李 欣 李曉琴 李新霞

(1.新疆醫(yī)科大學中心實驗室，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)二科，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊 830011)

肺癌已成為嚴重威脅我國城市人口生命和健康的疾病，非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌總數(shù)的75%～80%，其中約75%的肺癌患者在確診時已經(jīng)是中晚期，失去了最佳的治療時間[1，2]。作為目前臨床上治療非小細胞肺癌的一線用藥，厄洛替尼(Erlotinib)是一種小分子絡氨酸激酶抑制劑，能穿過表皮生長因子(epidermal growth factor receptor, EGFR)過量表達的實體瘤細胞膜，并與EGFR分子的酪氨酸結(jié)構域特異性結(jié)合，阻斷其信號傳導，進而抑制酪氨酸激酶的活性，降低腫瘤細胞的黏附能力，促進腫瘤細胞的凋亡，增加患者對化療的敏感度[3-5]。因此，厄洛替尼對存在EGFR敏感突變或既往化療失敗的晚期NSCLC患者是一類可供選擇的有效藥物。

與常規(guī)化療相比，厄洛替尼的耐受性較好，其不良反應較少而輕，但其主要不良反應，如皮疹、腹瀉、肝功能損害、間質(zhì)性肺炎也不能被低估[6,7]。文獻報道88例服用厄洛替尼治療的患者其血藥濃度相差可達8倍[8]，可見其藥物動力學存在明顯的個體差異性，有必要對其進行血藥濃度監(jiān)測。因此，建立一個快速、靈敏、可靠的方法檢測人血漿中厄洛替尼的濃度，對于指導臨床用藥、實施個體化治療十分重要[9-13]。本實驗擬建立相關高效液相法用于厄洛替尼的生物樣品濃度測定，并在大鼠體內(nèi)初步研究厄洛替尼的藥物動力學。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters)；Waters 2489紫外/可見檢測器(美國Waters)；Sigma 2-16K離心機(德國Sigma)；IKA MS3 basic旋渦混合儀(IKA)；HSC-12A氮吹儀(天津恒奧)。

1.2 試劑

厄洛替尼(純度：99%，廣州珠海嘉成醫(yī)藥有限公司，批號：183319-69-9)；索拉非尼(純度：99%，南京安格醫(yī)藥化工有限公司，批號284461-73-0)。其他試劑均為色譜純。

1.3 動物

SD大鼠，雌雄兼半，體重220±20g，由本校實驗動物中心提供，試驗前未服用其他藥物，飼養(yǎng)2周后進行試驗。所有實驗均遵照新疆醫(yī)科大學實驗動物保護和使用指導執(zhí)行。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的配制

2.1.1厄洛替尼儲備液

精密稱取厄洛替尼10mg置100mL量瓶中，加乙醇并定容至刻度，超聲助溶，即得100mg/L的厄洛替尼儲備液。置于4℃冰箱保存，備用。

2.1.2索拉菲尼儲備液

精密稱取索拉菲尼10mg置100mL量瓶中，加乙醇并定容至刻度，超聲助溶，即得100mg/L的厄洛替尼儲備液。置于4℃冰箱保存，備用。

2.2 血漿樣品的處理

取血漿200μL置肝素抗凝離心管中，加入50μL(20mg/L)內(nèi)標溶液和2mL的處理液(乙腈∶二氯甲烷=4∶1)，超聲助溶10min。3000rpm離心10min。取上清液于45℃氮氣吹干，殘渣用200μL流動相復溶，過0.22μm微孔濾膜，濾液進行HPLC分析。

2.3 測定方法

2.3.1色譜條件

色譜柱為150mm ×4.6mm C18柱(Waters，Milford，USA)；流動相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫程序： 0～23min，V(A)∶V(B)= 48∶52～25∶75；23～25min，V(A)∶V(B)= 25∶75～48∶52。流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；檢測波長249nm；進樣體積10μL。

2.3.2方法的專屬性

在2.3.1項色譜條件下，將一定濃度的厄洛替尼標準溶液加入空白血漿中，按2.2項下操作，進行HPLC分析。同時對處理后的空白血漿和大鼠給藥后的血漿樣品進行HPLC分析。色譜圖見圖1。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及給藥后的代謝產(chǎn)物不干擾厄洛替尼及內(nèi)標的測定，厄洛替尼和內(nèi)標的分離度分別為2.47和1.67。

圖1 血漿中厄洛替尼的色譜圖

2.3.3標準曲線和最低檢測濃度

取空白血漿200μL準確加入厄洛替尼儲備液，使其濃度分別為100、1000、3000、4000、6000和7000μg/L，按2.2項下操作，將測得的厄洛替尼與內(nèi)標峰面積比A對藥物濃度C進行線性回歸?；貧w方程為C=6515.7A-464.5，r=0.9998。在100～7000μg/L與峰面積比呈良好的線性關系，最低檢測濃度為80μg/L (S/N=5)。

