沙 航，羅相忠，鄒桂偉，梁宏偉

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

鳙(Aristichthysnobilis)俗稱花鰱，是我國(guó)重要的大宗淡水養(yǎng)殖魚(yú)類之一。2018年全國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)309.64萬(wàn)噸，僅次于草魚(yú)和鰱[1]。隨著水利設(shè)施的興建，洄游通道和產(chǎn)卵場(chǎng)被破壞，鳙的自然群體遭受到了極大沖擊，種群群體數(shù)量急劇下降，成為長(zhǎng)江主要魚(yú)類中數(shù)量減少最顯著的種類之一[2]。與此同時(shí)，人工養(yǎng)殖個(gè)體逃逸以及遺傳資源管理的不科學(xué)也對(duì)自然群體遺傳多樣性造成一定的擾動(dòng)[3,4]。為了恢復(fù)長(zhǎng)江水生生物多樣性和漁業(yè)資源，近年來(lái)開(kāi)展了大規(guī)模的增殖放流，鳙等四大家魚(yú)親本放流工作也取得了良好的效果[5]?？蒲泄ぷ髡呦群罄猛っ?、RAPD、線粒體DNA和微衛(wèi)星等技術(shù)對(duì)長(zhǎng)江鳙群體的遺傳多樣性進(jìn)行了分析，長(zhǎng)江中下游鳙具有豐富的遺傳多樣性[6]，人工繁殖群體的遺傳多樣性明顯低于自然群體[7]，而放流群體與天然群體的遺傳多樣性相差不大[8]。長(zhǎng)江中游江段及其一級(jí)支流是鳙重要的自然產(chǎn)卵場(chǎng)，是維持長(zhǎng)江中游鳙種質(zhì)資源的重要場(chǎng)所，持續(xù)長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)長(zhǎng)江中游鳙自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性，對(duì)評(píng)估長(zhǎng)江中游鳙種質(zhì)資源現(xiàn)狀以及制定科學(xué)的增殖放流漁業(yè)管理措施具有重要意義。本研究采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)長(zhǎng)江水系中游的3個(gè)鳙群體的遺傳本底進(jìn)行分析，以期為今后保護(hù)和合理利用種質(zhì)資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源與基因組DNA提取

3個(gè)鳙群體于2018年5月分別采自石首老河國(guó)家四大家魚(yú)原種場(chǎng)(石首，SS)，監(jiān)利老江河國(guó)家四大家魚(yú)原種場(chǎng)(監(jiān)利，JL)和湖南魚(yú)類原種場(chǎng)(長(zhǎng)沙，CS)，石首和監(jiān)利原種場(chǎng)采集的鳙樣本均為繁殖季節(jié)在長(zhǎng)江采集的幼苗經(jīng)原種場(chǎng)培育而成的1齡鳙，湖南魚(yú)類原種場(chǎng)的鳙采自湘江。每個(gè)群體隨機(jī)采集30尾個(gè)體，共90尾。鰭條經(jīng)無(wú)水乙醇固定后置于-20 ℃保存。取0.2 g鰭條組織經(jīng)無(wú)菌水漂洗后置于2 mL離心管烘干剪碎，用高鹽法提取基因組DNA[9]，經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)后，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微衛(wèi)星引物及PCR擴(kuò)增檢測(cè)

采用本課題組自行開(kāi)發(fā)的12對(duì)微衛(wèi)星引物，并用Fam熒光基團(tuán)修飾上游引物的5′端(表1)，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL，包含2×Taq PCR Mix 12.5 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，50 ng/μL模板DNA 1 μL，dd H2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 15 s，53～57 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在ABI Prism3730 XI 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，采用DataCollection 軟件和GeneMarker V2.2.0軟件采集和分析數(shù)據(jù)并輸出等位基因掃描圖譜，然后分析各個(gè)位點(diǎn)的基因型。

表1 鳙12對(duì)微衛(wèi)星引物信息Tab.1 Primers information of 12 microsatellite markers of A.nobilis

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Popgene32軟件分析各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在3個(gè)鳙群體的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(observed heterozygosity)、期望雜合度(He)、Shannon信息指數(shù)(I)，并計(jì)算群體間的Nei′s遺傳距離。Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)(D)按以下公式計(jì)算：D=(Ho-He)/He?；谌后w間的Nei′s遺傳距離用MEGA X軟件繪制NJ聚類圖。用Arlequin3.1軟件計(jì)算兩兩群體間的遺傳分化指數(shù)(Fst)，采用分子方差分析(AMOVA)計(jì)算群體的遺傳結(jié)構(gòu)，通過(guò)1 000次模擬重復(fù)抽樣檢測(cè)群體間Fst值的顯著性[10]。用Cervus3.2軟件計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)。

