應(yīng)易恬，楊璟，嚴(yán)冰璇，邵馮金，譚勛

（浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，杭州310058）

外泌體（exosome,exo）是一種具有雙層質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外小囊泡，廣泛存在于各種體液中，是細(xì)胞-細(xì)胞間通訊聯(lián)系的重要介導(dǎo)者之一[1]。外泌體攜帶有其母細(xì)胞所具有的蛋白質(zhì)、DNA、mRNA 和微RNA（microRNA,miRNA）等功能性分子，這些分子隨著外泌體被受體細(xì)胞攝取而被整合到受體細(xì)胞中，對受體細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)揮起著重要的作用[2-4]。乳腺炎是奶牛最常見的感染性疾病之一，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[5-6]。牛奶中含有豐富的外泌體[7-8]。既往的研究發(fā)現(xiàn)，牛奶外泌體的成分可因乳腺感染而發(fā)生改變[9]，但有關(guān)乳腺炎牛奶外泌體的病理效應(yīng)尚未見報道。乳腺上皮細(xì)胞（mammary epithelial cells, MECs）具有表達(dá)抗菌物質(zhì)和促炎細(xì)胞因子的能力，在乳腺天然免疫機(jī)制中發(fā)揮重要作用[9-10]。本研究通過觀察乳腺炎牛奶外泌體對體外培養(yǎng)的MECs 活力及免疫機(jī)能的影響，旨在初步明確外泌體在乳腺炎發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 MECs 細(xì)胞及乳腺炎病原來源

原代培養(yǎng)的MECs 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，凍存于-196 ℃液氮中。大腸埃希菌（Escherichia coli）菌株分離自臨床型乳腺炎牛奶，經(jīng)16S rRNA 測序鑒定后，保存于甘油中。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

1.2.1 細(xì)胞處理

取培養(yǎng)至第4 代的MECs，用含15%小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）、1 μg/mL 胰島素、2.5 μg/mL 兩性霉素和200 μg/mL 慶大霉素的Dulbecco 改良培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium,DMEM）稀釋后，按6×105個/孔接種于6 孔板中。將細(xì)胞分為2組，一組為乳腺炎病原刺激組，一組為對照組，每組3 個重復(fù)。對大腸埃希菌計數(shù)后，將其置于70 ℃水浴鍋中滅活30 min，經(jīng)瓊脂糖平板鑒定無菌落生長后，按1×107CFU/mL的劑量加入MECs 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）漂洗3次，收集細(xì)胞。

1.2.2 總RNA 提取

采用TRIzol 法提取細(xì)胞總RNA，利用Nano-Drop 分光光度計檢測RNA 濃度與純度，并利用Agilent 2100生物分析儀檢測RNA的完整性。

1.2.3 cDNA 文庫構(gòu)建

質(zhì)檢合格的mRNA用帶有Oligo（dT）的磁珠富集并進(jìn)行片段化處理。以mRNA 為模板，用6 堿基隨機(jī)引物合成第1 條cDNA 鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、核糖核酸酶H（RNase H）和DNA 聚合酶Ⅰ來合成第2 條cDNA 鏈。將純化的雙鏈cDNA 進(jìn)行末端修復(fù)，加A 尾并連接測序接頭，用AMPure_XP磁珠（AMPure_XP_beads）進(jìn)行片段大小選擇，最后通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction,PCR）富集得到cDNA文庫。

1.2.4 測序及數(shù)據(jù)分析

將構(gòu)建好的cDNA 文庫用IlluminaHiSeq 平臺進(jìn)行測序。使用Cufflinks 2.2.1 軟件對轉(zhuǎn)錄本和基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量，并用edgeR 軟件包篩選差異表達(dá)基因，以差異倍數(shù)（fold change）＞1 且q＜0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。對差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（gene ontology,GO）功能注釋和分類富集分析。

