姜放軍，陶抵輝

（湖南生物機電職業(yè)技術學院，湖南長沙410127）

三葉木通（Akebia trifoliate）為落葉木質藤本，在湖南省主要分布于湘西武陵山和雪峰山地區(qū)及湘東羅霄山脈地區(qū)，湘中、湘南、湘北也有少數分布[1]。三葉木通具有美容養(yǎng)顏、保健、清理體內垃圾、提高免疫力等奇特功效[2]，是一種潛力很大的保健水果。三葉木通果實目前以野生果為主，因其國內外市場蘊含著巨大潛力，野生果的產量在當地已供不應求。在農業(yè)產業(yè)結構調整和構建和諧社會的省情下，結合農業(yè)可持續(xù)發(fā)展，三葉木通作為一項高效農業(yè)種植項目將受到社會關注。

三葉木通長期野生尚未開發(fā)的主要原因是籽多、皮厚、鮮食率低。已有研究資料表明，野生三葉木通為二倍體，染色體數是16[3]。三倍體無籽西瓜的成功研究[4]和生產上大面積推廣應用具有示范作用。野生三葉木通若用人工加倍的方法育成三倍體植株，籽多、皮厚、鮮食率低的缺陷能有很大程度上的改進，從而提高商品質量。該試驗旨在以三葉木通帶芽莖段為外植體，構建三葉木通離體快繁體系，再用秋水仙素溶液對增殖芽誘導，獲得多倍體材料，為三葉木通的種質創(chuàng)新及三倍體三葉木通品種的選育奠定基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料三葉木通采自湖南生物機電職業(yè)技術學院藤本植物資源圃。選取當年生健壯無病蟲害、半木質化的三葉木通莖段，現采現用。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體處理與消毒。將采集的莖段去除葉片后，先用適量的洗潔精水浸泡5 min，再用自來水流水沖洗20 min。材料瀝干自來水后置于超凈工作臺中，然后用75%酒精消毒 30 s，無菌水沖洗 1 次，0.1% HgCl2消毒 10 min，無菌水沖洗5 次，瀝干水備用。將消毒好的莖段分割成1.0～1.5 cm長的單芽莖段接種到培養(yǎng)基（添加蔗糖30 g/L、瓊脂7.5 g/L，pH 5.8～6.0，下同）中。

1.2.2 腋芽誘導培養(yǎng)。選用WPM 和MS 基本培養(yǎng)基，并分別添加 2.0 mg/L 6-BA，0.2 mg/L NAA，2.0 mg/L GA3。每個培養(yǎng)瓶接種3 個外植體，培養(yǎng)基配方每個組合接種10個培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計腋芽誘導情況，篩選出適宜的培養(yǎng)基。

最適基本培養(yǎng)基確定好后，將消毒的單芽莖段接種在含 6-BA（0、1.0、2.0 mg/L）、NAA（0、0.1、0.5 mg/L）和 GA3（0、1.0、2.0 mg/L）的 WPM 培養(yǎng)基中進行腋芽誘導，1 000 lx光照條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d 后統(tǒng)計腋芽誘導率，每個處理接種30 個培養(yǎng)瓶，每個培養(yǎng)瓶接種3 個外植體。腋芽誘導率＝（萌芽的外植體數/接種外植體總數）×100%。

1.2.3 繼代增殖培養(yǎng)。將初代培養(yǎng)的腋芽切下后轉接到含 6-BA（0、1.0、2.0、3.0 mg/L）、NAA（0、0.2 mg/L）的 WPM培養(yǎng)基中，每個處理接種30 個培養(yǎng)瓶，每瓶接種2 個不定芽，溫度（25±2）℃，1 000 lx 光照條件下培養(yǎng)，40 d 后統(tǒng)計增殖系數。増殖系數＝增殖后獲得的芽數／接種時的芽數。

1.2.4 生根培養(yǎng)。待叢生芽長到2～3 cm 時，切取生長健壯的芽苗接種在 1/2 MS 含 NAA（0、1.0、2.0 mg/L）、GA3（0、1.0 mg/L）的培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，每個處理接種30個培養(yǎng)瓶，每瓶接種2 個芽，25 d 后統(tǒng)計生根率。生根率＝（生根的芽總數/接種芽總數）×100%。

