毛積華 王 輝 涂宗財 鐘比真

(1. 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047;2. 江西師范大學(xué)功能有機(jī)小分子教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330022)

食物過敏是由于食物的特定成分(通常是蛋白質(zhì)，也可能是化學(xué)半抗原)被人體免疫細(xì)胞識別并引發(fā)特異性免疫反應(yīng)導(dǎo)致的過敏癥狀，其機(jī)理可分為免疫球蛋白E (IgE) 介導(dǎo)、非IgE介導(dǎo)和混合型介導(dǎo)[1]。目前大部分食物過敏為IgE介導(dǎo)的，在食物攝入后的1 h內(nèi)產(chǎn)生過敏癥狀，但也有免疫球蛋白G (IgG) 介導(dǎo)的案例[2]。目前，引起過敏的食物至少有160種，其中90%以上的食物過敏都是由雞蛋、牛奶、魚、貝類、花生、其他堅(jiān)果、大豆和含麩質(zhì)的谷類食品造成的[3]。

卵清蛋白(ovalbumin, OVA) 是蛋清中含量最高的蛋白[4]，是一種由385個氨基酸組成的水溶性蛋白，等電點(diǎn)為4.5，分子量為45 kDa，具有免疫調(diào)節(jié)等生物活性[5]。此外，OVA同時含有的疏水基團(tuán)和親水基團(tuán)賦予其優(yōu)良的乳化性、起泡性和凝膠性，故一直被用作乳化劑、起泡劑和膠凝劑等[6-7]。

糖基化是美拉德反應(yīng)的前期階段，是食品加工中經(jīng)常發(fā)生的反應(yīng)。糖基化反應(yīng)能改變食物過敏原的功能特性[8]和過敏特性。Li等[9]研究表明，以乳清分離蛋白與麥芽糖質(zhì)量比1.04∶1，于60.8 ℃反應(yīng)54.3 h時，乳清分離蛋白顯現(xiàn)出最低的抗原性。研究[10-11]表明，當(dāng)溫度為40～80 ℃，相對濕度為60%～85%時，糖基化反應(yīng)的接枝效果最好。試驗(yàn)擬以O(shè)VA和不同己糖(果糖、葡萄糖、半乳糖)為原料，在相對濕度74%、65 ℃反應(yīng)3 h，采用理化分析和光譜分析等方法研究糖基化OVA自由氨基含量、表面疏水性、紫外吸收光譜、內(nèi)源和同步熒光光譜以及IgG/IgE結(jié)合力的變化規(guī)律，探究不同己糖在最適糖基化修飾條件下對OVA糖基化反應(yīng)及其IgG/IgE結(jié)合能力的影響，旨在為OVA的致敏性降低提供一定方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

卵清蛋白：GradeⅤ，美國Aldrich-sigma公司；

L-賴氨酸：Vetec優(yōu)級純，美國Aldrich-sigma公司；

葡萄糖(≥98%)、果糖(≥99%)、半乳糖(≥99%)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

大耳兔：雄性，3月齡，重量2 kg左右，南昌龍平兔業(yè)有限公司；

IgE所用一抗：6個雞蛋過敏病人血清(其相關(guān)信息見表1)，美國Plasmalab公司；

表1 雞蛋過敏病人信息

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：ML 104/02型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，常州愛華儀器制造有限公司；

pH計：PHS 25型，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；

酶標(biāo)儀：Synergy H1型，美國伯騰儀器有限公司；

紫外分光光度計：U-2910型，日本日立高新技術(shù)公司；

熒光分光光度計：F-7000型，日本日立高新技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 OVA分別與葡萄糖、半乳糖、果糖以質(zhì)量比2∶1溶解于PBS溶液(0.1 mol/L，pH 8.0)，凍干，于65 ℃，相對濕度74%的糖基化反應(yīng)模型中反應(yīng)3 h，冰浴30 min，透析，將樣品濃度調(diào)至1 mg/mL，于-20 ℃冰箱備用。葡萄糖、半乳糖、果糖糖基化產(chǎn)物分別命名為O-glc、O-gal、O-fru。