1.3 牛奶樣品

從杭州市郊區(qū)某奶牛場無菌采集奶樣，置于冰盒中運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。采用牛奶體細(xì)胞自動計數(shù)儀（FossomaticTMMinor Foss Integrator，丹麥）進(jìn)行體細(xì)胞計數(shù)（somatic cell count,SCC），并選擇1份高SCC奶樣（SCC=20.1×105mL-1）和1份低SCC奶樣（SCC=5.9×103mL-1）進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)和鑒定，其中：從高SCC 奶樣中分離出1 株細(xì)菌，經(jīng)16s RNA 測序鑒定，確認(rèn)為腸球菌；在低SCC奶樣中未分離到細(xì)菌。選擇該2份奶樣進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 外泌體提取

具體步驟如下：取25 mL 奶樣置于離心管中，4 ℃、3 000g離心30 min 以去除大部分乳脂和細(xì)胞碎片；將上清液轉(zhuǎn)移至新管中，重復(fù)上述步驟以去除剩余乳脂和細(xì)胞碎片；將上清液用多層紗布過濾后，4 ℃、2.15×104g離心60 min；取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾以去除酪蛋白，4 ℃、1.0×105g離心60 min；再取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，去除剩余酪蛋白，4 ℃、1.35×105g離心90 min；去掉上清液，沉淀用PBS 稀釋，4 ℃、1.35×105g離心60 min；再將沉淀用PBS稀釋，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，于-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.5 外泌體的表征

1.5.1 透射電子顯微鏡觀察

取5 μL 外泌體樣品滴于銅網(wǎng)上，自然干燥，用0.1%乙酸雙氧鈾溶液負(fù)染，在JEM1200-EX透射電子顯微鏡（JEOL公司，日本）下觀察外泌體的形態(tài)。

1.5.2 外泌體標(biāo)志蛋白檢測

外泌體經(jīng)二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）法定量后，99 ℃變性10 min，然后在12%凝膠上進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE），接著電轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h 后，分別加入腫瘤特異性糖蛋白101（tumorspecific glycoprotein,TSG101）（1∶200）和膜聯(lián)蛋白A2（annexin A2）（1∶200）（Santa Cruz 生物技術(shù)公司，美國）抗體，4 ℃孵育過夜。PVDF膜用Tris-鹽酸緩沖液（Tris buffered saline Tween-20,TBST）洗滌3 次，每次10 min，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1∶2 000）（武漢博士德生物工程有限公司），室溫孵育1 h，用TBST洗滌3次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminescence,ECL）法顯色。

1.6 細(xì)胞活力檢測

將MECs用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋后（培養(yǎng)血清預(yù)先進(jìn)行去外泌體處理），按1.2×104個/孔接種于96 孔板中；向培養(yǎng)基中分別加入1 μg/mL 正常牛奶外泌體（N-exo）和乳腺炎牛奶外泌體（M-exo），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，加入200 mL含10 mg/mL 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（methyl-thiazol-diphenyltetrazolium, MTT）的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心去上清液，沉淀用200 μL二甲基亞砜（dimethylsulfoxide,DMSO）溶解，于540 nm波長處檢測吸光度值。以不加外泌體處理的細(xì)胞為對照（CK）。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR

將MECs接種于6孔板中（6×105個/孔），加入外泌體（1 μg/mL）處理24 h 后，用PBS 洗滌3 次，采用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA；取1 μg mRNA，采用PrimeScript cDNA合成試劑盒（TaKaRa公司，日本）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作方法按說明書進(jìn)行。根據(jù)GenBank上發(fā)表的牛血清白細(xì)胞介素8（interleukin-8,IL-8）、白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β,IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）基因序列，采用Primer Blast 在線軟件（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設(shè)計跨內(nèi)含子PCR 引物（表1）。實(shí)時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qPCR）反應(yīng)總體系為20 μL：上下游引物各0.6 μL、SYBR qPCR 混合物10 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 6.8 μL。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，40 個循環(huán)。以參考基因RPL19和PGK1的CT值的幾何平均值為參照，采用2-△△CT法計算目的基因的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計處理

數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 22.0軟件中的單因素方差分析（analysis of variance,ANOVA）進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，并采用最小顯著性差數(shù)法（least significant difference, LSD）進(jìn)行事后檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)基因

與正常培養(yǎng)的MECs 相比，乳腺炎病原刺激共引起1 478條基因的表達(dá)發(fā)生顯著改變，其中933條表達(dá)上調(diào)，545條表達(dá)下調(diào)（圖1）。

