史宗勇，陳子言，祁琛，王成，趙夢曉，李夏瑩，王文斌，袁建琴，許冬梅，喬永剛，劉建東，張秀杰*，高建華*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 晉中030801；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心，北京100025）

在對轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品進(jìn)行成分檢測的過程中，必須設(shè)置相應(yīng)的陽性對照用于對檢測結(jié)果的判定。常用的核酸陽性對照通常有2種[1]：一種是特定的轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化體的基因組DNA（genomic DNA,gDNA）。目前，很多國家都在研發(fā)這類基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（certified reference materials, CRMs）。其中，比較有代表性的是歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和測量研究所委員會（Institute for Reference Materials and Measurements European Commission,IRMM）研發(fā)的一系列的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。這類陽性對照物質(zhì)最具代表性，但是其制備流程煩瑣，價格昂貴[2-3]。另一種是含有特定檢測序列的質(zhì)粒分子。質(zhì)粒分子既可以包括1 種特異性檢測序列，稱為單靶標(biāo)檢測質(zhì)粒（single target plasmid, STP），也可以包括多種特異性檢測序列，稱為多靶標(biāo)檢測質(zhì)粒（multiple target plasmid,MTP）[3-6]。研究表明，上述質(zhì)粒分子作為陽性分子時，效果與gDNA一致，可以作為理想的gDNA替代品[3,7-9]。當(dāng)然，質(zhì)粒分子作為陽性對照還有諸多優(yōu)勢，比如制備過程簡單快捷，且成本低廉。尤其是MTP不僅可以同時包含一個物種的多種靶標(biāo)序列，還可以包含不同物種的靶標(biāo)序列，具有極大的靈活性，可以自由定制。因此，構(gòu)建合理的MTP作為陽性質(zhì)粒分子是目前轉(zhuǎn)基因成分檢測領(lǐng)域的重要研究內(nèi)容。

大豆是重要的經(jīng)濟(jì)作物，也是轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用非常成熟的靶標(biāo)之一。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用機(jī) 構(gòu)（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications, ISAAA）統(tǒng)計，自1996 年以來，轉(zhuǎn)基因大豆的種植面積逐年增加，2017 年的種植面積占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的50%，約9 490萬hm2。在全球1.2億hm2的大豆種植面積中，約77%為轉(zhuǎn)基因大豆[10]。目前，我國尚未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因大豆的商業(yè)化種植。但是，因加工等領(lǐng)域的大量需求，我國每年要進(jìn)口大量的大豆種子，其進(jìn)口量位居所有進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品首位。而大豆主要出口國，包括美國、巴西和阿根廷等的栽培大豆主要為轉(zhuǎn)基因品種。因此，對這些大豆在進(jìn)口過程中的檢驗檢測和進(jìn)入國內(nèi)市場后的監(jiān)督管理顯得尤為重要和迫切。截至2019年1月8日，我國共批準(zhǔn)了14種轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體（A2704-12、A5547-127、CV127、DAS-44406-6、DP305423、DP356043、FG72、GTS40-3-2、MON87701、MON87705、MON87708、MON87769、MON89788 和 SYHT0H2）和 2 種 雜 交 品 系（DP305423×GTS40-3-2 和MON87701×MON89788）的進(jìn)口，用作加工原料（http://www.moa.gov.cn/）。需要特別指出的是，這些批準(zhǔn)進(jìn)口的大豆產(chǎn)品不允許用于種植。另外，我國在轉(zhuǎn)基因大豆方面的研發(fā)也逐漸趕上了國際先進(jìn)水平。比如，上海交通大學(xué)曹越平課題組自主研發(fā)的耐除草劑大豆SHZD32-1[11]（選用的是杭州瑞豐生物科技有限公司研發(fā)的G10-epsps基因[12]），對除草劑草甘膦表現(xiàn)出良好的耐受性，具有極大的市場應(yīng)用前景。

