劉建學 劉金科 李 璇 韓四海 李佩艷 徐寶成 郭金英 羅登林

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 河南省食品原料工程技術研究中心，河南 洛陽 471023)

濃香型白酒發(fā)展歷史悠久，占據(jù)白酒行業(yè)70%以上，通常采用以大曲為主要糖化劑的典型自然固態(tài)發(fā)酵法生產，形成窖香濃郁、香味協(xié)調等風味特點[1]。但在實驗室模擬白酒固態(tài)發(fā)酵工藝存在諸多局限性，諸如發(fā)酵參數(shù)的檢測和控制，大多數(shù)是通過液態(tài)發(fā)酵來研究白酒微生物之間的作用。如Wu等[2-3]分析釀酒酵母、異常畢赤酵母和東方伊薩酵母組合發(fā)酵方式，最終可以生產出具有汾酒特征的產品。近年來，白酒的功能微生物如酵母菌、酵母菌和乳酸菌、酵母菌屬之間已被廣泛研究，其數(shù)據(jù)可以成功地應用于提高發(fā)酵液的穩(wěn)定性和感官特性[4-6]。

作為白酒風味貢獻的主要功能微生物，酵母菌可分為釀酒酵母和非釀酒酵母。其中非釀酒酵母中的產酯酵母可為白酒帶來香味的復雜性，豐富白酒的風味物質[7-10]。戴爾有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii，T.delbrueckii)是一種典型的產香酵母，能夠產生2-苯乙醇、2-氨基苯乙酮、乙酸戊乙酯等風味物質[11-13]，同時也具有很高的環(huán)境耐受性[14]。T.delbrueckii具有優(yōu)良的發(fā)酵特性，在果酒中應用廣泛，通過不同的接種方式可研究T.delbrueckii對果酒揮發(fā)性物質生成的影響[15-17]。

目前，雖然T.delbrueckii已廣泛應用于果酒類發(fā)酵，但在白酒發(fā)酵中的應用研究很少。研究擬通過篩選本土優(yōu)良產酯特性的T.delbrueckii，研究其在模擬白酒發(fā)酵的發(fā)酵特性，旨在為本土T.delbrueckii在濃香型白酒生產中的應用提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：酒醅采于豫南某濃香型白酒生產車間，為窖池中糟醅上、中和下層糟醅等量混合，實驗室-20 ℃冷凍保存；

菌株：安琪白酒高活性釀酒酵母(鑒定為酵母屬釀酒酵母)，安琪酵母有限公司；

YPD培養(yǎng)基、YEPD培養(yǎng)基：按文獻[18]配制；

WL培養(yǎng)基：按文獻[19]配制；

生理生化培養(yǎng)基：按文獻[20]22-23配制；

產酯培養(yǎng)基：按文獻[7]配制；

葡萄糖：分析純，江蘇強盛功能化學股份有限公司；

胰化蛋白胨：英國OXOID公司；

瓊脂粉：上海藍季科技發(fā)展有限公司；

氯化鈉、氫氧化鈉：分析純，西隴化工股份有限公司；

Taq Plus DNA聚合酶：酶活5 U/μL，上海生工股份有限公司。

1.2 儀器與設備

立式蒸汽滅菌鍋：LDZX-50KB型，上海申安醫(yī)療器械廠；

電熱恒溫培養(yǎng)箱：SW-CJ-1D DH360BS型，上海坤天實驗儀器有限公司；

數(shù)碼顯微鏡：BA210型，北京瑞科中儀器有限公司；

可見分光光度計：722N型，上海馳唐實業(yè)有限公司；

冰箱：BCD-312WDPV型，山東青島海爾股份有限公司；

PCR儀：Verity 96well型，美國ABI公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選 將酒醅研磨后稱取25 g至225 mL無菌生理鹽水，加滅菌玻璃珠于200 r/min、28 ℃振蕩30 min。移取振蕩培養(yǎng)液1 mL至9 mL生理鹽水中進行梯度稀釋，將10-3、10-4、10-5稀釋液在YEPD培養(yǎng)基和WL培養(yǎng)基上(兩種培養(yǎng)基均加入0.008 g/L的氯霉素，防止細菌污染)進行平板涂布培養(yǎng)，每個梯度做3個平行，于28 ℃恒溫培養(yǎng)。挑選單菌落，觀察單菌落特征，如菌落大小、顏色、色澤等，并在40倍顯微鏡下觀察酵母菌水浸片和染色片，將符合酵母菌落特征的單菌落在YEPD培養(yǎng)基上劃線分離3次，斜面保藏，并將分離純化單菌落經(jīng)液體培養(yǎng)后于-20 ℃甘油保藏。

