測上尚未見報(bào)道。同時(shí)又結(jié)合實(shí)時(shí)熒光設(shè)備及技術(shù)，具有對目標(biāo)序列的高特異性、重復(fù)性比較好的優(yōu)點(diǎn)，較普通LAMP具有更高的靈敏度和更短的檢測時(shí)間。采用實(shí)時(shí)熒光LAMP進(jìn)行植物病原真菌的定性檢測，具有比普通定性方法更靈敏且有效避免氣溶膠污染的特點(diǎn)。這種LAMP進(jìn)行定性檢測方法在檢測實(shí)踐中應(yīng)用廣泛，在香蕉細(xì)菌性枯萎病菌初篩檢測中的應(yīng)用也發(fā)揮了該方法的優(yōu)點(diǎn)，比普通PCR相比節(jié)約了檢測成本，提高了檢測效率。

本研究不足之處在于驗(yàn)證特異性的生理小種、?；筒粔蜇S富，尤其對毆文氏菌屬和黃單胞菌屬等雖然經(jīng)過網(wǎng)上序列比對，但若能夠充分驗(yàn)證將會更好。