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        南珠水解液對H2O2誘導(dǎo)的人晶狀體上皮細胞氧化損傷的保護作用△

        2020-07-24 02:08:46劉鵬岑妍慧林江蘭太進
        眼科新進展 2020年7期
        關(guān)鍵詞:晶狀體白內(nèi)障水解

        劉鵬 岑妍慧 林江 蘭太進

        白內(nèi)障,尤其是老年性白內(nèi)障(age-related cataract,ARC),是全球最常見的眼病之一,已成為第三世界國家中第一位致盲眼病[1]。白內(nèi)障是一種因眼球晶狀體病變而導(dǎo)致晶狀體混濁的疾病,被認為是一種構(gòu)象疾病。晶狀體是人體內(nèi)蛋白質(zhì)含量最高的組織,當其α-晶狀體蛋白發(fā)生氧化損傷時,會導(dǎo)致晶狀體蛋白折疊錯誤增加,加劇蛋白變性,聚集成散射光的聚集體,晶狀體就會混濁,這可能是白內(nèi)障發(fā)生的重要原因[2-3]??偟膩碚f,白內(nèi)障是一種多因素誘發(fā)疾病,與衰老、紫外線輻射、氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、糖尿病、吸煙、酒精等有關(guān)[4]。盡管每種白內(nèi)障的確切病因仍然不清楚,但對許多動物模型和人類的研究表明,白內(nèi)障的形成與晶狀體上皮細胞的應(yīng)激損傷和凋亡有關(guān)[5]。抑制晶狀體上皮細胞的應(yīng)激損傷和凋亡能有效防治白內(nèi)障[6-7]。合浦珍珠產(chǎn)于廣西北海合浦,為中國國家地理標志產(chǎn)品。除了作為名貴、高雅的裝飾品,合浦珍珠還是著名的道地藥材,在我國已有2000多年的藥用歷史[8]?,F(xiàn)代典籍《中華人民共和國藥典》及《中藥大辭典》均記載:“珍珠具有安神定驚、明目去翳、解毒生肌”的功能。合浦珍珠主要活性物質(zhì)包含微量元素、類胡蘿卜素、維生素B、蛋白質(zhì)、小分子多肽、多糖、人體所需的8種必需氨基酸,以及具有特殊活性作用的非蛋白氨基酸,如?;撬岬?,其具有很好的抗氧化活性,自古以來就常出現(xiàn)在各種方劑中[9-10]。本課題組前期已采用果蔬、蜂蜜的有機酸、活性酶低溫水解合浦珍珠,制得合浦珍珠水解液,能完整保留珍珠原質(zhì)中的肽等天然活性物質(zhì),可用作藥品、營養(yǎng)保健品等的原料[11-13]。在本實驗中,通過體外制備過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)人晶狀體上皮細胞(HLEC)氧化損傷模型,探討南珠水解液對氧化損傷的HLEC是否具有保護作用及其機制。

        1 材料與方法

        1.1 主要試劑及儀器HLEC細胞株HLEB3(北京北納聯(lián)創(chuàng)生物技術(shù)研究院),南珠水解液凍干粉(廣西北海市寶珠林海洋科技有限公司);H2O2(美國Sigma公司);完全DMEM培養(yǎng)基、CCK8細胞增殖檢測試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit(MULTI SCIENCES聯(lián)科生物公司);SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所);BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。酶標分析儀(美國Biotek公司);透射電鏡(日本JEOL公司);NovoCyteTM流式細胞儀[艾森生物(杭州)有限公司]。

        1.2 方法

        1.2.1 HLEC的細胞增殖檢測HLEB3細胞培養(yǎng)至70%時消化計數(shù),轉(zhuǎn)移至96孔板中培養(yǎng),每孔加入100×103個細胞,加入不同濃度(0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1)南珠水解液,培養(yǎng)到預(yù)定時間后,每孔加10 μL CCK8檢測試劑,在37 ℃孵育,酶標儀在450 nm波長處檢測培養(yǎng)24 h和48 h每孔的吸光度(A)值,計算細胞存活率,并據(jù)此選擇后續(xù)實驗中南珠水解液濃度。后續(xù)實驗分組:正常對照組,不額外加藥;氧化損傷組,加入H2O2至終濃度為300 μmol·L-1;南珠水解液處理組,加入H2O2至終濃度為300 μmol·L-1,加入南珠水解液至終濃度200 mg·L-1,培養(yǎng)48 h。

        1.2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況收集1×106~3×106個HLEB3細胞,加1 mL PBS 1500 r·min-1離心3 min,洗滌2遍。取300 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細胞。每管各加入3 μL Annexin V-FITC和 5 μL PI-PE。輕輕吹打混勻后,室溫避光孵育10 min。再向每管中加入200 μL 預(yù)冷的1×Binding Buffer?;靹蚝笊狭魇郊毎麅x檢測3組細胞凋亡情況。

