劉慶萍

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075)

1 紅曲霉研究歷史現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)

紅曲霉(MonascuspurpureusWent)，又被稱(chēng)為紅曲、丹曲、赤曲。廣泛生存于自然界中，主要為腐生真菌，生長(zhǎng)在樹(shù)木、土壤以及一些堆積物中，是我國(guó)最先運(yùn)用于食品加工的真菌之一，主要被用于酒曲、制醋、著色、防腐等。國(guó)外的紅曲霉主要用于肉類(lèi)加工及其食品著色上。一直到后續(xù)發(fā)現(xiàn)紅曲霉具有降低膽固醇的功效，其生理特性才開(kāi)始被研究與關(guān)注。

紅曲霉屬的物種被使用在我國(guó)已經(jīng)有超過(guò)1000多年的歷史[1]，1884年法國(guó)學(xué)者Van Tidhgen從馬鈴薯培養(yǎng)基上分離得到兩種紅曲霉菌株[2]，印尼學(xué)者Went 于1895年對(duì)紫紅曲菌種進(jìn)行鑒定。紅曲霉是腐生真菌，屬于真菌門(mén)(Eumycota)、子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)、不整囊菌綱(Plectomycetes)、散囊菌目(Eurotiales)、曲霉科(Eurotiaceae)、紅曲屬(Monasucs)[3]。在物種 Fungorum中符合國(guó)際真菌物種命名法的紅曲霉屬物種只有21種(http://www.speciesfungorum.org/Names/Names.asp)。

紅曲霉的研究分為3個(gè)階段[4]，第一階段：1970年之前主要是研究紅曲霉的分類(lèi)和鑒定。第二階段：1979年日本學(xué)者從紅曲霉(Monascusruber)中發(fā)現(xiàn)Monacolin K，引起了全世界研究者的關(guān)注，大量的研究者開(kāi)始對(duì)紅曲霉中的活性化合物質(zhì)進(jìn)行分析。第三階段：Plnac等在1995年從紅曲霉的發(fā)酵產(chǎn)物中分離出桔霉素(citrinin)，大家開(kāi)始關(guān)注紅曲霉的安全性，并開(kāi)始進(jìn)行研究[5]。

2 紅曲霉產(chǎn)生洛伐他汀的研究現(xiàn)狀

1992年婁志賢等[6]從紅曲霉屬(Monascussp.)中第一次成功分離出Monacolin K。1999年宓鶴鳴等[7]從紫紅色曲霉Monascuspurpureus接種發(fā)酵的紅曲米中分離提取出Lovastatin。吳芳彤[8]研究高產(chǎn)洛伐他汀紅曲霉的分離及鑒定及其紅曲霉發(fā)酵條件的優(yōu)化，她在文章中使用的是從原始材料中分離的紅曲霉，從而進(jìn)行洛伐他汀實(shí)驗(yàn)，并未鑒定能夠產(chǎn)生洛伐他汀的紅曲霉物種名稱(chēng)。實(shí)驗(yàn)中她使用HPLC分析法鑒定是否能產(chǎn)生洛伐他汀。如果我們鑒定清除能夠產(chǎn)生洛伐他汀物種，當(dāng)我們分離到一個(gè)菌株，只需要確定是否能夠產(chǎn)生洛伐他汀，那么我們可以節(jié)省大量的人力和財(cái)力的消耗。

本研究結(jié)合已知文獻(xiàn)，已知紅曲霉的物種系列，對(duì)紅曲霉屬內(nèi)能夠產(chǎn)生洛伐他汀的物種進(jìn)行推斷，并為以后獲得高產(chǎn)洛伐他汀紅曲霉菌株打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3 材料與方法

3.1 序列的收集

首先去真菌索引中尋找紅曲霉屬，目前為止，已經(jīng)被國(guó)際認(rèn)可的物種為21個(gè)物種，通過(guò)MycoBank尋找到每一物種發(fā)表時(shí)的原始描述，并去GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載序列。本文中使用的數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 紅曲霉物種信息Table 1 Monascus species information