2.3.4精密度試驗

配制1000、3000和6000μg/L的厄洛替尼標準血樣各6組，于同一日按2.2項下方法處理后作HPLC分析，計算日內(nèi)精密度；后連續(xù)測定6天，計算日間精密度，見表1。由結(jié)果可知，日內(nèi)及日間精密度相對標準偏差均遠小于15%，達到生物樣品檢測標準。

表1 精密度結(jié)果

2.3.5回收率試驗

厄洛替尼采用1000、3000和6000μg/L為低、中、高3個濃度，用標準品對照法測得實測量，以實測量與加入量之比計算方法回收率；以血樣中厄洛替尼的峰面積與相同濃度厄洛替尼標準溶液的峰面積之比計算厄洛替尼的提取回收率，見表2。由結(jié)果可知，方法回收率高、中、低濃度均大于90%，提取回收率方法回收率高、中、低濃度均大于50%。因此，該血漿樣品處理方法及色譜方法可以用于大鼠血漿中厄洛替尼的含量測定。

表2 回收率結(jié)果

2.3.6樣品穩(wěn)定性

分別考察1000、3000和6000μg/L3個濃度的厄洛替尼標準血漿樣品在-20℃的冰箱中放置30d，反復凍融3次以及血漿樣品按2.2項下處理后用流動相復溶并于室溫下保存24h后的穩(wěn)定性，檢測結(jié)果表明，血漿中厄洛替尼的含量沒有發(fā)生明顯變化，結(jié)果見表3。說明厄洛替尼具有較好的血漿穩(wěn)定性。

表3 樣品穩(wěn)定性

2.4 血漿樣品采集

取6只SD大鼠，雌雄兼半，實驗前1日禁食12h，實驗當日按單劑量方案對大鼠口服灌胃給予厄洛替尼溶液(15mg/kg)。給藥后自由飲食。給藥前取空白血漿，給藥后分別于2、4、6、8、12、24、36、48、72和144h眼眶靜脈取血漿各400μL，分別置于涂有肝素的離心管中， 10900r/min離心5min，取上層血漿200μL于-20℃保存。6只SD大鼠單劑量口服灌胃給予厄洛替尼后體內(nèi)的平均藥-時曲線見圖2，吸收情況與已報道的替尼溶液代謝過程基本一致[14,15]。

圖2 SD大鼠單劑量灌胃給予厄洛替尼藥-時曲線圖

2.5 藥物動力學參數(shù)

以統(tǒng)計矩分析方法估算6只SD大鼠單劑量口服灌胃給予厄洛替尼后的藥物動力學參數(shù)，結(jié)果見表4。SD大鼠口服給予厄洛替尼后的平均藥物動力學參數(shù)與已報道的人類的相關數(shù)據(jù)差異較大，可能是由于物種差異性引起。

表4 大鼠給予厄洛替尼后的主要藥動學參數(shù)

3 討論

本實驗建立了HPLC-UV法測定厄洛替尼血漿樣品濃度的方法，該方法靈敏、可靠、特異性強，適用于藥物代謝動力學研究和治療藥物監(jiān)測[16-18]。樣品處理時采用液-液萃取方法，操作簡單、快速，整個提取系統(tǒng)的回收率較高，雜質(zhì)干擾也較小，在臨床上和實驗中均有較強的適用性。雖然LC-MS/MS方法較本方法有更低的檢測限，但極低濃度的血漿厄洛替尼含量檢測通常只應用于毒理學研究或抑制劑的相關實驗中，而臨床意義不大，LC-MS/MS方法的檢測上限僅僅4000μg/L，這就進一步限制了該方法的使用。而此前報導均采用等度洗脫方式，空白血漿對樣品干擾較大，本實驗采用梯度洗脫方式進行分離，能有效避免血漿本底的干擾。因此，相較于操作復雜、耗時，且價格昂貴的LC-MS/MS方法，本實驗建立的HPLC-UV方法具有更廣泛的實用價值。

此前已有文獻報道了不同給藥方式的厄洛替尼藥動學參數(shù)，但較多局限在連續(xù)服用厄洛替尼數(shù)日后或單劑量靜脈給予厄洛替尼的藥動學參數(shù)，并無單劑量口服給予厄洛替尼的相關報道[19-21]。因此，本研究不僅可以提供靈敏、簡便的檢測方法，更為臨床用藥提供基礎實驗數(shù)據(jù)，以期更好地為臨床患者用藥服務。