王釗，張本尚，王貝貝，劉樹博，楊明成，鄒建*

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450046；2.河南省科學(xué)院同位素研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450015)

視覺，往往是影響消費者購買食品的首要因素，色澤艷麗美觀的食品更易受到人們的青睞[1]，因此，食用色素被廣泛用于食品的感官改善和品質(zhì)提升[2]。在各類色彩中，紅色具有增強食欲和刺激購買欲的特性[3]，深受人們的喜愛。當前食用紅色素主要可分為人工合成紅色素和天然紅色素兩大類[4]。其中，合成紅色素雖然色彩飽滿、性質(zhì)穩(wěn)定、廉價易得[5]；但同時也存在營養(yǎng)價值較低，增加身體臟器負擔(dān)[6]，具有潛在的致癌、致畸、致突變作用，導(dǎo)致兒童智力發(fā)育遲緩，行為性情過激[7]等安全問題。因此，天然紅色素的開發(fā)成為食用紅色素的重要研究方向。

隨著人們對于天然紅色素研究的不斷深入，除著色外，天然紅色素的保健功能(抗菌消炎、降低血脂等)也受到了人們的重視[8,9]。例如，紅棗色素為類黃酮類色素，除著色外，還具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病、降三高等藥效作用，可應(yīng)用于抗癌、抗氧化等保健產(chǎn)品[10]。

在研究過程中，山楂紅色素引起了人們的興趣。山楂在我國分布廣泛、產(chǎn)品豐富，河南省是山楂的主要產(chǎn)區(qū)之一。新鮮山楂又稱紅果，富含多種營養(yǎng)成分，是我國的傳統(tǒng)美食之一，可直接食用并有益于人體健康[11]。新鮮山楂經(jīng)釀造后可獲得兼具鮮艷紅色外觀、酸甜口味、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點的山楂醋[12]，是時下廣受好評的美味保健類天然飲品。山楂干粉碎可入藥，具有助消化、降低血脂血壓、防止血管粥樣硬化、抗菌消炎、止痛止血等功效[13]。山楂紅色素提取自山楂，含有可溶性糖、酸類和黃酮類物質(zhì)，屬于天然花青素類色素，具有防癌抗癌、保護大腦、保肝護腎等多重保健功效[14,15]。此外，研究表明山楂紅色素具有良好的抗氧化和著色能力，同時能夠從保鮮和美化兩方面提升產(chǎn)品品質(zhì)，并常常用于食品的風(fēng)味調(diào)和。例如，使用山楂紅色素代替胭脂紅素添加在健胃消食咀嚼片中，既可利用其酸度促進消化，又可以很好地改善消食咀嚼片的外觀顏色[16]。又如，富含山楂紅色素的玫瑰軟糖，色澤紅潤，味道醇美，還具有抗疲勞、抗氧化和降血脂等作用[17]。此外，富含山楂紅色素的菊花、洛神花復(fù)合果醬色澤紫紅艷麗，口感細膩，酸甜適中，又兼具保健功能。迄今為止，山楂紅色素已廣泛用于果汁、果醬、果醋飲品和糕點甜品等多種食品產(chǎn)品中，增色增味，提升品質(zhì)。

鑒于山楂紅色素的優(yōu)秀品質(zhì)，本文擬通過有機溶劑提取法對山楂紅色素進行提取，并優(yōu)化其工藝條件。在參考相關(guān)提取工藝方案后[18,19]，引入超聲波輔助提取手段，并通過正交實驗法對各單因素提取條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

新鮮山楂：購于鄭州市大學(xué)路丹尼斯超市；無水乙醇(分析純)：天津富宇精細化工有限公司。

1.2 實驗儀器

HWCL-3型集熱式恒溫磁力攪拌浴 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；Hei-VAP Precision HL型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國海道夫(Heidolph)儀器公司；KQ5200E型超聲波清洗器 昆明市超聲儀器有限公司；FA3204B型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；TU-1901型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；FreeZone型真空冷凍干燥儀 美國LABCONCO儀器公司。

1.3 實驗步驟

1.3.1 山楂的預(yù)處理

由于鮮山楂富含多種營養(yǎng)成分和色素，直接于空氣中進行切片、粉碎等操作會發(fā)生氧化作用而影響其品質(zhì)；并且鮮山楂水分較多，直接處理會導(dǎo)致有效成分的大量流失，對實驗結(jié)果造成不利影響，故而需對鮮山楂進行干燥處理。雖然烘干等高溫處理方式具有良好的干燥效果，但在加熱過程中將不可避免地對山楂紅色素及其他成分產(chǎn)生不利影響，因此，本文采取冷凍干燥法，根據(jù)文獻報道的方法對山楂進行處理[20]。將干燥好的山楂粉碎，過篩，密封，置于干燥器中備用。