        1.2.3 電鏡下觀察3組細胞收集3組細胞。體積分數(shù)2.5%戊二醛溶液固定各組細胞24 h,控制溫度為4 ℃,10 g·L-1鋨酸后固定,0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗。乙醇-丙酮梯度脫水,丙酮-環(huán)氧樹脂梯度包埋,超薄切片機切片70 nm,30 g·L-1醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,電鏡下觀察并拍照。

        1.2.4 3組細胞生化檢測收集3組細胞,破碎細胞提取總蛋白,BCA法測總蛋白濃度,根據(jù)試劑盒說明書進行樣品處理,然后使用酶標儀在對應(yīng)波長處檢測每孔的A值,檢測各組HLEB3細胞內(nèi)谷光甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。

        2 結(jié)果

        2.1 南珠水解液對HLEB3細胞生長的作用在HLEB3細胞培養(yǎng)液中加入南珠水解液,分為4組,濃度分別為0 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1和200 mg·L-1。在培養(yǎng)24 h和48 h后檢測細胞增殖水平,結(jié)果顯示:培養(yǎng)24 h后各組細胞增殖水平無明顯差異;48 h后50 mg·L-1、100 mg·L-1、200 mg·L-1南珠水解液組與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。南珠水解液對HLEB3增殖作用具有一定的劑量依賴效應(yīng),在后續(xù)實驗中選擇200 mg·L-1南珠水解液為最佳處理濃度。見表1。

        表1 不同濃度南珠水解液處理后HLEB3細胞增殖水平

        2.2 南珠水解液對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的HLEB3細胞凋亡作用通過流式細胞儀檢測正常對照組、氧化損傷組和南珠水解液處理組細胞凋亡率,結(jié)果顯示氧化損傷組細胞凋亡率最高,其次是南珠水解液處理組和正常對照組。見表2和圖1。

        圖1 各組細胞凋亡情況 A:正常對照組;B:氧化損傷組;C:南珠水解液處理組

        表2 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡總體情況及早、晚期凋亡情況

        2.3 電鏡觀察各組HLEB3細胞電鏡下正常對照組HLEB3細胞表面絨毛狀結(jié)構(gòu)較多,細胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)較致密,核糖體密布;氧化損傷組HLEB3細胞表面絨毛狀結(jié)構(gòu)較少而且有不少斷裂了,有些細胞胞核皺縮,細胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)較疏松,核糖體分散,可見凋亡小體和空泡;南珠水解液處理組HLEB3細胞相對于氧化損傷組細胞質(zhì)中凋亡小體和空泡較少,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)也更正常。見圖2。

        圖2 各組細胞電鏡觀察結(jié)果 A:正常對照組;B:氧化損傷組;C:南珠水解液處理組

        2.4 南珠水解液對HLEB3細胞抵抗氧化損傷的作用各組細胞中GSH-Px和SOD的酶活性以及MDA含量檢測結(jié)果顯示,氧化損傷組細胞中GSH-Px和SOD的酶活性低于正常對照組,南珠水解液處理組細胞中GSH-Px和SOD的酶活性高于氧化損傷組,且GSH-Px的酶活性高于正常對照組;MDA含量則是氧化損傷組最高,其次是南珠水解液處理組和正常對照組。見表3。

        表3 各組HLEB3細胞中GSH-PX和SOD酶活性及MDA含量比較

        3 討論

        隨著我國人口老齡化的日趨嚴重,ARC發(fā)病率逐年上升,已成為我國第一位致盲眼病,嚴重影響老年人的健康[14]。在發(fā)達國家,大多數(shù)白內(nèi)障可以通過手術(shù)治療,而在資源匱乏的發(fā)展中國家,許多受白內(nèi)障影響的患者無法享受到最先進的治療[15]。所以開發(fā)成本較低的方法來預(yù)防或延遲ARC的形成,并探討它們的防治機制具有重要意義。

        在生理狀態(tài)下,HLEC是眼球晶狀體新陳代謝最活躍部分,其不斷分化為晶狀體纖維細胞,承擔著晶狀體生長、分化及損傷修復(fù)作用,對晶狀體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、水平衡及透明性等方面起到重要作用[5-16]。一旦晶狀體上皮細胞出現(xiàn)病理突變,將會引起晶狀體混濁,導(dǎo)致白內(nèi)障發(fā)生[17]。HLEC凋亡是除先天性白內(nèi)障外各種白內(nèi)障發(fā)生的共同細胞學(xué)基礎(chǔ)[5]。目前公認的白內(nèi)障發(fā)病機制有氧化損傷學(xué)說和細胞凋亡學(xué)說?;钚匝?reactive oxygen,ROS)如H2O2引起的氧化應(yīng)激,是HLEC凋亡的重要調(diào)節(jié)因子,被認為是白內(nèi)障發(fā)生的主要原因[18-19]。因此,預(yù)防H2O2誘導(dǎo)的HLEC氧化應(yīng)激和凋亡可能是延緩白內(nèi)障發(fā)展的重要治療策略。