1.2.2 接枝度的測定 參照Nielsen等[12]的方法并略作修改。準(zhǔn)確稱取7.62 g硼砂、0.2 g SDS和176 mg DTT溶解于150 mL蒸餾水中，0.16 g OPA溶于4 mL無水乙醇中，混勻，定容至200 mL。取50 μL質(zhì)量濃度為4 mg/mL的樣品與1 mL OPA混合，避光反應(yīng)2 min，測定340 nm處吸光值。按式(1)計算接枝度。

(1)

式中：

DG——接枝度，%；

A0——未糖基化的OVA吸光度值；

A1——糖基化OVA吸光度值。

1.2.3 表面疏水性的測定 參照Xiang等[13]的方法并略有修改。用PBS(10 mmol/L, pH 7.4) 將樣品稀釋至0.125，0.250，0.500 mg/mL，取4 mL樣品與20 μL ANS溶液 (8 μmol/L) 混合，于熒光風(fēng)光光度計中掃描。激發(fā)波長370 nm，狹縫寬度5 nm，發(fā)射波長400～600 nm，掃描速度600 nm/min，將熒光強(qiáng)度對蛋白濃度作圖進(jìn)行擬合，其斜率即表面疏水性。

1.2.4 紫外光譜掃描 樣品稀釋至1 mg/mL，狹縫寬度1.5 nm，掃描速度1 200 nm/min，掃描波長250～350 nm。

1.2.5 熒光光譜掃描 樣品稀釋至1 mg/mL，內(nèi)源熒光掃描條件為激發(fā)波長290 nm，掃描速度1 200 nm/min，狹縫寬度5 nm，掃描波長250～450 nm；同步熒光掃描條件為掃描速度1 200 nm/min，狹縫寬度5 nm，激發(fā)波長275～350 nm或230～350 nm，激發(fā)與發(fā)射波長間隔(λ) 15 nm或60 nm。

1.2.6 兔抗OVA血清的制備 將4只大耳兔平均分成兩組，分別命名為空白對照組(1號和2號兔)和抗原注射組(3號和4號兔)，喂養(yǎng)5 d無異常后開始免疫。采用靜脈注射，注射所用試劑和耗材均為無菌級。具體步驟為：用10 mmol/L，pH 7.4的PBS溶液將99%的OVA稀釋至3 mg/mL，第一次免疫加等體積弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，并按1 mg/只的量沿兔耳緣靜脈注射進(jìn)行免疫。初次免疫后的第2，4，6周分別使用等量的弗氏不完全佐劑乳化OVA，按0.5 mg/只進(jìn)行加強(qiáng)免疫3次。第7周時沿兔耳緣靜脈采血1 mL，參照李雪[14]的方法測量兔血清效價。效價>10 000，表明抗體水平較高，可停止繼續(xù)免疫，從心臟大量采血[15]。將采集到的全血傾斜于37 ℃烘箱中平衡0.5 h，然后于4 ℃冰箱過夜，6 000 r/min離心10 min，用已滅菌的離心管分裝于-40 ℃冰箱備用[16]。

1.2.7 IgG/IgE結(jié)合能力的測定 參照Yang等[17]的方法并稍有修改。IgG所用一抗為實(shí)驗(yàn)室自制兔抗OVA血清。將100 μL 4 μg/mL的OVA加入酶標(biāo)板中，37 ℃孵育2 h，用PBST洗板3次，每次5 min。再加入250 μL 1%魚明膠，37 ℃封閉2 h。同時將等量的兔抗OVA血清(PBST稀釋至1∶60萬)與樣品(PBST稀釋至2 μg/mL)于離心管中混勻，37 ℃預(yù)孵育1 h。封閉結(jié)束后洗板，再將100 μL預(yù)孵育的樣品與血清混合液加入酶標(biāo)板中，37 ℃孵育1 h，洗滌。將100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG酶標(biāo)二抗(PBST稀釋至1∶5 000)加入酶標(biāo)板，37 ℃孵育1 h，洗板，加入100 μL TMB顯色液，37 ℃孵育15 min，最后加入100 μL的2 mol/L硫酸，測定450 nm處吸光度。

