杜麗霞，陳明，朱文濤，姜子濤,2*

(1.天津天獅學(xué)院 食品工程學(xué)院，天津 301700；2.天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134)

排草具有濃郁的香氣，是近年來(lái)在麻辣火鍋、干鍋、鹵菜中普遍使用的一種調(diào)味香料，具有增香、去腥和防腐的作用。排草又名排草香、香排草、香草等，正名為細(xì)梗香草(LysimachiacapillipesHemsl.)，報(bào)春花科珍珠菜屬多年生草本植物[1,2]。在我國(guó)的貴州、四川、湖北、江西、廣東等地以及印度、斯里蘭卡、緬甸等地均有分布。排草的化學(xué)成分主要為皂苷[3-5]、揮發(fā)油[6]和黃酮。排草揮發(fā)油可用于調(diào)配化妝品及煙草用香精。排草中的皂甙(主要是三萜類(lèi)皂甙)具有非常強(qiáng)的抗腫瘤活性。排草作為中草藥已有兩千多年的歷史，具有很高的藥用價(jià)值，可用于治療水腫、浮腫、腫瘤等疾病。國(guó)內(nèi)外對(duì)排草化學(xué)成分的研究主要集中在皂甙的分離鑒定以及皂甙的抗腫瘤活性[7-14]，而關(guān)于揮發(fā)油和黃酮類(lèi)化合物的研究則極少報(bào)道。由從前面的研究可知，排草中的黃酮主要是山奈酚和槲皮素兩大類(lèi)[15,16]。已報(bào)道的排草黃酮提取方法是以水或乙醇作為提取劑的傳統(tǒng)提取法[17]，前者由于提取劑極性較強(qiáng)，存在著黃酮提取不完全、雜質(zhì)多的問(wèn)題；同時(shí)這兩種方法均存在提取時(shí)間長(zhǎng)、提取效率低等缺陷。

本研究采用超聲波輔助提取法提取排草黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交法確定了排草黃酮的最佳提取條件，并利用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)所獲得的排草黃酮進(jìn)行提純；測(cè)定了排草黃酮清除二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基和抗氧化活性，并與食用抗氧化劑維生素C(Vc)進(jìn)行了比較，為排草及黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用提供了可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

排草樣品：購(gòu)于天津市武清藥店，粉粹后過(guò)40目篩，置于廣口瓶中避光保存。蘆?。荷虾Ｔ慈~生物科技有限公司；DPPH：美國(guó)Sigma公司；Vc：北京譜析科技有限公司；乙醇：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；DM130、D101、AB-8、HPD-600和HPD-100 5種大孔樹(shù)脂：天津南大樹(shù)脂科技有限公司提供，使用前按照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行預(yù)處理；試驗(yàn)用水均為去離子水，所用試劑均為分析純。

U3900型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日立高新技術(shù)公司；UV1000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；YM-650CT型多用途恒溫超聲提取儀 上海豫明儀器有限公司；LGJ-10NS型冷凍干燥機(jī) 北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 排草黃酮的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的排草粉末，置于具塞三角瓶中，按照一定的料液比加入一定濃度的乙醇溶液，加蓋后置于超聲波儀中，設(shè)定好提取溫度和提取時(shí)間后進(jìn)行提取，最后將提取液在4000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，取上清液備用。

1.2.2 排草黃酮得率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品15 mg，加甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容并混勻，配制成150 μg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后按照參考文獻(xiàn)[19]中的方法進(jìn)行顯色和測(cè)定，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

準(zhǔn)確吸取制得的排草黃酮溶液1 mL置于25 mL容量瓶中，從加水至6 mL開(kāi)始，按照參考文獻(xiàn)[19,20]的方法進(jìn)行顯色測(cè)定，將測(cè)得的吸光度值帶入上述的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，然后按照此式計(jì)算黃酮得率：黃酮得率(%)=C·V/10M。式中：C為由線(xiàn)性回歸方程計(jì)算出的黃酮提取液濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 排草黃酮提取條件的優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：選取乙醇濃度、提取溫度、料液比和提取時(shí)間4個(gè)因素，每個(gè)因素選取5個(gè)水平，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定每個(gè)因素中提取排草黃酮的最優(yōu)水平。正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素試驗(yàn)中確定的最優(yōu)水平，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)L9(34)，通過(guò)正交試驗(yàn)得到排草黃酮的最佳提取工藝條件[21]。

1.2.4 排草黃酮純化條件的優(yōu)化

將經(jīng)活化后的DM130、D101、AB-8、HPD-600和HPD-100 5種大孔樹(shù)脂分別裝入玻璃層析柱中，然后通過(guò)吸附和解吸試驗(yàn)篩選出純化效果最好的一種，最后對(duì)上樣液pH、上樣流速、洗脫液乙醇濃度及洗脫流速4個(gè)單因素進(jìn)行優(yōu)化[22]，得到排草黃酮的最佳純化條件。