2 結(jié)果分析

2.1 微衛(wèi)星位點(diǎn)的多態(tài)性

12對(duì)微衛(wèi)星引物在SS、JL和CS 3個(gè)群體中共檢測(cè)到117個(gè)等位基因，3個(gè)群體中Na介于5～19，Ne為1.731～11.567，平均Na和Ne分別為9.750和4.050(見(jiàn)表2)。其中Ans055和Ans196位點(diǎn)Na最多(19個(gè))，Ans014和Ans119位點(diǎn)Na最少(5個(gè))。12個(gè)位點(diǎn)Ho為0.398～0.778，He為0.425～0.919，其中11個(gè)位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡(D<0)。I為0.782～2.588。PIC為0.371～0.907，平均PIC為0.618。12個(gè)位點(diǎn)中有8個(gè)位點(diǎn)為高度多態(tài)位點(diǎn)(PIC>0.5)，4個(gè)位點(diǎn)為中度多態(tài)位點(diǎn)(0.25

表2 鳙12個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性Tab.2 Genetic diversity of 12 microsatellite loci in A.nobilis

2.2 鳙3個(gè)群體的遺傳多樣性

石首、監(jiān)利和長(zhǎng)沙 3個(gè)鳙群體遺傳多樣性見(jiàn)表3。3個(gè)群體平均Na介于5.500～8.500，平均Ne為3.294～4.244，平均Ho和平均He分別介于0.557～0.582和0.620～0.730，其中長(zhǎng)沙群體的平均Ne、平均He和I均最高。從PIC上看，長(zhǎng)沙群體的遺傳多樣性最高，而石首群體的遺傳多樣性相對(duì)較低，整體上3個(gè)群體的PIC較高(PIC>0.5)，遺傳多樣性較豐富。

表3 鳙3個(gè)群體的遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversity among the three populations of A.nobilis

2.3 鳙3個(gè)群體間的遺傳分化

3個(gè)鳙群體間的Nei′s遺傳距離和遺傳分化指數(shù)見(jiàn)表4。3個(gè)群體間的遺傳距離為0.031 9～0.076 6，監(jiān)利與長(zhǎng)沙群體遺傳距離最大(0.076 6)，石首和監(jiān)利群體間的遺傳距離最小(0.031 9)。群體間遺傳分化指數(shù)為0.002 5～0.023 7，其中石首、監(jiān)利和長(zhǎng)沙3個(gè)群體兩兩之間的遺傳分化指數(shù)均小于0.05，三個(gè)群體之間遺傳分化程度較低?；谌后w間Nei′s遺傳距離的NJ聚類結(jié)果如圖1所示，石首和監(jiān)利群體先聚為一支，然后與長(zhǎng)沙群體聚為一支。AMOVA分析顯示(表5)3個(gè)群體中群體內(nèi)的遺傳變異占總體變異的95.60%，群體間的遺傳變異為4.40%，3個(gè)群體間遺傳分化指數(shù)為0.044(Fst<0.05)，表明群體間的遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)的個(gè)體之間。

表4 鳙3個(gè)群體間的遺傳距離(對(duì)角線下)和遺傳分化指數(shù)(對(duì)角線上)Tab.4 The genetic distance (below diagonal) and genetic differentiation indices (above diagonal) among the three populations of A.nobilis

圖1 基于遺傳距離構(gòu)建的3個(gè)鳙群體的NJ聚類樹(shù)Fig.1 NJ clustering tree of tht three populations of A.nobilisbased on Nei′s genetic distance

表5 鳙3個(gè)群體的AMOVA分析Tab.5 AMOVA analysis among the three populations of A.nobilis

3 討論

3.1 鳙群體的遺傳多樣性

群體的遺傳多樣性和遺傳潛力可以用等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)來(lái)衡量[11]。雜合度是反映群體遺傳變異程度的重要參數(shù)，雜合度越大遺傳多樣性越高[12]。本研究中的SS(He=0.633)、JL(He=0.651)和CS(0.730)3個(gè)群體的雜合度均高于朱曉東[13](石首， He=0.287 6；監(jiān)利，He=0.321 4)和田華[14](監(jiān)利，He=0.550 2)的研究結(jié)果，與朱傳坤[15]的研究結(jié)果較為接近(石首老河，He=0.661)。長(zhǎng)沙群體的多態(tài)信息含量(0.606)高于單淇[16]的研究結(jié)果(0.557)，而雜合度略低?；贐otstein[17]的群體遺傳多樣性判別標(biāo)準(zhǔn)，本研究的3個(gè)群體的遺傳多樣性均較高(PIC>0.5)。目前長(zhǎng)江中游3個(gè)群體的遺傳多樣性仍保持在較高水平。遺傳多樣性與群體的大小呈一定的正相關(guān)。鳙的自然群體中以長(zhǎng)江群體數(shù)量最大，基因庫(kù)最豐富[18]。雖然其經(jīng)歷高強(qiáng)度捕撈、產(chǎn)卵場(chǎng)破壞、棲息環(huán)境惡化等，但近十年來(lái)隨著國(guó)家和地方對(duì)漁業(yè)資源的保護(hù)，鳙的增殖放流活動(dòng)持續(xù)開(kāi)展，其遺傳多樣性并未發(fā)生持續(xù)性下降。