        珍珠富含多種活性物質(zhì),包含微量元素、類胡蘿卜素、維生素B、蛋白質(zhì)、小分子多肽、多糖、多種氨基酸,常作為主要成分用于防治白內(nèi)障[20-21],本課題組前期已制備好南珠水解液,且本課題組岑妍慧等[22]發(fā)現(xiàn)南珠水解液能促進人微血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移,促進其分泌NO和抑制活性氧分泌,在保護人微血管內(nèi)皮細胞方面發(fā)揮了有效作用。

        本研究通過H2O2誘導(dǎo)構(gòu)建HLEC氧化損傷模型,通過不同濃度的南珠水解液以及不同處理時間觀察對HLEB3細胞生長影響,24 h后各組之間無顯著差異,說明處理液對細胞無毒害作用;48 h后50 mg·L-1南珠水解液組細胞增殖水平高于空白對照組,而100 mg·L-1南珠水解液組細胞增殖水平高于50 mg·L-1組,100 mg·L-1南珠水解液組細胞增殖水平和200 mg·L-1南珠水解液組差異不顯著,說明在48 h時,200 mg·L-1南珠水解液組能夠促進HLEB3生長。而為了更好地說明南珠水解液的作用,我們后續(xù)實驗選擇最佳濃度200 mg·L-1南珠水解液處理細胞。

        本研究通過流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率,發(fā)現(xiàn)氧化損傷組細胞凋亡率最高,南珠水解液處理組細胞凋亡率高于正常對照組、低于氧化損傷組。通過定量分析可見南珠水解液可以抑制由H2O2誘導(dǎo)的HLEB3細胞的早期凋亡和晚期凋亡,且對晚期凋亡抑制作用更顯著,為南珠水解液防治白內(nèi)障提供了初步實驗依據(jù)。

        透射電鏡可以直接觀察到細胞超微形態(tài)變化,本研究觀察到正常對照組HLEB3細胞表面絨毛狀結(jié)構(gòu)較多,細胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)較致密,核糖體密布;氧化損傷組 HLEB3細胞表面絨毛狀結(jié)構(gòu)較少,而且有不少斷裂了,有些細胞出現(xiàn)細胞核皺縮,細胞質(zhì)中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)較疏松,核糖體分散,可見凋亡小體和空泡;南珠水解液處理組HLE-B3細胞相對于氧化損傷組,細胞質(zhì)中凋亡小體和空泡較少,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)也更正常。表明南珠水解液對HLEB3細胞超微結(jié)構(gòu)具有保護作用。

        眾所周知,氧化應(yīng)激的發(fā)生是由于抗氧化防御系統(tǒng)與細胞內(nèi)氧化作用失衡所致[23]。眼晶狀體內(nèi)有一系列抗氧化系統(tǒng),保護其避免氧化損傷。該抗氧化系統(tǒng)由非酶性抗氧化物和酶性抗氧化物組成。非酶性的抗氧化物如谷胱甘肽、類胡蘿卜素、維生素C、維生素E、?;撬岷湍承┪⒘吭氐?,酶性抗氧化物如SOD、GSH-Px等[24]。其中SOD是體內(nèi)最重要的抗氧化酶之一,能有效清除脂質(zhì)過氧化過程產(chǎn)生的超氧陰離子自由基,降低其毒性作用,避免對細胞膜和細胞器的損傷,從而保持細胞結(jié)構(gòu)和功能的正常[25]。GSH-Px是體內(nèi)一種重要的含硒抗氧化酶,能特異性催化谷胱甘肽(glutathione,GSH)對H2O2的還原反應(yīng),能有效清除H2O2,從而發(fā)揮保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用[26]。另外,細胞會產(chǎn)生一些氧化產(chǎn)物,如MDA,為自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物,MDA的含量水平可反映機體內(nèi)細胞脂質(zhì)過氧化程度,常作為判斷脂質(zhì)過氧化的指標[27]。然而,當HLEC氧自由基產(chǎn)生過多和(或)抗氧化能力降低,會誘發(fā)晶狀體蛋白氧化損傷變性,引起晶狀體混濁,最終誘發(fā)白內(nèi)障[28]。在本研究中,各組細胞中GSH-Px和SOD的酶活以及MDA含量生化檢測結(jié)果顯示,氧化損傷組細胞中GSH-Px和SOD的酶活性顯著低于正常對照組,南珠水解液處理組細胞中GSH-Px和SOD的酶活性顯著高于氧化損傷組,且GSH-Px的酶活性顯著高于正常對照組;MDA含量則是氧化損傷組顯著高于南珠水解液處理組和正常對照組。表明南珠水解液通過升高SOD、GSH-Px活性,降低細胞MDA含量來保護HLEB3細胞,能有效防止H2O2誘導(dǎo)的細胞氧化損傷。

        總之,本研究結(jié)果證實南珠水解液具有抗氧化損傷及抗凋亡作用,其作用機制可能與促進抗氧化酶表達、降低活性氧含量有關(guān),但南珠水解液其具體作用機制,通過什么信號通路發(fā)揮保護作用,還有待后續(xù)進一步探討,從而為南珠水解液防治ARC提供更多的實驗依據(jù)和理論支持。

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