周子鈴， 馬 堅(jiān)， 侯宇轉(zhuǎn)， 于麗麗， 丁小艷， 韓 龍， 黃永清

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔外科，銀川 750004）

唇腭裂（oral cleft or palate）是最常見(jiàn)的顱頜面畸形，全球范圍內(nèi)發(fā)病率為1/700[1]，我國(guó)以1.4/1000 的發(fā)病率成為世界高發(fā)國(guó)家之一[2]。在寧夏新生兒出生缺陷疾病中居于首位，發(fā)病率為1.85/1000[3]。該疾病不僅影響患兒的生長(zhǎng)發(fā)育，降低患兒家庭生活質(zhì)量，也影響了我國(guó)出生人口素質(zhì)[4]。唇腭裂分為綜合征型唇腭裂（SCL/P）和非綜合征型唇腭裂（NSCL/P），非綜合征型唇腭裂（NSCL/P）是指不伴有其他系統(tǒng)器官畸形，不屬于任何綜合征范圍之內(nèi)的單純唇裂、腭裂、唇裂合并腭裂的總稱[5]。近年來(lái)研究篩選發(fā)現(xiàn)很多與NSCL/P 相關(guān)的易感基因，包括 1q32.2（IRF6）、20q12（MAFB）、8q24.21（MYC）、4p16.2（MSX1）、17p13.1（NTN1）、10q25.3（SHTN1、VAX1）、5p12（FGF10）等[6-9]。2010年Beaty 對(duì)亞洲及歐洲唇腭裂人群進(jìn)行GWAS（genome-wide association studies）后提示 ABCA4和MAFB 在亞洲人群中更加顯著的異常表達(dá)[10]。但ABCA4 在唇部和腭部不表達(dá)，而ABCA4 第一內(nèi)含子中一段保守序列促進(jìn)基因的顯著表達(dá)會(huì)在小鼠面中部出現(xiàn)異常表征，這與Arhgap29 的RNA在人顱面部的表達(dá)模式類似[11]。Letra 等[12]于2014年在非西班牙裔白種人群中進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Arhgap29 基因上 3 個(gè)位點(diǎn)（rs3789688、rs1541098、rs1576593）與NSCL/P 有強(qiáng)相關(guān)性。隨后2017 年P(guān)aul 等人通過(guò)在小鼠基因組中插入從NSCL/P 患者中篩選到的點(diǎn)突變體，構(gòu)建一個(gè)新的Arhgap29基因的無(wú)義突變（K326X）小鼠模型，該突變可能會(huì)導(dǎo)致基因功能缺失（LoF），使Arhgap29 基因沉默進(jìn)而引起唇腭部發(fā)育期上皮連接異常[13]。

本課題組前期通過(guò)大家系樣本測(cè)序，得知Arhgap29 是與NSCL/P 最具相關(guān)性的易感基因之一。因此，本研究選取Arhgap29 上23 個(gè)常見(jiàn)SNP位點(diǎn)進(jìn)行人群驗(yàn)證，探討在寧夏Arhgap29 基因多態(tài)性與非綜合征型唇腭裂是否具有相關(guān)性。

