王維杰，范賽榮，張光輝，孫海婷，施國富，馬璇，朱成楚

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬象山醫(yī)院 胸外科，浙江 寧波 315700；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3．溫州醫(yī)科大學(xué)附屬臺(tái)州醫(yī)院 胸外科，浙江 臺(tái)州 317000）

肺鱗狀細(xì)胞癌是一種常見的非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell carcinoma，NSCLC）亞型，每年全球約有30多萬人受累[1]。目前，對(duì)于肺鱗癌的治療，以外科手術(shù)切除為主，對(duì)于不能手術(shù)的疾病只能采取細(xì)胞毒性化療和免疫治療[2]。然而，由于目前缺乏較為特異的早期診斷標(biāo)志物，大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于臨床晚期[3]，而錯(cuò)過了最佳治療期。因此，尋找肺鱗癌特異的早期診斷標(biāo)志物，顯得尤為重要。據(jù)報(bào)道，a-1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶II（a-1，2 fucosyltransferase II，F(xiàn)UT2）可以通過a-1，2糖苷鍵將巖藻糖基轉(zhuǎn)移到N-乙酰氨基的末端半乳糖上，其在多種腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)，是腫瘤發(fā)生的早期標(biāo)志物之一[4-5]。然而，關(guān)于FUT2在肺鱗癌患者中的差異表達(dá)及其對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖的影響目前尚未見報(bào)道。因此，本研究主要通過生物信息數(shù)據(jù)分析和FUT2低表達(dá)細(xì)胞模型來探究FUT2在肺鱗癌中的表達(dá)情況，及其對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與質(zhì)粒載體：肺鱗癌細(xì)胞H226購自美國菌種保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）細(xì)胞庫。FUT2的低表達(dá)質(zhì)粒載體psi-U6.1/eGFP/Puro-FUT2（shFUT2）及其對(duì)照載體psi-U6.1/eGFP/Puro-NC由美國GeneCopoeia公司設(shè)計(jì)構(gòu)建并經(jīng)測序驗(yàn)證。

1.1.2 試劑：胎牛血清購自美國Hyclone公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，青霉素-鏈霉素溶液（×100）、胰酶細(xì)胞消化液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、β-actin小鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG及鼠IgG均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所，CCK-8試劑購自日本Dojindo同仁化學(xué)研究所，F(xiàn)UT2、Bcl-2、Bax兔單克隆抗體購自美國Abcam公司，PCNA兔單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 差異性分析：UALCAN數(shù)據(jù)庫（http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html）是根據(jù)TCGA臨床患者數(shù)據(jù)，對(duì)原發(fā)腫瘤樣本進(jìn)行分類，并繪制不同亞組各基因表達(dá)水平的數(shù)據(jù)圖，包括臨床分期、性別、年齡、組別[6]。應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫分析FUT2在肺鱗癌組織和正常癌旁組織中的表達(dá)差異，及FUT2與肺鱗癌患者的臨床分期、性別、年齡的相關(guān)性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：用含1%青霉素-鏈霉素、10%胎牛血清及89% RPMI 1640培養(yǎng)基的體系，在37 ℃、5% CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)H226肺鱗癌細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分組為：NC組（空載體對(duì)照組）及shFUT2組（FUT2低表達(dá)組）。

1.2.3 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：提前于6孔板鋪適量H226細(xì)胞懸液，待其生長密度達(dá)到75%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染操作，將RPMI 1640培養(yǎng)基與LIPO 2000按照每孔125 μL:5 μL的比例配制轉(zhuǎn)染A液，將RPMI 1640培養(yǎng)基與相應(yīng)質(zhì)粒DNA按照每孔125 μL:2500 ng的比例配制轉(zhuǎn)染B液，將A、B液混合室溫孵育15 min后以250 μL/孔逐滴加入待轉(zhuǎn)染細(xì)胞孔中繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)：將對(duì)數(shù)期細(xì)胞調(diào)整成8×105個(gè)/mL，接種于96孔板進(jìn)行正常培養(yǎng)，分別于24 h、48 h及72 h在實(shí)驗(yàn)孔以10 μL/孔加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，上機(jī)檢測450 nm處各孔吸光度。