1.3.2 最大吸收波長的確定

稱取1.0 g山楂粉末，加入50 mL濃度為95%的乙醇溶液浸泡20 min，超聲波處理40 min，在50 ℃條件下加熱回流50 min，過濾后定容稀釋，用95%乙醇溶液做參比溶液，利用紫外可見分光光度計全波段掃描，按照文獻報道[21]，在200～700 nm波長范圍內(nèi)確定最大吸收波長值。

1.3.3 單因素實驗條件設(shè)計

分別設(shè)置乙醇濃度(50%、55%、60%、65%、70%)、料液比(1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85)、提取溫度(30，40，50，60 ℃)、超聲時間(20，30，40 min)、提取時間(30，40，50，60，70，80，90 min)5個單因素，在排除對提取效率影響最小的因素后，保持余下4個單因素條件中的3個因素不變，探究另一個因素變化對提取山楂紅色素的影響，在此基礎(chǔ)上進一步對單因素條件進行優(yōu)化，直至達到最優(yōu)水平。

1.3.4 正交實驗設(shè)計

通過對單因素實驗結(jié)果的分析，在其基礎(chǔ)上選擇乙醇濃度、料液比、超聲時間、提取時間4個因素中的較優(yōu)水平，選用L9(34)正交實驗水平表，設(shè)計正交實驗，進一步優(yōu)化提取山楂紅色素的工藝條件。

1.3.5 平行重復(fù)驗證實驗

在正交實驗得出的最佳提取條件下重復(fù)三次提取，對正交實驗的結(jié)果進行驗證，分析驗證實驗的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

色素溶液用95%乙醇稀釋后，在波長200～700 nm范圍內(nèi)出現(xiàn)了最大吸收波長(見圖1)，其最大吸收波長峰值在291 nm處，因此后續(xù)單因素實驗的吸光度值測定波長均為291 nm。

圖1 山楂紅色素最大吸收波長的確定Fig.1 Determination of maximum absorption wavelength of hawthorn red pigment

2.2 單因素條件對提取效果的影響

2.2.1 乙醇濃度變化對提取效果的影響

稱取5份1.0 g的山楂粉末，分別量取不同濃度的乙醇溶液(50%、55%、60%、65%、70%)，保持料液比1∶60、超聲時間40 min、提取溫度50 ℃、提取時間50 min不變，過濾后定容，在291 nm波長下分別測定不同濃度乙醇提取液的吸光度值，結(jié)果見圖2中(a)。

(a)

由圖2中(a)可知，當乙醇濃度增大時，提取效率隨之增大，乙醇濃度為65%時為最大值；此后繼續(xù)增大乙醇濃度時溶液的吸光度值有所下降(70%)。因此以乙醇濃度65%為中心，對其兩側(cè)的乙醇濃度進行篩選，進行精確定位乙醇濃度的實驗，實驗結(jié)果見圖2中(b)，當乙醇濃度以63%-65%-67%的比例遞增時，測得的吸光度值依然以65%時最大，因此選擇65%為最佳乙醇濃度條件。

(b)

2.2.2 不同料液比對色素提取的影響

稱取5份1.0 g的甜椒粉，分別按照料液比1∶60、1∶65、1∶70、1∶75、1∶80、1∶85的比例準確量取65%的乙醇溶液，經(jīng)超聲處理后(40 min)，在50 ℃油浴中恒溫提取50 min，過濾后定容，在波長291 nm處測其吸光度值，見圖3。

圖3 不同料液比對提取效果的影響Fig.3 The effect of different solid-liquid ratios on extraction effect

由圖3可知，當料液比增大時，提取效率隨之增大，料液比1∶80時為最大值；此后繼續(xù)增大料液比(1∶85)溶液的吸光度值有所下降，因此，從節(jié)約材料的角度考慮，以1∶80為最佳料液比條件。

2.2.3 不同超聲時間對色素提取的影響

分別稱取3份1.0 g的山楂粉，按照料液比1∶80加入濃度為65%的乙醇溶液，經(jīng)超聲處理(20，30，40 min)后，在50 ℃油浴條件下恒溫提取50 min，過濾后定容，在波長291 nm處平行測量吸光度值，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，提取效率隨超聲時間增長而提高，當超聲時間為30 min時，溶液的吸光度值最大，繼續(xù)延長超聲時間至40 min，吸光度值反而下降。這是因為適當?shù)某暡ㄗ饔脮r間，可利用其空化作用和機械作用增大色素與提取劑接觸面積，提高色素溶解程度；過長的超聲作用，可能會對色素造成破壞，降低有效成分含量，不利于色素提取。故提取條件中最佳超聲波作用時間為30 min。