酵母產酯能力篩選：將分離純化酵母菌接種到產酯培養(yǎng)基上，酵母菌接種量為5%，培養(yǎng)條件為30 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)4 d，利用皂化回流法測定酵母產總酯含量。

1.3.2 菌種生理生化鑒定 對篩選酵母菌進行糖發(fā)酵試驗、氮源同化試驗、碳源同化試驗、類淀粉試驗、脲酶試驗，并參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[20]18-20進行鑒定判斷。

1.3.3 菌種生長曲線測定 取所篩選酵母菌置于YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)培養(yǎng)24 h，每隔1 h取發(fā)酵液測定其OD600 nm值，以時間為橫坐標、OD600 nm值為縱坐標繪制酵母菌生長曲線。

1.3.4 菌株耐受特性分析

(1) 酵母的耐溫性試驗：將活化后的酵母菌按5%的接種量接種到100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，分別置于30，35，40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測定其培養(yǎng)24 h時的OD600 nm值，每組試驗3個平行。

(2) 酵母的耐pH試驗：將活化后的酵母菌按5%接種量接種到滅菌后調節(jié)pH為3.5，4.0，4.5，5.0的100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，測定其培養(yǎng)24 h時的OD600 nm值，每組試驗3個平行。

(3) 酵母的耐乙醇試驗：將活化后的酵母菌按5%接種量接種到滅菌后調節(jié)乙醇體積分數(shù)為6%，8%，10%，12%的100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，測定其培養(yǎng)24 h時的OD600 nm值，每組試驗3個平行。

1.3.5 菌株分子生物學鑒定 酵母菌株26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析方法：對篩選出的酵母菌株進行離心提取DNA后，進行PCR擴增，使用正向引物NL-1：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'，反向引物NL-4：5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'[21]進行26S rDNA D1/D2區(qū)的目的片段擴增。PCR循環(huán)為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃保持5 min。將得到的PCR產物交由上海生工生物工程股份有限公司進行純化和測序。將測序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索，通過 MEGA 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 模擬發(fā)酵試驗

(1) 結合菌株拮抗試驗：采用雙層瓊脂法[22]，將10 μL 的戴爾有孢圓酵母、釀酒酵母的培養(yǎng)液分別與10 mL 滅菌后的半固體YPD培養(yǎng)基混合均勻后，立即倒入下層瓊脂培養(yǎng)皿中，待凝固后放入牛津杯，每個牛津杯中加入100 μL稀釋至一定梯度的菌液，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察牛津杯周圍是否出現(xiàn)抑菌圈，若未出現(xiàn)抑菌圈說明本底菌與接種菌株無拮抗作用；反之，則說明2種菌之間存在拮抗作用。

(2) 混菌發(fā)酵流程：取采自杜康酒業(yè)有限公司釀酒原料加蒸餾水糊化，糊化后加糖化酶糖化3 h，再加入α-淀粉酶酶解3 h，過濾分裝并調節(jié)糖度，最后經(jīng)高壓蒸汽滅菌后備用。純培養(yǎng)加入T.delbrueckiiW5 106CFU/mL、釀酒酵母300 mg/L?；旌习l(fā)酵先加入T.delbrueckiiW5 105CFU/mL，2 d后加入釀酒酵母150 mg/L。發(fā)酵液置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，每隔24 h 進行理化指標測定。根據(jù)DNS法[23]測定發(fā)酵液還原糖含量，苯酚—硫酸法[24]測定發(fā)酵液總糖含量，按GB/T 10345—2007《白酒分析方法》測定發(fā)酵液乙醇含量、酸度、pH。菌落總數(shù)的測定采用稀釋涂布法，在WL培養(yǎng)基上培養(yǎng)計數(shù)[25]。當發(fā)酵完全，即發(fā)酵液重量連續(xù)3 d減少重量不變時，取發(fā)酵液進行揮發(fā)性物質測定，揮發(fā)性物質經(jīng)萃取后采用氣質聯(lián)用儀進行測量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用 Microsoft Excel 2013和SPSS Statistics 17.0對樣本(n=3)所得數(shù)據(jù)進行基本處理，Origin 2017進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 酵母形態(tài)及培養(yǎng)特征