為方便對上述轉(zhuǎn)基因大豆的檢測和監(jiān)管，需要全面準(zhǔn)備相應(yīng)的陽性物質(zhì)。如果利用gDNA作為陽性物質(zhì)，需要對上述十幾種轉(zhuǎn)化體提取基因組DNA，并分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)，工作量較大，且成本較高。如果將上述轉(zhuǎn)化體的特征序列接入質(zhì)粒載體，則將免去相應(yīng)轉(zhuǎn)基因作物的生產(chǎn)、gDNA的制備等煩瑣過程，能夠縮短生產(chǎn)周期并降低成本。目前，已有多種大豆轉(zhuǎn)化體的多靶標(biāo)質(zhì)粒分子被報道，這些MTP主要分為2類。一類是針對單一轉(zhuǎn)化體，但含有多個檢測靶標(biāo)序列的MTP 分子，該質(zhì)粒包含特定轉(zhuǎn)化體的多個特征序列，還有相應(yīng)的大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因等。比如，李飛武等構(gòu)建了MON89788的檢測質(zhì)粒，其包含大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因（大豆凝集素基因Lectin）的檢測序列以及MON89788 的T-DNA插入位點兩端的特征序列[13]。ZHANG 等構(gòu)建了2種專用于檢測GTS40-3-2的陽性質(zhì)粒，并進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，對靶標(biāo)序列的適當(dāng)間隔有利于提高檢測的可靠性和特異性[14]。許麗等也研制了GTS40-3-2的檢測標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒[15]。目前，我國已批準(zhǔn)并在售的轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒只有1 種——GBW10092，可用于對MON89788的檢測和篩查（http://www.ncrm.org.cn）。另一類是針對多個轉(zhuǎn)化體的MTP 分子。PI 等構(gòu)建了一個含有多個轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體特征序列的陽性質(zhì)粒pSOY，該質(zhì)粒包含MON89788-5′、A2704-12-3′、A5547-127-3′、DP356043-5′、DP305423-3′、A2704-12-5′和A5547-127-5′等的特征序列，可用來對這幾種轉(zhuǎn)化體及其衍生物進(jìn)行篩查[5]。

綜上所述，我國已有的可用于轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體特異性篩查的陽性質(zhì)粒分子種類不多，并且能夠檢測的轉(zhuǎn)化體數(shù)量較少，無法滿足目前轉(zhuǎn)基因大豆品種推新和監(jiān)測需求。因此，本文構(gòu)建了一種可編輯的、涵蓋18種轉(zhuǎn)化體的多靶標(biāo)質(zhì)粒pDDID-1905。該質(zhì)粒包含我國已經(jīng)批準(zhǔn)進(jìn)口（食用或飼用）的14種獨(dú)立轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體，3 種暫未批準(zhǔn)進(jìn)口但應(yīng)用潛力較高的重要轉(zhuǎn)化體，以及我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的重要轉(zhuǎn)化體SHZD32-1的特征序列。該質(zhì)粒也適用于我國批準(zhǔn)進(jìn)口的DP305423×GTS40-3-2和MON87701×MON89788 雜交品系鑒定。總之，質(zhì)粒pDDID-1905 作為陽性分子覆蓋度全面，具有重要的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試劑：Taq預(yù)混液（Ex TaqVersion 2.0）（TaKaRa公司，日本）；AxyPrepTM微型質(zhì)粒制備試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ、XhoⅠ[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；標(biāo)準(zhǔn)DNA 分子1 kb plus DNA 梯形帶和DL2000 DNA標(biāo)志物[中科瑞泰（北京）生物科技有限公司]。DNA序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

大腸埃希菌（Escherichia coli）TOP10 菌株以及pUC18質(zhì)粒，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)督檢驗測試中心（合肥）饋贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 信息收集

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部每年發(fā)布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書（進(jìn)口）批準(zhǔn)清單》統(tǒng)計我國已經(jīng)批準(zhǔn)進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體（http://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/spxx/）；根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的轉(zhuǎn)基因植物及其成分檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計我國已經(jīng)建立檢測標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體（表1）。