IgE結(jié)合能力測定與IgG的相似，不同之處在于IgE所用封閉液為5%脫脂奶粉，樣品、一抗人血清與羊抗人IgE酶標(biāo)二抗分別用封閉液稀釋至1 μg/mL、1∶20和1∶400。IgG和IgE結(jié)合能力用抑制率表示，并按式(2)計算。

(2)

式中：

In——抑制率，%；

A、A0——分別表示含有樣品的吸光度和陽性對照孔(用抗體稀釋液代替樣品)的吸光度。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用GraphPad Prism 8進(jìn)行繪圖分析，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 接枝度

由圖1可知，O-fru的接枝度僅為1.1%，O-glc與O-gal的接枝度分別為34.2%，37.7%，與O-fru的差異顯著，3種己糖在干熱條件下與OVA發(fā)生糖基化修飾反應(yīng)的活性程度為半乳糖>葡萄糖>果糖。半乳糖、葡萄糖分子中含有醛基，而果糖含有酮基，醛基中的羰基碳比酮基中的更親電，更易發(fā)生親電取代反應(yīng)[18]，因此，含醛基的半乳糖、葡萄糖比含酮基的果糖發(fā)生糖基化修飾反應(yīng)的活性更高。Chen等[19]發(fā)現(xiàn)在等濕度β-lg糖基化系統(tǒng)中，葡萄糖發(fā)生糖基化反應(yīng)的活性大于果糖，與試驗(yàn)結(jié)果一致。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2 表面疏水性

由圖2可知，與OVA相比，糖基化OVA的表面疏水性明顯降低，可能是OVA在糖基化過程中由于加熱而解折疊，然后通過疏水相互作用聚集，使其表面疏水性降低[20]，或者是因?yàn)樘腔^程中己糖分子對賴氨酸和精氨酸的封閉作用，阻斷了疏水氨基酸和ANS探針間的連接。其中，相比于O-fru和O-glc，O-gal的表面疏水性下降得最少，可能是半乳糖C4碳原子的L構(gòu)型抑制了OVA的疏水相互作用，使表面疏水性下降的趨勢減弱。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 紫外吸收光譜

由圖3可知，還原糖修飾的OVA的最大吸收峰出現(xiàn)在278 nm附近，吸光度主要取決于色氨酸和酪氨酸殘基。與OVA相比，糖基化OVA的紫外吸光度值都有不同程度的上升，由OVA的0.591上升至O-gal的0.818，可能是因?yàn)榉磻?yīng)過程中己糖分子的接入，蛋白質(zhì)分子部分展開，引起構(gòu)象變化，色氨酸與酪氨酸殘基在糖基化反應(yīng)過程中逐漸暴露于蛋白分子表面，從而增加了糖基化產(chǎn)物的吸光度值，與Liu等[21]的結(jié)果一致。3種不同還原糖修飾的反應(yīng)物中，O-glc的吸光值略高于O-fru，O-gal的吸光值最高，表明在相同的反應(yīng)條件下，半乳糖修飾的OVA的紫外吸收增強(qiáng)較多，可能是半乳糖誘導(dǎo)的糖基化反應(yīng)更劇烈，對構(gòu)象破壞較大，解折疊過程中更多芳香族氨基酸被釋放，導(dǎo)致紫外吸收增多。

圖3 己糖修飾的卵清蛋白紫外吸收光譜

2.4 熒光光譜

由圖4可知，與OVA相比，糖基化OVA的熒光強(qiáng)度峰值逐漸降低，從OVA的319.3降低至O-gal的249.2，可能是OVA構(gòu)象被糖基化反應(yīng)逐漸改變的過程中，OVA熒光發(fā)色團(tuán)被暴露在極性環(huán)境中，與極性溶劑水發(fā)生了熒光猝滅，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[22]。O-fru的熒光強(qiáng)度高于O-glc和O-gal，表明果糖在糖基化過程中對OVA構(gòu)象改變不大，可能是因?yàn)橄啾扔谌┨?，酮糖的反?yīng)趨勢更緩和，對構(gòu)象造成的影響較小。O-gal的熒光強(qiáng)度低于O-flc，表明半乳糖對OVA構(gòu)象的影響強(qiáng)于葡萄糖，可能是半乳糖誘導(dǎo)的反應(yīng)中釋放出了更多芳香族氨基酸，與極性溶劑水接觸導(dǎo)致熒光猝滅。