如圖1所示，經(jīng)分離的酵母單菌落為乳白色，菌落質地均勻，正反兩面、邊緣和中央部位的顏色都很均一，菌落表面濕潤、光滑、黏稠，容易挑起；菌體為圓形、橢圓形，且生殖方式為出芽生殖，與酵母菌的基本特征符合[25]。

圖1 酵母菌的菌落形態(tài)圖片和鏡檢圖片

2.2 酵母菌的二級篩選

對酒醅中分離的酵母進一步篩選，將初步分離的疑似酵母菌株進行產酯能力復篩，得到如圖2所示結果，菌株Y1、M3、W5產總酯含量均超過2.0 g/L，其中W5產總酯含量最高，其為2.479 g/L。研究[16,26]表明，優(yōu)質的產酯酵母可以在酯酶的作用下產生眾多的酯類物質，除去酒類的雜味，改善酒類的品質。王鵬昊等[27]從釀酒小曲中分離優(yōu)質產酯酵母，經(jīng)產酯培養(yǎng)基篩選其總酯為2.684 g/L。因此選用Y1、M3、W5 3株菌株進行下一步試驗。

圖2 不同菌株產總酯含量

2.3 酵母菌的生理生化特性

2.3.1 酵母菌生長曲線 由圖3可知，在同樣初始接種量的情況下，菌株Y1在培養(yǎng)4 h左右進入對數(shù)生長期，菌株M3和W5在培養(yǎng)6 h時進入對數(shù)生長期，菌株Y1、W5達到平穩(wěn)期的OD600 nm值明顯高于M3，而且菌株Y1和M3在培養(yǎng)16 h后就已經(jīng)達到平穩(wěn)期，而菌株W5是在培養(yǎng)24 h后才逐漸達到平穩(wěn)期，所以從生長狀況來看菌株W5要優(yōu)于菌株Y1和M3。

圖3 3株酵母菌的生長曲線

2.3.2 酵母菌生理生化特性 參照《酵母菌的特征與鑒定手冊》[20]18-20對篩選酵母菌進行生理生化特性鑒定，分別進行糖發(fā)酵試驗、碳源同化試驗、氮源同化試驗、產類淀粉試驗及脲酶試驗，結果見表1。糖發(fā)酵試驗結果表明，菌株Y1能夠發(fā)酵葡萄糖、乳糖和蔗糖，不能發(fā)酵麥芽糖和半乳糖；菌株M3也能發(fā)酵葡萄糖和蔗糖，不能發(fā)酵麥芽糖、乳糖和半乳糖；菌株W5只能發(fā)酵蔗糖。碳源同化試驗結果表明，篩選得到的菌株Y1、M3、W5均能夠利用淀粉、葡萄糖、麥芽糖和蔗糖，但不能利用乳糖和檸檬酸。氮源同化試驗結果表明，篩選出的3種酵母菌對硫酸銨、亞硝酸鈉和硝酸鉀的利用情況基本一致，菌株Y1、M3、W5都能利用硫酸銨和硝酸鉀，不能利用亞硝酸鈉。其他試驗表明，篩選出的3株菌在生長代謝過程中均不能夠產生類淀粉物質，且在脲酶試驗中，酵母菌株均表現(xiàn)為陰性。

表1 菌株生理生化試驗結果?