1.2.5 排草黃酮抗氧化活性

將經(jīng)過(guò)純化后的排草黃酮凍干粉配制成10～100 μg/mL的溶液，從不同濃度的排草黃酮溶液中各取0.6 mL分別放于10支編號(hào)的比色管中，各加入6 mL 0.06 mmol/L DPPH溶液，混勻后避光靜置30 min，在507 nm下測(cè)定吸光度值，記作Ar(1～10)；取0.6 mL 80%乙醇溶液，再加6 mL 0.06 mmol/L DPPH溶液，混勻后避光靜置30 min，測(cè)定吸光度值，記作Ac；從不同濃度的排草黃酮溶液中各取0.6 mL分別放于10支編號(hào)的比色管中，各加入6 mL 80%乙醇溶液，混勻后避光靜置30 min，測(cè)定吸光度值，記作Ax(1～10)。按下列公式計(jì)算各濃度排草黃酮溶液的清除率。以橫坐標(biāo)為樣品濃度、縱坐標(biāo)為清除率，繪制純化后的排草黃酮清除率曲線(xiàn)，并按照此式計(jì)算清除率IC50值：清除率(%)=(Ac-Ar+Ax)/Ac×100。

同上，繪制Vc對(duì)DPPH自由基的清除率曲線(xiàn)，計(jì)算IC50值，將兩者的半數(shù)清除率進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)純化后排草黃酮的清除自由基能力及抗氧化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

按照1.2.2的方法測(cè)得的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性回歸方程為y=0.329x+0.0088(R2=0.9995)，線(xiàn)性關(guān)系良好，排草提取液黃酮濃度均用此方程進(jìn)行計(jì)算。

2.2 提取排草黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果

排草黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 單因素對(duì)排草黃酮得率的影響Fig.1 Effect of single factors on the yield of flavonoids from L. capillipes

由圖1中(a)可知，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，排草黃酮的得率最高；當(dāng)乙醇濃度低于60%時(shí)，部分醇溶性的黃酮未被充分提取出來(lái)；當(dāng)乙醇濃度高于60%時(shí)，部分水溶性的黃酮未被充分提取出來(lái)，因此選擇60%為最佳乙醇濃度。由圖1中(b)可知，隨著料液比增大，排草黃酮得率增高，當(dāng)料液比在1∶20～1∶50之間時(shí)，黃酮得率增高速度大幅減緩，在保障黃酮得率的同時(shí)，為了減少提取劑的用量，降低成本，保護(hù)環(huán)境，最終選擇1∶30為最佳的料液比。由圖1中(c)可知，隨著提取時(shí)間增長(zhǎng)，排草黃酮得率增高，當(dāng)提取時(shí)間為80～100 min時(shí)，黃酮得率增高不明顯。為提高提取效率，選擇80 min為最佳的提取時(shí)間。與文獻(xiàn)[17]比較可知，超聲波輔助提取能夠明顯提高黃酮的提取效率，提取時(shí)間較傳統(tǒng)的溶劑提取法縮短了一半以上。這是因?yàn)槌暡艽偈怪参锏募?xì)胞組織破壁或變形，使黃酮成分提取更充分。由圖1中(d)可知，提取溫度為50 ℃時(shí)，排草黃酮的得率最高；當(dāng)提取溫度較低時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)較慢，不利于黃酮的溶出；當(dāng)提取溫度過(guò)高時(shí)，黃酮類(lèi)化合物會(huì)受熱分解而損失掉，因此選擇50 ℃為最佳提取溫度。

2.3 提取排草黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Orthogonal test results

由表1可知，影響排草黃酮得率的因素主次為：料液比>乙醇濃度>提取溫度>提取時(shí)間。正交試驗(yàn)所得排草黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度50%，料液比1∶40(g/mL)，提取時(shí)間80 min，提取溫度50 ℃。在此條件下平行提取3次，得到的排草黃酮得率分別為3.14%、3.18%、3.15%，平均值為3.16%。

2.4 大孔樹(shù)脂的篩選

2.4.1 大孔樹(shù)脂的靜態(tài)吸附與解吸

5種不同類(lèi)型的大孔樹(shù)脂對(duì)排草黃酮的吸附和脫附結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 5種大孔樹(shù)脂對(duì)排草黃酮的靜態(tài)吸附率與解吸率Table 2 Static adsorption rate and desorption rate of fivemacroporous resins on flavonoids from L. capillipes %

由表2可知，型號(hào)為HPD-100的大孔樹(shù)脂對(duì)排草黃酮的吸附和脫附效果均最好，因此選擇型號(hào)為HPD-100的大孔樹(shù)脂對(duì)排草黃酮進(jìn)行純化。