1 對(duì)象及方法

1.1 研究對(duì)象

收集 2014 年 1 月—2018 年 12 月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院口腔頜面外科的唇腭裂患者500 例（男孩 306 例，女孩 194 例）為病例組；本醫(yī)院同期出生的正常新生兒450 例（男孩233 例，女孩217 例）為對(duì)照組。所有樣本均嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行收集，病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：①患兒為先天性NSCL/P 且不伴有其他系統(tǒng)器官的先天性畸形及后天疾??；②患兒家庭無(wú)其他遺傳病家族史；③患兒雙親精神正常，能接受問(wèn)卷調(diào)查者；④患兒父母家庭至少三代為寧夏籍。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：除符合新生兒無(wú)任何系統(tǒng)器官的先天疾病或畸形外還應(yīng)滿足病例組納入標(biāo)準(zhǔn)中的②、③、④。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2015-076），所有樣本收集均征得患者或其監(jiān)護(hù)人知情同意，并簽屬知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本DNA 提取 由經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)的實(shí)驗(yàn)人員采集病例組、對(duì)照組外周靜脈血5 mL，加EDTA 抗凝劑，使用Wizard 基因組DNA 純化試劑盒來(lái)提取純化基因組DNA，再對(duì)所提取的樣本DNA 分別經(jīng)紫外線吸收法和瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定濃度及純度，于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 基因分型 結(jié)合Hapmap 基因庫(kù)、haploview中的tagSNP 及MAF＜0.5 作為選取標(biāo)準(zhǔn)，選取Arhgap29 基因上23 個(gè)常見(jiàn)的SNP，于Ion Torrent測(cè)序平臺(tái)上對(duì)所選SNP 運(yùn)用AgriSeqTM 靶向測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因分型。該方法是在待測(cè)DNA 自動(dòng)構(gòu)建AgriSeqTM 文庫(kù)后，通過(guò)油包水PCR 擴(kuò)增多個(gè)SNP 靶標(biāo)以構(gòu)建穩(wěn)定的測(cè)序模板，再經(jīng)過(guò)純化后進(jìn)行測(cè)序和基因分型。從而達(dá)到鑒定不同基因型的目的。此部分實(shí)驗(yàn)委托博奧生物公司完成（通過(guò)對(duì)生物公司經(jīng)過(guò)多方考察和對(duì)比，公司后期給予質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及驗(yàn)證，可保證數(shù)據(jù)可靠）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)耗材 實(shí)驗(yàn)選用東盛生物科技有限公司生產(chǎn)的5mL EDTA 抗凝采血管（K2）、美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司的臺(tái)式高速離心機(jī)（GS-15R）、德國(guó) Eppendorf 公司的小型高速離心機(jī)（5424R），電熱恒溫水浴箱（上海電子儀器廠（DK-8B））、NanoDrop2000 微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó) Equl-Thermo SCIENTIFIC（ND2000））、美國(guó)普洛麥格 Promega 公司的Wizard 基因組 DNA純化試劑盒（A1120）等儀器和試劑用于提取DNA。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)照組基因分型結(jié)果進(jìn)行H-W 平衡分析；采用SPSS 17.0 軟件對(duì)病例組和對(duì)照組中基因位點(diǎn)的等位基因及基因型頻率進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05；運(yùn)用Haploview 軟件對(duì)這些SNP 位點(diǎn)進(jìn)行連鎖分析和單倍型分析。

2 結(jié)果

2.1 H-W 平衡檢驗(yàn)

Arhgap29 基因常見(jiàn)的23 個(gè)SNP 位點(diǎn)基因型頻率經(jīng)H-W 平衡檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），符合 H-W 平衡（表 1）。

2.2 病例組和對(duì)照組Arhgap29 基因中 23 個(gè)SNP 位點(diǎn)等位基因及基因型分析

23 個(gè)SNP 差異位點(diǎn)中的4 個(gè)位點(diǎn)rs3814019（等位基因=7.763，P=0.0053；基因型=7.907，P=0.019）、rs7540684（等位基因=6.243，P=0.0125；基因型 6.403，P=0.041）、rs17396055（等位基因=4.249，P=0.0393；基因型=7.631，P=0.022）和rs72964308（等位基因=4.74，P=0.0295；基因型=7.907，P=0.019）的基因型和等位基因頻率在病例組與對(duì)照組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.05）（表 2）。

表2 Arhgap29 基因中23 個(gè)SNP 位點(diǎn)等位基因及基因型分析

2.3 連鎖不平衡及單倍型分析

連鎖分析顯示，23 個(gè)SNP 位點(diǎn)形成2 個(gè)連鎖block（單體型塊 1：rs1411700、rs1411701、rs12044 374、rs11196、rs17111203、rs17111206、rs11577575、rs1411702、rs3789691、rs77940435、rs2274788。單體型塊2：rs7554714、rs6541343、rs1999270、rs3814019、rs72964308、rs17111259、rs1756245、rs17396055、rs7540684、rs1360365、rs6697764、rs1756248），2 個(gè)block 共有4 個(gè)單倍型組合在病例組和對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.05）。block 1：?jiǎn)伪缎虲GCAAGGGCGC（P=0.0406）和單倍型AATCGG GGCGT（P=0.0479）。block 2：CGTGCTCGGAGG（P=0.0103）單倍型和 CGTATTCAAAGG（P=0.0336）單倍型（表 3、圖 1）。

3 討論

非綜合征型唇腭裂的病因復(fù)雜，病因涉及遺傳基因和環(huán)境因素以及兩者的交互作用[7]。在非綜合征型唇腭裂的多基因閾值假說(shuō)中，數(shù)個(gè)中效或輕度微效基因會(huì)共同作用，微弱作用疊加達(dá)到一定的閾值從而導(dǎo)致NSCL/P 的發(fā)生，這屬于數(shù)量性狀遺傳[5]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)NSCL/P 易感基因定位篩選不斷更新。從遺傳標(biāo)記分子檢測(cè)，過(guò)渡到以基因芯片為主要手段的全基因組關(guān)聯(lián)研究，到目前主要以二代測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的全基因組或及外顯子組為代表的基因組學(xué)研究，這些都為探究NSCL/P 易感基因及發(fā)病機(jī)制提供了非常重要的線索。