圖4 己糖修飾的卵清蛋白內(nèi)源熒光光譜

同步熒光光譜可反映出反應(yīng)過程中特定氨基酸的分子微環(huán)境，是表征特異性氨基酸的重要指標(biāo)，其中λ為15 nm時同步熒光光譜表征的是酪氨酸，λ為60 nm時則是色氨酸[23-24]。由圖5可知，與未糖基化的OVA相比，糖基化的OVA同步熒光強(qiáng)度顯著降低，由未糖基化時的90.03分別下降至O-gal的71.05、O-glc的78.74和O-fru的81.81，表明在糖基化反應(yīng)改變OVA的構(gòu)象結(jié)構(gòu)時，酪氨酸所處的微環(huán)境逐漸由疏水環(huán)境變?yōu)橛H水環(huán)境[25]。其中，O-gal的熒光強(qiáng)度下降程度最高，可能是半乳糖對OVA構(gòu)象結(jié)構(gòu)更劇烈的破壞所導(dǎo)致的。色氨酸表現(xiàn)出與酪氨酸相一致的趨勢。

圖5 己糖修飾的卵清蛋白同步熒光光譜

2.5 IgG/IgE結(jié)合能力

由圖6可知，與天然OVA相比，糖基化樣品的IgG/IgE結(jié)合力均顯著下降，OVA的IgG/IgE結(jié)合能力從73.8%，52.8%降低至O-gal的48.1%，35.6%，而O-fru的IgG/IgE結(jié)合能力無明顯變化，可能是葡萄糖和半乳糖對OVA的糖基化修飾程度高，糖基化過程中OVA分子結(jié)構(gòu)展開，其構(gòu)象表位遭到破壞，以及還原糖分子的共價結(jié)合阻礙了抗體對OVA分子的抗原表位識別[26-28]，而果糖對OVA的糖基化修飾程度較低，OVA的分子結(jié)構(gòu)比較完整，其構(gòu)象表位并未遭到較大破壞。3種己糖中，果糖的糖基化反應(yīng)活性最低，對OVA的IgG/IgE結(jié)合能力降低效果最差；半乳糖的糖基化程度高于葡萄糖的，而半乳糖和葡萄糖修飾的OVA的IgG/IgE結(jié)合能力比較接近一致，可能是碳水化合物和蛋白質(zhì)過敏位點(diǎn)的結(jié)合能力不同所致[29]。

小寫字母不同表示樣品的IgG結(jié)合的差異顯著(P<0.05)；大寫字母不同表示樣品的IgE結(jié)合的差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

研究了不同己糖(葡萄糖、半乳糖、果糖)修飾后的OVA在結(jié)構(gòu)性和IgG/IgE結(jié)合力上的變化。結(jié)果表明，半乳糖修飾的OVA的糖基化程度最高，而果糖修飾的最低。反應(yīng)過程中，OVA由于加熱而解折疊，然后通過疏水相互作用聚集，使其表面疏水性降低。糖基化過程中的熱處理以及分子基團(tuán)的改變破壞了OVA的原有構(gòu)象，芳香族氨基酸外露，紫外吸收增強(qiáng)，熒光強(qiáng)度降低。糖基化反應(yīng)使OVA的致敏性降低，但果糖修飾的OVA的IgG/IgE結(jié)合力下降輕微，遠(yuǎn)低于半乳糖和葡萄糖的。3種己糖中，果糖為酮糖，半乳糖和葡萄糖均為醛糖，醛糖修飾的糖基化程度和改變蛋白質(zhì)空間布局的能力高于酮糖，因此半乳糖和葡萄糖能顯著降低OVA的致敏性。試驗(yàn)探究了構(gòu)象的變化對OVA致敏性的影響，但OVA構(gòu)象是如何變化，其變化又如何影響OVA致敏性還有待深入探究。后續(xù)應(yīng)利用圓二色光譜儀、生物質(zhì)譜、分子對接等技術(shù)，研究糖基化反應(yīng)對OVA的二級結(jié)構(gòu)變化、糖基化位點(diǎn)及OVA與糖分子的相互作用。