2.4 酵母菌生長特性研究

2.4.1 溫度對酵母菌生長情況影響 如圖4所示，溫度為30～40 ℃時，3株菌均能生長，且菌株W5生長狀況優(yōu)于菌株Y1和M3，但在溫度為40 ℃時三者生長受到抑制(OD600 nm值<0.5)，說明菌株W5具有一定的耐溫性。在濃香型白酒發(fā)酵過程中，發(fā)酵溫度需控制在30～40 ℃，這樣濃香型白酒的酒質才能得到保障[7]。

圖4 溫度對酵母菌生長情況的影響

2.4.2 pH對酵母菌生長情況影響 如圖5所示，3株酵母菌株均有很好的pH耐受性，當pH為3.5時3株酵母菌株均能正常生長，酵母菌的生長狀況隨酸度的增加而減弱，但仍能保持其生物活性。而且菌株W5生長狀況優(yōu)于菌株Y1和M3。濃香型白酒發(fā)酵過程中由于產酸微生物的作用[28]，其發(fā)酵環(huán)境呈酸性，一株優(yōu)良的酵母菌必須具有良好的pH耐受性才能更好地參與到白酒固態(tài)發(fā)酵過程中。

圖5 pH對酵母菌生長情況的影響

2.4.3 乙醇濃度對酵母菌生長情況影響 由圖6可知，3株酵母在乙醇含量為12%時生長均受到抑制(OD600 nm<0.5)，但在乙醇濃度為6%～10%時菌株W5的生長狀況優(yōu)于菌株Y1和W5，說明菌株W5具有一定的乙醇耐受性。李小龍等[29]通過對白酒固態(tài)發(fā)酵過程中的微生物菌落演替研究發(fā)現(xiàn)，乙醇是菌落演替的最關鍵推動力，但隨著發(fā)酵過程的繼續(xù)，乙醇濃度升高，高濃度的乙醇會使酵母細胞產生毒效應，具有一定乙醇耐受性的酵母菌株在發(fā)酵過程中具有較高發(fā)酵特性。陽秀蓮等[30]通過篩選楊梅果酒中乙醇耐受性高的酵母菌株，可以輔助發(fā)酵為楊梅酒增香。

圖6 乙醇濃度對酵母菌生長情況的影響

2.5 酵母菌分子鑒定結果

在NCBI里進行Blast序列比對，然后用MEGA-X軟件中的鄰接統(tǒng)計方法繪制菌株W5 26S rDNA D1/D2基因序列相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖7所示，圖中系統(tǒng)發(fā)育樹顯示菌株W5與MH794401.1TorulasporadelbrueckiivoucherUCASIM-2178聚在一個分支上，是彼此的近親。結合菌落形狀、鏡檢結果和生化試驗結果分析，鑒定菌株W5屬于戴爾凱氏有孢圓酵母(Torulasporadelbrueckii)[20]20-22。

圖7 菌株W5 26S rDNA D1/D2基因序列其親緣關系的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹

2.6 混菌發(fā)酵理化特性

為防止混合發(fā)酵菌株之間存在抑制作用，影響其在發(fā)酵過程中的作用，對篩選酵母與釀酒酵母進行拮抗試驗，結果表明釀酒酵母與T.delbrueckii之間無拮抗作用，牛津杯周圍無抑菌圈出現(xiàn)，與空白組情況相同。因此，2株酵母可以進行混合發(fā)酵。以具有良好耐受性且產酯性能高的酵母菌株W5與釀酒酵母混合模擬白酒發(fā)酵，研究其理化指標和揮發(fā)性物質。由圖8可知，釀酒酵母發(fā)酵速率最快，發(fā)酵時間為6 d；T.delbrueckiiW5單獨發(fā)酵時間為8 d；T.delbrueckii與釀酒酵母混合發(fā)酵完成時間為9 d，順序接種中T.delbrueckii由于先加入而成為優(yōu)勢菌株，釀酒酵母加入時由于基質的消耗而增殖空間有限，可以極大發(fā)揮混合發(fā)酵中T.delbrueckii發(fā)酵特性，隨著釀酒酵母的加入，二者之間的相互競爭關系使得發(fā)酵完成時間延后。