表1 qPCR引物信息Table 1 Primer information for qPCR analysis

2.2 差異表達(dá)基因的GO 分類富集

圖1 大腸埃希菌刺激細(xì)胞和對照細(xì)胞之間的差異表達(dá)基因火山圖Fig.1 Volcano plot of the differential expression genes between E.coli-stimulated cells and normal cells

對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 分類富集統(tǒng)計，同時根據(jù)P值對生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細(xì)胞組分（cellular component）的分類富集結(jié)果進(jìn)行排序，篩選前10個最顯著富集的GO。如圖2 所示：在生物過程方面，E.coli刺激顯著影響蛋白酶結(jié)合和鋅離子結(jié)合；在分子功能方面，E.coli刺激引起的差異表達(dá)基因主要參與對血管形成、病毒基因組復(fù)制、T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、免疫反應(yīng)和NF-κB轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控；在細(xì)胞組分方面，E.coli刺激引起的差異表達(dá)基因顯著富集于細(xì)胞外囊泡外泌體、細(xì)胞外間隙和細(xì)胞質(zhì)，其中定位于細(xì)胞外囊泡外泌體的差異表達(dá)基因共有21條（表2）。

2.3 牛奶外泌體的表征結(jié)果

從牛奶中分離得到的外泌體呈圓形或橢圓形，具有完整的膜結(jié)構(gòu)，直徑為50～100 nm；正常牛奶外泌體（N-exo）和乳腺炎牛奶外泌體（M-exo）在形態(tài)上無明顯差別，但N-exo 具有較深的蛋白質(zhì)背景，可能與正常牛奶蛋白質(zhì)含量較高有關(guān)（圖3A）。N-exo 和M-exo 均表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白TSG101，并富含膜聯(lián)蛋白A2（圖3B）。

2.4 牛奶外泌體對MECs 活力的影響

如圖4 所示，N-exo 處理組細(xì)胞活力與對照組細(xì)胞相比無顯著差異，但M-exo處理組細(xì)胞活力較對照組細(xì)胞顯著下降（P＜0.001）。

2.5 外泌體對MECs 表達(dá)炎癥介質(zhì)的影響

N-exo處理組細(xì)胞IL-1βmRNA表達(dá)水平較對照組顯著升高（P＜0.01）；M-exo組細(xì)胞IL-1βmRNA的表達(dá)水平與對照組相比無顯著影響（P＞0.05），但較N-exo 組細(xì)胞顯著降低（P＜0.01）（圖5A）；與對照組相比，N-exo和M-exo對IL-8mRNA的表達(dá)均無顯著影響（P＞0.05）（圖5B）。然而，在對照組、Nexo 和M-exo 處理組細(xì)胞中均未檢測到TNF-αmRNA的表達(dá)。

圖2 差異表達(dá)基因中最顯著富集的GO條目Fig.2 Most enriched gene ontology(GO)terms of differential expression genes

表2 富集于細(xì)胞的組分“細(xì)胞外囊泡外泌體”（GO：0070062）的差異表達(dá)基因Table 2 Differential expression genes enriched in the cellular component“extracellular vesicular exosome”(GO:0070062)

圖3 外泌體表征Fig.3 Characterization of milk-derived exosomes

圖4 正常牛奶外泌體（N-exo）和乳腺炎牛奶外泌體（Mexo）對奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effect of exosomes derived from normal milk(N-exo)and mastitic milk (M-exo) on the viability of bovine mammary epithelial cells

3 討論

感染性疾病是病原微生物與宿主復(fù)雜互作的結(jié)果。病原微生物可采取多種策略以逃避或抑制宿主的免疫反應(yīng)[11]，從而得以在宿主內(nèi)存活和復(fù)制，最終導(dǎo)致疾病發(fā)生。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在感染過程中，病原微生物和被感染的宿主細(xì)胞均可產(chǎn)生外泌體，這些外泌體可抑制宿主的免疫反應(yīng)，是病原逃避免疫并建立急、慢性感染的重要機(jī)制[12]。但外泌體是否在奶牛乳腺炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用尚未見報道。