1.2.5 多倍體誘導及鑒定。將生長良好的幼嫩叢生芽接入抽濾滅菌的秋水仙素溶液（0.1%、0.3%、0.5%）中，搖床振蕩培養(yǎng)（12、24、48 h），搖床轉速為 50 r/min，培養(yǎng)溫度為25℃，光照（1 000 lx）24 h/d，處理后用無菌水清洗藥液，然后接種到最佳增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)條件同上。

鑒定方法采用染色體計數方法，取叢生芽→預處理（對二氯苯+α-溴萘飽和溶液）5～6 h→固定（甲醇∶冰醋酸＝3∶1）2 h 以上→70%酒精保存→去離子水清洗→解離（1 mol/L 鹽酸，在60℃下）12 min→去離子水清洗→染色（卡寶品紅常規(guī)）3～5 min →壓片（十字壓片法）→鏡檢、鑒定。根據染色體數確定加倍處理材料的倍性。

2 結果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基對三葉木通腋芽誘導率的影響

用WPM 和MS 2 種培養(yǎng)基進行三葉木通腋芽誘導，由表1 可知，WPM 培養(yǎng)基的腋芽誘導率明顯高于MS 培養(yǎng)基的誘導率，下面的腋芽誘導和繼代增殖培養(yǎng)均選用WPS 培養(yǎng)基。

表1 基本培養(yǎng)基對三葉木通腋芽誘導率的影響

2.2 不同植物生長調節(jié)劑對三葉木通腋芽誘導的影響

由表2 可知，不添加任何植物生長調節(jié)劑組（A1）不能使三葉木通腋芽萌發(fā)，當6-BA 濃度為0 mg/L 時，添加NAA 和GA3少數三葉木通莖段萌發(fā)腋芽，且有部分莖段基部愈傷化；當6-BA 濃度為1.0 mg/L，NAA 濃度為0.1 mg/L，GA3濃度為2.0 mg/L 時，三葉木通腋芽長勢較好，誘導率達75.12%。隨著6-BA 濃度升高，三葉木通腋芽誘導率呈下降趨勢，添加NAA 濃度為0.5 mg/L 的處理組均有部分愈傷化，可能是NAA 濃度添加過高而導致，從而抑制腋芽的萌發(fā)。在7 個三葉木通腋芽誘導培養(yǎng)基處理組中，最適宜的誘導培養(yǎng)基為WPM+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+2.0 mg/L GA3。

表2 不同植物生長調節(jié)劑對三葉木通腋芽誘導率的影響

2.3 不同植物生長調節(jié)劑對三葉木通不定芽增殖系數的影響

三葉木通繼代增殖培養(yǎng)過程中添加了不同濃度的6-BA 和NAA，共設置了8 個培養(yǎng)基處理組。由表3 可知，在不添加6-BA 的處理組中，三葉木通不定芽沒有呈現增殖生長現象；在添加6-BA 的處理組中，隨著6-BA 的濃度升高，增殖系數呈上升趨勢，當6-BA 濃度為3.0 mg/L 時增殖系數最高，說明細胞分裂素6-BA 在三葉木通不定芽增殖中起主導作用，同時低濃度NAA 起到輔助作用。在8個三葉木通繼代增殖培養(yǎng)基處理組中，最適宜的繼代培養(yǎng)基為WPM+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

表3 不同植物生長調節(jié)劑對三葉木通不定芽增殖系數的影響

2.4 不同植物生長調節(jié)劑對三葉木通不定芽生根率的影響

三葉木通生根培養(yǎng)25 d 后不定芽有根系生長，在不同的處理組中，不定芽生根情況有差異。由表4 可知，不添加NAA 處理組不能使三葉木通生根；添加NAA 的處理組均有根系生長，當NAA 濃度為1.0 mg/L、GA3濃度為 1.0 mg/L 時，根系生長較好，生根率高，而NAA 濃度為0.2 mg/L 處理組有根系生長，但出現部分愈傷化。結果表明細胞生長素NAA 在三葉木通生根誘導中起主導作用，同時GA3起到促進作用，但高濃度的NAA 會促使芽愈傷化，降低生根率。最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L GA3。