1.2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞以300個(gè)/孔接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆團(tuán)后，用900 μL 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染20 min，洗去染色液，拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6 Western blot法：應(yīng)用BCA試劑檢測提取的H226細(xì)胞總蛋白濃度，并用5×Loading Buffer及細(xì)胞裂解液將樣本蛋白濃度均調(diào)整為1 μg/μL，隨后于金屬加熱儀100 ℃加熱10 min變性得到實(shí)驗(yàn)所需樣本，隨后配至Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠和濃縮膠、上樣、轉(zhuǎn)膜、5%的脫脂牛奶封閉、TBST洗滌、4 ℃一抗孵育過夜、TBST洗滌、孵育相應(yīng)二抗1 h、TBST洗滌、ECL化學(xué)發(fā)光檢測，最后采用Image Lab圖像分析軟件進(jìn)行各組蛋白表達(dá)的灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FUT2在肺鱗癌組織中的表達(dá) UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示：與癌旁正常組織（Normal）組相比，F(xiàn)UT2基因在肺鱗癌組織（Primary tumor）中呈現(xiàn)明顯高表達(dá)趨勢，且主要集中表達(dá)在stage1、stage2、stage3期（P＜0.05），而stage4與Normal組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在引入年齡因素的情況下，與Normal組相比，F(xiàn)UT2在肺鱗癌患者的41～100歲年齡段中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢，但是各年齡組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。此外，不同性別肺鱗癌患者之間FUT2表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 FUT2低表達(dá)細(xì)胞模型的鑒定 為進(jìn)一步在細(xì)胞水平驗(yàn)證FUT2對(duì)肺鱗癌的影響，我們通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建敲減FUT2的H226細(xì)胞模型，通過Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其低表達(dá)效果，結(jié)果顯示，與NC組相比，shFUT2組的FUT2蛋白表達(dá)水平明顯降低（3.26±0.16vs.1.87±0.28），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），可以應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析FUT2在肺鱗癌患者中的差異性表達(dá)

2.3 FUT2低表達(dá)可以抑制H226細(xì)胞的增殖 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)連續(xù)監(jiān)測3 d的細(xì)胞生長速率，結(jié)果顯示，與NC組比，shFUT2組的細(xì)胞增殖率在48 h和72 h均受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及Western blot實(shí)驗(yàn)中，敲減FUT2的表達(dá)后，單克隆細(xì)胞團(tuán)的形成數(shù)及細(xì)胞增殖因子PCNA蛋白的表達(dá)（1.39±0.07vs.1.05±0.17）均明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 FUT2對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖的影響

2.4 FUT2對(duì)H226細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的影響 與NC組相比，F(xiàn)UT2低表達(dá)后，細(xì)胞凋亡負(fù)調(diào)因子Bcl-2蛋白表達(dá)水平受到明顯抑制（2.10±0.04vs.1.20±0.26，P＜0.01），同時(shí)，又促進(jìn)了凋亡正調(diào)因子Bax蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.89±0.30vs.1.65±0.51，P＜0.05）。

3 討論

巖藻糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾類型，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生發(fā)展的普遍標(biāo)志[3，7-8]。在腫瘤細(xì)胞中常常表現(xiàn)出巖藻糖基化的增加，這一改變，極大地影響了腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞的黏附、細(xì)胞與基質(zhì)的相互作用、細(xì)胞信號(hào)傳遞、代謝、血管生成和免疫調(diào)節(jié)，最終導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[7，9]。巖藻糖基化修飾異常的基礎(chǔ)是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的異常改變，而FUT2是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶家族成員之一。近年來，對(duì)腫瘤細(xì)胞的巖藻糖基化修飾的研究越來越多。有研究報(bào)道，巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶可以促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，其基因亦可能作為循環(huán)標(biāo)志物被應(yīng)用于肺癌的早期檢測診斷[10-11]。但是，關(guān)于FUT2對(duì)肺鱗癌影響的研究目前尚未見報(bào)道。

本研究借助生物信息學(xué)數(shù)據(jù)和FUT2低表達(dá)細(xì)胞模型，探究了FUT2在肺鱗癌患者中的差異表達(dá)及其對(duì)肺鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，結(jié)果表明FUT2在肺鱗癌患者中呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)趨勢，并且主要在肺鱗癌TNM分期的Stage1、Stage2和Stage3高表達(dá)，而其與年齡和性別無關(guān)。此外，平板克隆實(shí)驗(yàn)、CCK-8實(shí)驗(yàn)及對(duì)經(jīng)典的增殖因子PCNA蛋白表達(dá)水平的檢測，均證明了敲減FUT2的表達(dá)后，明顯抑制了H226細(xì)胞株的增殖能力。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其主要功能是抑制細(xì)胞凋亡，并通過阻滯細(xì)胞周期的G0/G1期來延長細(xì)胞的存活[12-13]。當(dāng)Bcl-2與凋亡正調(diào)因子Bax的表達(dá)水平失衡，會(huì)引起線粒體功能發(fā)生紊亂，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲減FUT2能明顯抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，相反地，促進(jìn)了促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，說明低表達(dá)FUT2可以促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的凋亡能力，但仍需要繼續(xù)進(jìn)行明確及驗(yàn)證。

綜上所述，F(xiàn)UT2在肺鱗癌患者中顯著高表達(dá)，并且經(jīng)過進(jìn)一步對(duì)臨床分期的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：FUT2與肺鱗癌TNM分期的Stage1、Stage2和Stage3期均有關(guān)聯(lián)，而其與TNM分期的Stage4期及患者年齡、性別并無明顯關(guān)聯(lián)。由此表明FUT2可能影響著肺鱗癌疾病的發(fā)生發(fā)展，且主要發(fā)生在其早中期。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)UT2可能通過上調(diào)增殖因子PCNA蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)，可以抑制肺鱗癌細(xì)胞的凋亡能力進(jìn)而促進(jìn)肺鱗癌細(xì)胞的生長。但具體影響和機(jī)制如何，有待于后續(xù)進(jìn)一步更深層次地探究和論證。