圖8 不同方式培養(yǎng)酵母時的還原糖變化

由圖9(a)可知，釀酒酵母菌落數(shù)呈現(xiàn)“S”型生長特征，菌落數(shù)在第4天達到峰值，酵母活細胞數(shù)為7.7×107CFU/mL，此后便開始下降。由圖9(b)可知，T.delbrueckiiW5純培養(yǎng)第3天，酵母活細胞數(shù)達到峰值，說明T.delbrueckiiW5能迅速適應白酒發(fā)酵環(huán)境。由圖9(c)可知，先加入的T.delbrueckiiW5利用糖類等迅速增殖，到第2天時T.delbrueckiiW5已經(jīng)成為優(yōu)勢菌株。此時隨著釀酒酵母的加入，雖然釀酒酵母生長能力較T.delbrueckiiW5好，但T.delbrueckiiW5由于數(shù)量優(yōu)勢受釀酒酵母影響較小。由于二者處于競爭關系，二者的活細胞數(shù)都較純培養(yǎng)時低，釀酒酵母在第5天時活細胞數(shù)才達到峰值。

圖9 不同發(fā)酵方式酵母活細胞數(shù)變化

如表2所示，3種發(fā)酵方式還原糖含量均小于4 g/L，說明3種發(fā)酵均能完成。在相同的培養(yǎng)條件和發(fā)酵條件下，T.delbrueckii純培養(yǎng)方式下總酸度較其他兩種培養(yǎng)方式高，其總酸含量為7.62～7.72 g/L，說明T.delbrueckii單獨發(fā)酵產總酸能力很高，乳酸為主的非揮發(fā)性酸類能增加白酒的敦厚感，適當?shù)乃岷靠梢詤f(xié)調白酒的各種風味成分，提升白酒的口感。而混合發(fā)酵試驗總酸含量得到顯著減少，說明釀酒酵母的加入可以減少T.delbrueckii的產總酸量。另外T.delbrueckiiW5揮發(fā)酸產量較另外兩種發(fā)酵方式低，其揮發(fā)酸為0.32～0.48 g/L，白酒當中揮發(fā)酸主要有甲酸、乙酸、丁酸等，揮發(fā)酸的含量可以直接影響到白酒的風味和質量，如乙酸強烈的酸味會使白酒風味變差。釀酒酵母純培養(yǎng)乙醇含量為13.18%～13.50%，說明釀酒酵母相較于T.delbrueckii單獨發(fā)酵具有強發(fā)酵能力，二者之間混合發(fā)酵可以提高T.delbrueckii單獨發(fā)酵產乙醇能力。

表2 模擬發(fā)酵試驗理化指標?

3 結論

(1) 獲得一株高產酯酵母。從濃香型白酒酒醅中分離得到優(yōu)勢非釀酒酵母，通過濃香型白酒發(fā)酵條件耐受性篩選，經(jīng)過分子生物學鑒定為戴爾有孢圓酵母。

(2) 發(fā)酵過程中菌種間有競爭關系。通過篩選酵母與釀酒酵母模擬白酒發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母發(fā)酵速率最快，發(fā)酵完成時間為6 d，T.delbrueckiiW5單獨發(fā)酵時間為8 d，二者混合發(fā)酵時間為9 d，延長了發(fā)酵完成時間，表明在混菌發(fā)酵過程中菌種間有競爭關系。

(3) 產酯能力。酸是生成酯類物質的前體物質，在相同培養(yǎng)和發(fā)酵條件下，T.delbrueckii純菌發(fā)酵方式其總酸含量較其他兩種培養(yǎng)方式高，其總酸含量范圍在7.62～7.72 g/L，表明T.delbrueckii產酯能力高。同時，混菌發(fā)酵可以提高產乙醇能力，與目標菌種單一菌種發(fā)酵相比，由10.55%提高到了11.62%。

戴爾有孢圓酵母在白酒生產中尚沒有應用，所具有的高產酯能力仍需進一步研究，對其發(fā)酵性能的深入了解，有助于在白酒釀造中發(fā)揮其高產酯、高產乙醇的作用。