Arhgap29 基因位于染色體1p 22.1 區(qū)域，含有24 個(gè)外顯子，在上皮細(xì)胞中表達(dá)較高，尤其是在口腔、舌、腭上皮中強(qiáng)表達(dá)。該基因距ABCA4基因 47kb，編碼 Rho-GTP 酶活化蛋白 29[14]。Arhgap29 可使 RhoA 由 GTP 限制型變?yōu)?GDP 限制型進(jìn)而失活，從而影響下游效應(yīng)分子ROCK，調(diào)節(jié)細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，使細(xì)胞的分裂、周期異常、上皮細(xì)胞極性的穩(wěn)定性發(fā)生改變，并參與EMT 過(guò)程的調(diào)控[15-17]。針對(duì)此基因與NSCL/P 的研究發(fā)現(xiàn)，Arhgap29 可能在 IRF6 的下游發(fā)揮作用，在IRF6 基因表達(dá)缺失的小鼠腭上皮和皮膚中Arhgap29 基因表達(dá)被抑制[18-19]。Leslie等[20]對(duì)唇腭裂病因?qū)W的研究也進(jìn)行了小鼠模型試驗(yàn)，結(jié)果證實(shí) Arhgap29 與 WNT、IRF6、TGFB等信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)。而這些信號(hào)通路在眾多研究中被證實(shí)與 NSCL/P 的發(fā)病具有強(qiáng)相關(guān)性[18，20-22]。因此可以推測(cè)Arhgap29 是NSCL/P 一個(gè)十分重要的候選基因。

表3 Arhgap29 基因中23 個(gè)SNP 位點(diǎn)單倍型分析

國(guó)內(nèi)尚未有關(guān)于Arhgap29 基因與唇腭裂相關(guān)性的研究，本研究針對(duì)Arhgap29 基因中23 個(gè)常見(jiàn)的SNP 進(jìn)行了單點(diǎn)分析和多點(diǎn)的相關(guān)性分析。H-W 平衡檢驗(yàn)顯示，對(duì)照組的基因型分布符合H-W 平衡，所收集的樣本具有很好的群體代表性。rs3814019、rs72964308、rs7540684 和 rs17396055這4 個(gè)位點(diǎn)的等位基因型和基因型頻率在病例組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雖然與Letra[12]等學(xué)者于2014 年在非西班牙裔唇腭裂白種人群中發(fā)現(xiàn)的Arhgap29 基因上的三個(gè)易感位點(diǎn)（rs3789688、rs1541098、rs1576593）并不一致，但不同人群中導(dǎo)致唇腭裂的位點(diǎn)并不相同是有可能的，這也與NSCL/P 病因?qū)W中的基因和環(huán)境因素協(xié)同影響才會(huì)形成唇腭裂的理論不違背，所以不同位點(diǎn)的確認(rèn)更加確認(rèn)Arhgap29 基因與唇腭裂存在相關(guān)性；基于唇腭裂疾病是多因素疾病，在我們進(jìn)行的多位點(diǎn)的連鎖分析中顯示，23 個(gè)SNP位點(diǎn)形成2 個(gè)連鎖block 中共有4 個(gè)單倍型組合在病例組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。每個(gè)block 中各有2 個(gè)單倍型組合，分別為block1 中的單倍型CGCAAGGGCGC（單倍型頻率=0.278，P=0.0406）、單倍型 AATCGGGGCGT（單倍型頻率=0.097，P=0.0479）和 block2 中的單倍型CGTGCTCGGAGG（單倍型頻率=0.456，P=0.0103）、單倍型 CGTATTCAAAGG（單倍型頻率=0.105，P=0.0336）。病例對(duì)照研究中四個(gè)有意義的位點(diǎn)均位于block2 中，提示block2 是Arhgap29 基因中很有價(jià)值的研究區(qū)域。這為我們后期進(jìn)行Arhgap29 基因與NSCL/P 發(fā)病機(jī)制之間的功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。以上結(jié)果和Arhgap29 基因與眾多易感基因的相關(guān)性均提示Arhgap29 基因多態(tài)性與NSCL/P 之間存在某種關(guān)聯(lián)。

綜上，Arhgap29 單核苷酸多態(tài)性變異與寧夏地區(qū)NSCL/P 人群的發(fā)病有相關(guān)性。這一研究結(jié)果為我們后期進(jìn)行Arhgap29 基因與NSCL/P 發(fā)病機(jī)制之間的功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。