2.4.2 吸附及解吸動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

由圖2吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)中可知，0～70 min時(shí) HPD-100大孔樹(shù)脂對(duì)排草黃酮的吸附速度比較快，而在70～250 min吸附速度逐漸放緩并趨于平穩(wěn)，此時(shí)大孔樹(shù)脂吸附量達(dá)到飽和，計(jì)算出HPD-100大孔樹(shù)脂對(duì)排草黃酮的最大吸附量為14.58 mg/g濕樹(shù)脂。由圖2解吸動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)中可知，0～60 min時(shí)乙醇溶液對(duì)排草黃酮解吸速度較快，但60 min之后趨于平穩(wěn)。

圖2 HPD-100樹(shù)脂對(duì)排草黃酮的吸附及解吸動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig.2 Adsorption and desorption kinetic curves of HPD-100resin on flavonoids from L. capillipes

2.5 排草黃酮純化條件的優(yōu)化

2.5.1 上樣液pH值及洗脫液乙醇溶液濃度的確定

由圖3中(a)可知，HPD-100大孔樹(shù)脂的吸附效果受上樣液pH值的影響較大，上樣液pH為8時(shí)吸附效果最差，這是因?yàn)榕挪蔹S酮具有多酚結(jié)構(gòu)，在堿性環(huán)境中，黃酮分子羥基中的H+離去，黃酮化合物形成離子結(jié)構(gòu)，極性增強(qiáng)，故不易被吸附。因黃酮顯弱酸性，故在酸性和弱酸性條件下易被吸附，但試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH繼續(xù)降低時(shí)黃酮粗品溶解度降低，可能是因?yàn)閜H繼續(xù)降低，達(dá)到排草黃酮的等電點(diǎn)，上樣液不穩(wěn)定，所以上樣液pH為4時(shí)吸附效果最好。由圖3中(b)可知，洗脫液乙醇濃度為80%時(shí)，解吸下來(lái)的排草黃酮量最多，因此使用80%的乙醇溶液作為最佳的洗脫液。

圖3 上樣液pH值及洗脫液乙醇溶液濃度對(duì)純化效果的影響Fig.3 Effect of pH of loading buffer and ethanol solution of eluent on purification effect

2.5.2 上樣流速及洗脫流速的確定

由圖4中(a)可知，當(dāng)上樣流速為2 BV/h時(shí)，泄漏點(diǎn)出現(xiàn)的較早，此時(shí)排草黃酮由于流速過(guò)快而未被充分吸附到柱子上；當(dāng)上樣流速為1.5 BV/h和1 BV/h時(shí)泄漏點(diǎn)出現(xiàn)的時(shí)間差不多，上樣體積均大于2 BV/h時(shí)，且1.5 BV/h的上樣量比1 BV/h時(shí)略大。因此，最終選擇最佳上樣流速為1.5 BV/h。由圖4中(b)可知，當(dāng)洗脫流速為1.5 BV/h時(shí)，排草黃酮的洗脫效果最佳。當(dāng)洗脫流速增加時(shí)，乙醇會(huì)以略快的流速流經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂，不能充分滲入樹(shù)脂內(nèi)部，無(wú)法將樹(shù)脂內(nèi)的排草黃酮全部解吸出來(lái)，從而致使洗脫效果下降。而當(dāng)洗脫流速過(guò)慢時(shí)，乙醇會(huì)在大孔樹(shù)脂中停留過(guò)久，使黃酮的峰寬較大，時(shí)間更長(zhǎng)，洗脫效果不好，因此選擇最佳洗脫流速為1.5 BV/h。

圖4 上樣流速及洗脫流速對(duì)純化效果的影響Fig.4 Effect of flow rate of loading buffer and eluent on purification effect

2.6 排草黃酮抗氧化活性的研究

按照1.2.5中的方法測(cè)定排草黃酮及Vc清除DPPH自由基的曲線(xiàn)，得到排草黃酮清除率回歸方程為Y=-0.01X2+1.9609X-7.9433(R2=0.9965)。經(jīng)計(jì)算排草黃酮對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為36.25 μg/mL。Vc清除率回歸方程為Y=-0.0119X2+2.1058X+0.2917(R2=0.9665)，經(jīng)計(jì)算，Vc對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50為28.05 μg/mL。綜上所述，排草黃酮的抗氧化活性與Vc比較稍差，但仍然具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

3 結(jié)論

超聲波輔助法提取排草黃酮的最佳條件為：提取時(shí)間80 min，提取溫度50 ℃，乙醇濃度50%，料液比1∶40，在最佳提取工藝條件下排草黃酮的得率為3.16%；最佳純化條件為：選取HPD-100型號(hào)的大孔樹(shù)脂，上樣液pH為4，上樣流速為1.5 BV/h，洗脫劑乙醇濃度為80%，洗脫流速為1.5 BV/h，經(jīng)純化后排草黃酮的純度由原來(lái)的24.8%提高到68.1%，純化效果較好；排草黃酮對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50值為36.25 μg/mL，與Vc比較稍差，但仍然表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，是一種可開(kāi)發(fā)的高效、天然的抗氧化劑。