表4 不同植物生長調節(jié)劑對三葉木通不定芽生根率的影響

2.5 秋水仙堿對三葉木通不定芽多倍體誘導的影響

采取秋水仙堿溶液直接浸泡方式對三葉木通多倍體誘導，并通過染色體直接計數。由表5 可知，三葉木通叢生芽用3 種不同濃度的秋水仙堿溶液浸泡12 h，均沒有獲得加倍體，浸泡延長至24 h 時，0.3%、0.5%秋水仙堿溶液均能誘導加倍體，但0.3%秋水仙堿溶液誘導效果好，誘導率為15%，浸泡再次延長至48 h 時，只有0.3%秋水仙堿溶液能誘導多倍體，且誘導效果較浸泡24 h 處理組的誘導效果差。不同濃度秋水仙堿在同一處理時間誘導率并沒有隨著濃度的變化而呈現誘導率上升的趨勢，其原因可能是高濃度的秋水仙素對叢生芽的傷害大，使得存活下來的叢生芽數減少，并且生活力下降，從而使檢測到加倍的叢生芽塊數相應很少。

表5 秋水仙堿對三葉木通不定芽多倍體誘導的影響

3 討論

三葉木通在WPM 培養(yǎng)基比MS 培養(yǎng)基中腋芽誘導率高，這與吳玲利等在白木通莖段腋芽誘導[5]中的研究結果相一致。腋芽誘導培養(yǎng)基采用6-BA、NAA 和GA3激素組合，在同一濃度的條件下加入GA3和不加入GA3誘導效果不一樣，表明GA3在初代腋芽生長中起到促進作用，這與岑忠用等在木薯腋芽萌發(fā)誘導的研究[6]結果相一致，同時，在三葉木通初代培養(yǎng)時，NAA 濃度為0.5 mg/L 時有莖段基部出現愈傷化，可用IBA 代替NAA 做進一步研究。

繼代增殖培養(yǎng)是組培離體快繁的關鍵，找到適宜的增殖培養(yǎng)基配方，才能達到組培快速繁殖的目的。在繼代增殖培養(yǎng)過程中，6-BA 和NAA 是常用的激素組合[7]。在三葉木通腋芽增殖培養(yǎng)試驗中發(fā)現，單獨使用NAA 不能使腋芽增殖；單獨使用6-BA 腋芽能增殖，但生長較弱，說明6-BA 在增殖培養(yǎng)中起主導作用；一定濃度6-BA 和NAA組合使用增殖效果好，且隨著6-BA 的濃度增高增殖系數升高，這與姜傲芳等在薜荔中的研究[8]結果相一致。三葉木通生根培養(yǎng)選用1/2 MS 培養(yǎng)基，發(fā)現試管苗的生根效果更好，說明降低無機鹽的濃度更有利于根的誘導，這與羅士偉等在無籽西瓜生根試驗[9]中的結果相一致。

三葉木通染色體加倍是種質創(chuàng)新的主要途徑之一，陶抵輝等指出染色體加倍方法有形態(tài)鑒定、細胞學鑒定、染色體記數、分子水平的鑒定等[10]，熊大勝等用秋水仙素浸泡三葉木通根發(fā)現混倍性明顯，四倍性細胞只占31.7%～37.9%[11]。該試驗發(fā)現用0.3%秋水仙堿浸泡無菌試管苗24 h 能獲得四倍體叢生芽塊，雖然叢生芽誘導率低，但憑借其快速增殖的優(yōu)勢，能獲得大量加倍叢生芽。對于同一材料，染色體加倍概率通常隨處理強度的增大而增大，但同時秋水仙素對細胞傷害增大，死亡率提高，因此，選擇合適的濃度和處理時間至關重要。該研究以三葉木通帶芽莖段為外植體，構建三葉木通離體快繁體系，進行三葉木通多倍體誘導和鑒定，為三葉木通的種質創(chuàng)新和三葉木通品種的選育奠定了基礎和技術支持。