本研究中石首、監(jiān)利和長(zhǎng)沙3個(gè)群體大多數(shù)位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子缺失(D<0)。耿波等[19]在對(duì)鳙的四川和江西群體研究中也發(fā)現(xiàn)存在雜合子缺失現(xiàn)象。關(guān)于雜合子缺失的形成原因目前仍存在爭(zhēng)議，可能與研究群體樣本量、種群退化、性別比例失衡和無(wú)效等位基因有關(guān)[20,21]，就本研究而言可能是由于分析的樣本數(shù)量較少或位點(diǎn)上存在無(wú)效等位基因?qū)е?。傅洪拓等[22]對(duì)長(zhǎng)江不同江段日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)的研究中發(fā)現(xiàn)，日本沼蝦82.5%的群體位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子缺失，推斷其主要是無(wú)效等位基因?qū)е碌摹Ｔ谇嗍唪~(yú)(Epinephelusawoara)[23]、大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[24]和擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)[25]等微衛(wèi)星分析中也存在由無(wú)效等位基因?qū)е碌碾s合子缺失現(xiàn)象。

3.2 鳙3個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)

遺傳距離是衡量群體間遺傳分化的重要指標(biāo)，群體間遺傳距離越小，遺傳分化程度越低，群體間親緣關(guān)系越近[26]。固定指數(shù)(Fst)通常被用來(lái)衡量群體間的遺傳分化程度，F(xiàn)st<0.05時(shí)，群體間遺傳分化較??；0.050.25時(shí)，群體間則遺傳分化顯著[27]。石首、監(jiān)利和長(zhǎng)沙3個(gè)鳙群體之間的Fst均小于0.05，三個(gè)群體間的遺傳分化較小，鳙群體遺傳變異主要來(lái)自群體內(nèi)，群體內(nèi)的變異貢獻(xiàn)率為95.60%，群體間的遺傳變異僅占4.40%，長(zhǎng)江干流群體與長(zhǎng)沙群體雖然存在一定的遺傳分化，但變異主要來(lái)自群體內(nèi)，與長(zhǎng)沙群體存在一定的基因交流。李思發(fā)等[28]認(rèn)為長(zhǎng)江中下游群體間存在遺傳差異，但群體分布沒(méi)有地域性。單淇[16]對(duì)瑞昌、長(zhǎng)沙和寧河三個(gè)鳙群體進(jìn)行了分析，認(rèn)為湘江鳙和長(zhǎng)江干流鳙群體產(chǎn)卵場(chǎng)可能不同，存在一定的生殖隔離，而廖小林等[29]在草魚(yú)上卻發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)江干流草魚(yú)群體與湘江草魚(yú)僅存在輕微分化，可以認(rèn)為屬于一個(gè)長(zhǎng)江群體。湘江是長(zhǎng)江一級(jí)支流，于濠河口注入東洞庭湖，然后沿東洞庭湖湘江洪道經(jīng)岳陽(yáng)至城陵磯注入長(zhǎng)江[30]。盡管湘江和長(zhǎng)江干流存在不同產(chǎn)卵場(chǎng)，但湘江洞庭湖與長(zhǎng)江干流并沒(méi)有明顯的地理阻隔，群體間存在基因交流的可能性，此外，長(zhǎng)江中游大規(guī)模的增殖放流活動(dòng)在一定程度上也可能弱化了江河阻隔，目前已有研究開(kāi)始對(duì)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類開(kāi)展標(biāo)記放流，通過(guò)標(biāo)記回捕評(píng)價(jià)放流效果[31]，長(zhǎng)期放流對(duì)野生群體遺傳漸滲及累加效應(yīng)也在評(píng)估之中。就目前而言，長(zhǎng)江中游三個(gè)群體具有較高的遺傳多樣性，長(zhǎng)江干流群體與長(zhǎng)沙群體間的遺傳分化較小，鳙放流群體的親本應(yīng)盡可能來(lái)自長(zhǎng)江自然群體，放流親本群體應(yīng)來(lái)自放流江段，避免長(zhǎng)江鳙遺傳多樣性的降低及地理群體界限的混淆帶來(lái)的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。