1.2.2 pDDID-1905 質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

收集上述大豆轉(zhuǎn)化體的特征序列。將這些轉(zhuǎn)化體的特征序列以及1 個大豆的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的檢測序列（用于判別被測樣品是否含有大豆成分）拼接，進(jìn)行人工合成后，克隆至pUC18 載體的EcoRⅠ和HindⅢ位點之間，獲得pDDID-1905質(zhì)粒。含有pDDID-1905質(zhì)粒的大腸埃希菌TOP10菌株命名為T10pDDID-1905，用于質(zhì)粒的保存或擴(kuò)繁。

將T10pDDID-1905菌株在含有100 μg/L的LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基上劃線，并于37 ℃條件下過夜培養(yǎng)。挑取單克隆，接入100 μg/L的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下，以250 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h。提取質(zhì)粒，并進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化。

1.2.3 pDDID-1905 質(zhì)粒的定量與稀釋

利用NanoDropTM紫外分光光度計測定質(zhì)粒DNA 的濃度。然后，根據(jù)pDDID-1905 質(zhì)粒的分子質(zhì)量（4.64×106Da），計算其拷貝數(shù)（copies）。根據(jù)式（1）的計算結(jié)果，將質(zhì)粒DNA稀釋為1×104copies/μL。將稀釋好的質(zhì)粒置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

式中：k為稀釋比例；M為單個質(zhì)粒分子質(zhì)量，ng；C0為所測質(zhì)粒原液質(zhì)量濃度，ng/μL；1×104為稀釋后濃度，copies/μL。

1.2.4 pDDID-1905 質(zhì)粒的功能驗證

按照各個大豆轉(zhuǎn)化體成分定性檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)，選擇對應(yīng)的引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增，分別檢測pDDID-1905質(zhì)粒所含特征序列的可用性。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照每個轉(zhuǎn)化體成分定性檢測國家標(biāo)準(zhǔn)（表2）。

以pDDID-1905 質(zhì)粒作為陽性物質(zhì)，對一個含有多種轉(zhuǎn)基因成分的轉(zhuǎn)基因大豆粉末樣品進(jìn)行檢測。該樣品含有轉(zhuǎn)基因大豆A5547-127、CV127、DP305423、DAS-44406-6、DAS-68416-4、FG72、GTS40-3-2、MON87701、MON87705、MON87708、MON87751、MON87769、MON89788 和SHZD32-1的成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因大豆的信息收集

數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，我國目前已批準(zhǔn)進(jìn)口14種獨(dú)立轉(zhuǎn)化體用作加工原料，包括A2704-12、A5547-127、CV127、DAS-44406-6、DP305423、DP356043、FG72、GTS40-3-2、MON87701、MON87705、MON87708、MON87769、MON89788 和SYHT0H2 等。除此之外，還有3 種轉(zhuǎn)化體DAS-68416-4、DAS-81419-2和MON87751，雖然尚未被批準(zhǔn)進(jìn)口，但是已經(jīng)發(fā)布或正在研制相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物及其成分檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)。另外，SHZD32-1 是國內(nèi)自主研發(fā)且極具推廣潛力的轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體。相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植物及其成分檢測國家標(biāo)準(zhǔn)也已經(jīng)發(fā)布（表1～2）。因此，本文將針對上述18 種轉(zhuǎn)化體構(gòu)建檢測用途的陽性質(zhì)粒分子。