圖5 牛奶外泌體（N-exo 和M-exo）對奶牛乳腺上皮細(xì)胞IL-1β（A）和IL-8（B）表達(dá)的影響Fig.5 Effect of exosomes derived from normal milk(N-exo)and mastitic milk (M-exo) on the expression of IL-1β(A)and IL-8(B)in bovine mammary epithelial cells

熱滅活病原刺激的MECs模型被廣泛用于乳腺炎發(fā)病機(jī)制的研究[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在熱滅活大腸埃希菌刺激下，MECs中有1 478條基因發(fā)生差異表達(dá)。GO 分類富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述差異表達(dá)基因中有21條定位于外泌體，表明乳腺炎病原感染可引起宿主細(xì)胞所分泌的外泌體成分發(fā)生改變。REINHARDT等[15]也證實(shí)乳腺感染可引起牛奶外泌體蛋白組分發(fā)生改變，支持本研究結(jié)果。除含有編碼膜蛋白（SDCBP、CD47、DPP4）、膜結(jié)合蛋白（ANXA6）、膜受體（GPRC5B）、膠原蛋白（COL12A1）、細(xì)胞骨架蛋白（ACTN4、ACTA2）、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合蛋白（FLNA、GSN）、細(xì)胞外基質(zhì)（LAMB1、THBS1）和肌動蛋白微絲（MYH9）的基因外，定位于外泌體的基因中還包含具有免疫抑制作用的PD-L1[16]和LGALS3BP[17]。這一結(jié)果提示，乳腺炎病原感染可引起外泌體免疫機(jī)能改變。

在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)對比了正常牛奶和乳腺炎牛奶來源的外泌體對體外培養(yǎng)的MECs活力和免疫機(jī)能的影響。為避免非牛奶來源的外泌體對試驗(yàn)結(jié)果的干擾，本試驗(yàn)所使用的細(xì)胞培養(yǎng)基和小牛血清均進(jìn)行了去外泌體處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常牛奶外泌體可誘導(dǎo)MECs 表達(dá)促炎介質(zhì)IL-1β。這說明在正常生理情況下，牛奶外泌體具有調(diào)節(jié)乳腺免疫的功能。ADMYRE等[18]發(fā)現(xiàn)，人乳中的外泌體也具有免疫調(diào)節(jié)作用，支持本研究結(jié)果。與正常牛奶外泌體不同，乳腺炎牛奶外泌體可顯著降低MECs活力，并失去刺激MECs表達(dá)IL-1β的能力。上述結(jié)果提示，在乳腺感染過程中，進(jìn)入到牛奶中的外泌體可引起MECs 活力下降，并可能通過改變?nèi)橄賰?nèi)免疫微環(huán)境而為病原逃避免疫創(chuàng)造有利條件。除IL-1β外，MECs還可表達(dá)促炎介質(zhì)TNF-α和IL-8[19]。但本研究發(fā)現(xiàn)，正常牛奶外泌體和乳腺炎牛奶外泌體對IL-8和TNF-α的表達(dá)均無顯著影響，其機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

需要指出的是，本研究用于構(gòu)建細(xì)胞感染模型的病原菌與從乳腺炎牛奶中分離到的病原菌不同，因而，在感染細(xì)胞模型上觀察到的定位于外泌體的差異表達(dá)基因可能與乳腺炎牛奶外泌體中發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的基因不同。此外，雖然牛奶外泌體主要來自MECs，但病原微生物[20-21]也可形成外泌體，因而，在本研究中觀察到的乳腺炎牛奶外泌體的生物學(xué)效應(yīng)可能是宿主和病原微生物產(chǎn)生的外泌體的共同效應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明：乳腺感染可引起牛奶外泌體生物學(xué)功能發(fā)生明顯改變，這類外泌體可降低MECs 活力，并可能參與介導(dǎo)有利于病原逃避免疫的微環(huán)境的形成，從而為病原逃避免疫創(chuàng)造有利條件。因而，在乳腺感染過程中，外泌體可能起著促進(jìn)乳腺感染擴(kuò)散的作用。觀察阻斷外泌體分泌對乳腺炎病理過程的影響將是下一步工作的重點(diǎn)。