圖4 不同超聲波時間對提取效果的影響Fig.4 The effect of different ultrasonic time on extraction effect

2.2.4 不同提取時間對色素提取的影響

稱取7份1.0 g的山楂粉，按照乙醇濃度65%、料液比1∶80、超聲時間30 min、提取溫度50 ℃的提取條件分別提取不同時間，過濾后定容，在波長291 nm處測量吸光度值，結(jié)果見圖5。

圖5 不同提取時間對提取效果的影響Fig.5 The effect of different extraction time on extraction effect

由圖5可知，提取時間在30～70 min內(nèi)吸光度值逐漸增大，在70 min時吸光度值達到最大；當提取時間分別延長至80 min和90 min時，吸光度值略有下降且趨于穩(wěn)定，說明在此提取條件下色素已全部溶于提取劑。故山楂紅色素提取時間以70 min為佳。

2.2.5 不同提取溫度對色素提取的影響

分別準確稱取4份1.0 g的山楂粉，按照前面已經(jīng)確定的乙醇濃度(65%)、料液比(1∶80)、超聲時間(30 min)、提取時間(70 min)，在不同的油浴溫度(30，40，50，60 ℃)下提取，過濾后定容，在波長291 nm處分別測量吸光度值，結(jié)果見圖6中(a)。

由圖6中(a)可知，提取效率隨提取溫度的上升而上升，在30～50 ℃范圍內(nèi)，提取溫度越高，提取效果越好，50 ℃時吸光度值最大，60 ℃時吸光度值有所下降。因此，以50 ℃為中心對其兩側(cè)的溫度(45，55 ℃)進行篩選，實驗結(jié)果見圖6中(b)，與50 ℃時吸光度值相比，45 ℃條件下的吸光度值更大，因此45 ℃為最佳提取溫度。

(a)

(b)

2.3 正交實驗確定最優(yōu)提取條件

通過對各個單因素實驗結(jié)果的分析，固定提取溫度為45 ℃不變，選取乙醇濃度(60%、65%、70%)、料液比(1∶75、1∶80、1∶85)、超聲時間(20，30，40 min)、提取時間(60，70，80 min)進行四因素三水平正交實驗，篩選最優(yōu)提取方案，具體實驗方案見表1，實驗結(jié)果見表2。

表1 L9(34)正交實驗因素水平設(shè)計表Table 1 The factors and levels design table of L9 (34) orthogonal experiment

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

由表2中極差R值可知，山楂紅色素提取條件中4個因素對提取效果存在不同程度的影響，各影響因素對提取效果的影響力為：A(乙醇濃度)>B(料液比)>D(提取時間)>C(超聲時間)，其中最重要的影響因素是乙醇濃度。由正交實驗結(jié)果可知，提取山楂紅色素的最優(yōu)方案是A3B3C3D2，即乙醇濃度70%、料液比1∶85、超聲時間40 min、提取時間70 min。

2.4 最優(yōu)工藝條件驗證實驗

由于最佳提取方案并未出現(xiàn)在正交實驗表中，為確保其真實性，在該提取工藝條件下進行了3 組重復(fù)驗證實驗，并取其平均值。由表3可知，驗證實驗結(jié)果具有代表性，表明該提取工藝條件是合理可行的，重現(xiàn)性好。

表3 重復(fù)實驗結(jié)果Table 4 Repeated results of orthogonal experiment

3 結(jié)論與建議

通過對山楂粉中山楂紅色素提取的單因素條件進行篩選，結(jié)果表明在單因素實驗中每個單因素最佳條件分別為：乙醇濃度65%、料液比1∶80、超聲時間30 min、提取時間70 min、提取溫度45 ℃。通過對單因素實驗分析，因溫度變化對提取效果影響微弱，固定提取溫度不變，其余4個單因素經(jīng)正交實驗設(shè)計，最佳提取工藝方案是：提取溫度45 ℃、乙醇濃度70%、料液比1∶85、提取時間70 min、超聲時間40 min。通過3次平行重復(fù)驗證實驗，所得吸光度值重現(xiàn)性較好，說明此工藝條件對山楂紅色素的提取具有明顯優(yōu)勢。

通過本文的研究，為高效提取山楂紅色素提供了思路，而豐富的山楂紅色素產(chǎn)品可以更好地滿足我國食品加工行業(yè)對其的需求，獲得更多兼具色、香、味和保健功效的食品和飲品，提升經(jīng)濟和社會效益。