2.2 pDDID-1905 質(zhì)粒及其鑒定

將18種轉(zhuǎn)基因大豆獨(dú)立轉(zhuǎn)化體的特征序列，以及1 個內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因（大豆凝集素基因Lectin）的靶標(biāo)序列按順序排列，該序列全長為4 881 bp（圖1）。將該序列進(jìn)行人工化學(xué)合成，然后將合成好的片段接入pUC18 載體的HindⅢ及EcoRⅠ位點之間，獲得pDDID-1905 質(zhì)粒（圖2）。該質(zhì)粒中含有一些唯一的限制性內(nèi)切酶識別位點，包括HindⅢ、AgeⅠ、NcoⅠ、ApaⅠ、AflⅡ、SalⅠ、MluⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ、PflMⅠ、SacⅠ、SwaⅠ以及EcoRⅠ等，可用于后期更新或擴(kuò)展。

表1 18種轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體事件及其改良性狀Table 1 Eighteen genetically modified soybean events and their modified traits

對pDDID-1905進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化。結(jié)果顯示，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后，獲得2 條酶切產(chǎn)物，長度分別約4 800 和2 600 bp；再向反應(yīng)液中加入XhoⅠ繼續(xù)酶切，4 800 bp 的條帶變成約3 500和1 300 bp的條帶（圖3）。該圖譜與預(yù)期結(jié)果相符，說明插入片段正確。對pDDID-1905進(jìn)行序列測定和拼接，進(jìn)一步確定其正確性。

2.3 pDDID-1905 質(zhì)粒功能驗證

使用相應(yīng)轉(zhuǎn)化體成分檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)中的引物（表2），對pDDID-1905 質(zhì)粒中包含的18 種轉(zhuǎn)化體特征序列和1個內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因靶標(biāo)序列進(jìn)行PCR檢測，以驗證其可用性。結(jié)果顯示，在含有10 000 個質(zhì)粒拷貝的PCR反應(yīng)體系中，目的片段均能夠獲得理想的擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段的大小與預(yù)期一致（圖4和表2）。

表2 19種靶標(biāo)序列的PCR檢測Table 2 PCR detection of 19 target sequences

以pDDID-1905 質(zhì)粒作為陽性物質(zhì)，對一種含有多種轉(zhuǎn)基因成分的轉(zhuǎn)基因大豆粉末樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，14種轉(zhuǎn)基因大豆成分，包括A5547-127、CV127、DP305423、DAS-44406-6、DAS-68416-4、FG72、 GTS40-3-2、 MON87701、 MON87705、MON87708、MON87751、MON87769、MON89788 和SHZD32-1 均被檢出，而另外4 種轉(zhuǎn)基因大豆成分（A2704-12、DP356043、DAS-81419-2 和SYHT0H2）未被檢出（圖5）。該結(jié)果符合預(yù)期，說明該質(zhì)粒能夠作為陽性物質(zhì)，用于轉(zhuǎn)基因大豆成分檢測。

圖1 pDDID-1905質(zhì)粒中插入的序列Fig.1 Insertion sequence in pDDID-1905 plasmid

圖2 pDDID-1905質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.2 Diagram of pDDID-1905 plasmid construction