3.2 序列的比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析

我們一共使用24條ITS系列13個(gè)物種，包括Leiotheciumellipsoideum作為外群[9-12]使用。下載后的系列使用MAFFT[13]第七版進(jìn)行初步的比對(duì)，使用BioEdit v7.0.4[14]打開(kāi)系列，對(duì)系列進(jìn)行微調(diào)。最大似然法(Maximum Likelihood)在Cipres[15]平臺(tái)上選擇RAxML-HPC2 v8.2.12[16]，使用GTR模型對(duì)系列進(jìn)行分析。最后得出的系統(tǒng)發(fā)育支持率的系統(tǒng)發(fā)育圖，將支持率大于70的在系統(tǒng)發(fā)育圖中標(biāo)識(shí)出來(lái)。

4 結(jié)果與分析

通過(guò)使用紅曲霉的核糖體DNA(ITS)分析13個(gè)物種的代表序列24條。序列比對(duì)之后一共還有763個(gè)堿基(包含空格)，我們從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中可以看出Monascusruber，Monascuspurpureus，Monascuspilosus，Monascussanguineus，Monascusargentinensis5個(gè)物種在系統(tǒng)發(fā)育中屬于一個(gè)支系，這一個(gè)支系已經(jīng)有2個(gè)種被證明能夠產(chǎn)生洛伐他汀，紅曲霉屬的其他支系的物種并未有人證實(shí)能夠產(chǎn)生洛伐他汀，所以本文基于此得出能夠產(chǎn)生洛伐他汀的紅曲霉物種一共為5個(gè)物種。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。

圖1 紅曲霉屬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of Monascus

以前分離紅曲霉菌株獲得洛伐他汀具有一定的盲目性，雖然紅曲霉屬目前只有21個(gè)種。本文通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析之后，從之前已知的能夠產(chǎn)生的菌株Monascusruber，Monascuspurpureus推斷出能夠產(chǎn)生洛伐他汀的紅曲霉應(yīng)該是Monascusruber，Monascuspurpureus，Monascuspilosus，Monascussanguineus，Monascusargentinensis5個(gè)種，以后我們選取并想獲得高產(chǎn)洛伐他汀的菌株可以從這5個(gè)紅曲霉中選取。

5 展望

中老年人體中，少數(shù)膽固醇是靠食物攝入補(bǔ)充，體內(nèi)的膽固醇70%來(lái)自于體內(nèi)合成。人體內(nèi)除去主要的腦組織外，其他的各類(lèi)組織和器官均可合成膽固醇，肝臟是人體膽固醇合成的主要器官，約占50%。因此降低血漿膽固醇水平，防治冠心病和動(dòng)脈硬化的關(guān)鍵在于抑制肝臟內(nèi)源性膽固醇的生物合成。

洛伐他汀作為降低人體膽固醇的主要藥物，合成洛伐他汀主要為紅曲霉屬真菌的發(fā)酵產(chǎn)物，那么獲得能夠生產(chǎn)洛伐他汀與高產(chǎn)洛伐他汀的菌株是我們將來(lái)發(fā)展的必要條件。本研究基于前人的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理，得出紅曲霉屬能夠產(chǎn)生洛伐他汀的種類(lèi)一共為5個(gè)種，分別是Monascusruber，Monascuspurpureus，Monascuspilosus，Monascussanguineus，Monascusargentinensis。

紅曲霉發(fā)酵產(chǎn)物中除了擁有洛伐他汀以外，還存在腎毒性物質(zhì)桔霉素，大家開(kāi)始對(duì)紅曲霉的安全性進(jìn)行了懷疑，我國(guó)的紅曲霉產(chǎn)品面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。現(xiàn)在我國(guó)的紅曲產(chǎn)品主要是紅曲米、紅曲粉和紅曲紅混合的色素，化學(xué)成分不明確，桔霉素含量沒(méi)有檢測(cè)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有明確規(guī)定桔霉素含量，對(duì)于我國(guó)紅曲產(chǎn)品打入歐洲市場(chǎng)不利。紅曲霉產(chǎn)品品種單一，功效性能單一，應(yīng)用領(lǐng)域有待進(jìn)一步拓展，我國(guó)現(xiàn)在擁有的以紅曲作為原料的產(chǎn)品主要是仿制歐洲的產(chǎn)品，我們對(duì)紅曲的功能與機(jī)理研究尚不清楚，在分子上的運(yùn)用更加缺乏，本文應(yīng)用分子生物學(xué)方法鑒定能夠產(chǎn)生洛伐他汀的類(lèi)群。至于桔霉素的含量對(duì)人體的傷害將在后期的研究中跟進(jìn)。