圖3 pDDID-1905質(zhì)粒的鑒定Fig.3 Identification of pDDID-1905 plasmid

3 討論與結(jié)論

目前，各種轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)正在如火如荼進(jìn)行，已有轉(zhuǎn)化體的推廣范圍和產(chǎn)品的進(jìn)出口數(shù)量也與日俱增。因此，對轉(zhuǎn)基因作物監(jiān)督檢測的任務(wù)量也隨之增加，亟須從各個方面優(yōu)化或簡化檢測工作流程。通常，在進(jìn)行成分檢測時，需要特定的陽性物質(zhì)作為對照，用以對樣品結(jié)果進(jìn)行判別。常用陽性物質(zhì)一般是相應(yīng)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化體的gDNA。gDNA最能反映轉(zhuǎn)基因作物中遺傳物質(zhì)的改變，但是，其生產(chǎn)周期較長，流程煩瑣，且一次檢驗工作往往需要準(zhǔn)備多種轉(zhuǎn)化體的gDNA，增加了工作量和成本。為了克服這些缺點，人們開發(fā)了含有靶標(biāo)序列的質(zhì)粒作為陽性物質(zhì)，尤其是多靶標(biāo)質(zhì)粒[7-9,15]。目前，已報道了多種多靶標(biāo)質(zhì)粒開發(fā)成功的案例[5,13-15]，但是，已有的含有轉(zhuǎn)化體特征序列的多靶標(biāo)質(zhì)粒通常只能覆蓋較少的轉(zhuǎn)化體。類似PI等構(gòu)建的pSOY已屬于覆蓋度較高的多靶標(biāo)質(zhì)粒，可用于對MON89788-5′、A2704-12-3′、A5547-127-3′、DP356043-5′、DP305423-3′、A2704-12-5′和A5547-127-5′等幾種轉(zhuǎn)化體及其衍生物進(jìn)行篩查[5]。我國是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的進(jìn)口大國，其中大豆產(chǎn)品的進(jìn)口量最大；同時，大豆也是轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的作物之一。因此，對轉(zhuǎn)基因大豆的監(jiān)督檢驗工作顯得尤為重要。結(jié)合我國國情，全面覆蓋適合我國批準(zhǔn)或研發(fā)的重要轉(zhuǎn)基因大豆的多靶標(biāo)質(zhì)粒尚無報道。因此，本文以這些轉(zhuǎn)基因大豆為靶標(biāo)，構(gòu)建了覆蓋全面的多靶標(biāo)質(zhì)粒pDDID-1905。

pDDID-1905質(zhì)粒包含14種已批準(zhǔn)進(jìn)口的大豆獨(dú)立轉(zhuǎn)化體（A2704-12、A5547-127、CV127、DAS-44406-6、DP305423、DP356043、FG72、GTS40-3-2、MON87701、MON87705、MON87708、MON87769、MON89788 和 SYHT0H2）和 2 種 雜 交 品 系（DP305423×GTS40-3-2 和MON87701×MON89788）、3種暫未批準(zhǔn)進(jìn)口但應(yīng)用潛力較高的大豆獨(dú)立轉(zhuǎn)化體（DAS-68416-4、DAS-81419-2 和MON87751），以及1個我國自主研發(fā)的轉(zhuǎn)化體SHZD32-1的特征序列。該質(zhì)粒適用于對待測樣品中是否存在這18種轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體及其衍生物的成分進(jìn)行判別。該質(zhì)粒自帶大豆內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的檢測序列，可用于對待測樣品中是否含有大豆成分進(jìn)行判別。因此，該質(zhì)粒具有較高的集成度，且其覆蓋度符合我國國情，將極大地方便日常檢測分析。另外，該質(zhì)粒設(shè)計時不僅考慮到今后對特定轉(zhuǎn)化體檢測靶標(biāo)序列的更新，還充分考慮了后期其他轉(zhuǎn)基因大豆品種的不斷研發(fā)和推廣。因此，在外源插入序列中分布了多種限制性內(nèi)切酶位點。該設(shè)計有利于后期對相應(yīng)靶標(biāo)序列的局部調(diào)整或加入新的轉(zhuǎn)化體特征序列。

圖4 pDDID-1905質(zhì)粒所含特征序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR products of specific sequences of pDDID-1905 plasmid

圖5 轉(zhuǎn)基因大豆混合樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 PCR products of the transgenic soybean mixtures

綜上所述，本文根據(jù)轉(zhuǎn)基因大豆研發(fā)和應(yīng)用現(xiàn)狀，結(jié)合我國國情，收集了18 種重要的轉(zhuǎn)基因大豆轉(zhuǎn)化體的分子特征信息，并將這些轉(zhuǎn)化體的特征序列排序、拼接，構(gòu)建了一種覆蓋度更高且具備一定可修正性和擴(kuò)展性的多靶標(biāo)質(zhì)粒pDDID-1905。初步驗證表明，該質(zhì)粒能夠用作鑒定這些轉(zhuǎn)化體的陽性分子，極大地便利了相關(guān)的檢測和研究工作。