潘璐璐，盧孔場，褚茂平，曾靜靜，榮星

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童心臟中心 溫州醫(yī)科大學心臟發(fā)育與轉化醫(yī)學研究所，浙江 溫州 325027；2.溫州市婦幼保健所 兒童健康管理科，浙江 溫州 325000）

川崎病（Kawasaki disease，KD）是一種常見急性發(fā)熱出疹性疾病，表現(xiàn)為全身血管炎綜合征，好發(fā)于5歲以下嬰幼兒[1]。在發(fā)達國家中，這種疾病已成為兒童獲得性心臟病的主要原因[2]。中國作為一個發(fā)展中國家，KD發(fā)病率也在逐年增長[3]。KD可累及全身各個器官，主要表現(xiàn)為心血管系統(tǒng)損傷，而冠脈損害是其主要危害，損傷機制可能歸結于冠狀動脈及其他中等肌性血管的內皮及彈性纖維的損傷，從而導致血管炎和血管壁的破壞，最終導致冠狀動脈擴張甚至冠狀動脈瘤的發(fā)生。鑒于KD目前臨床無特異性的診斷指標，尋找其診斷、治療、預后的新一代血清生物標志物顯得尤為重要。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度大于200 nt的非編碼RNA，基因組序列中4%～9%的序列產(chǎn)生的轉錄本是lncRNA（相應的蛋白編碼RNA的比例是1%）。由于lncRNA在多種體液如血液、尿液中均可檢測出，使其成為了新一代生物標志物的熱門候選。為此，本研究通過lncRNA芯片系統(tǒng)分析KD患兒血清中的lncRNA表達譜，篩選KD患兒特異相關的循環(huán)lncRNA RP11-86H7.1，并分析lncRNA RP11-86H7.1在KD診斷中的臨床意義，為KD治療尋找靶點提供基礎。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院2018年4月至2018年12月確診并收治的KD患兒25例，KD診斷依據(jù)美國心臟協(xié)會制定的診斷標準[2]。25例中男17例，女8例，年齡＜5歲，經(jīng)超聲檢測，存在冠脈損害13例，無冠脈損害12例。選擇同期門診體檢健康兒童24例、普通發(fā)熱兒童17例及KD恢復期兒童22例，年齡＜5歲，排除肺、肝、腎、腦等重大疾病。各組研究對象的年齡、性別構成差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。本研究方案由溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象監(jiān)護人均簽署知情同意書。

表1 4組研究對象一般臨床資料的比較（±s）

表1 4組研究對象一般臨床資料的比較（±s）

KD急性期兒童冠脈損害 無冠脈損害例數(shù) 24 17 22 13 12性別（男/女） 14/10 10/7 11/11 8/5 9/3月齡 25.00±15.74 49.27±32.78 27.00± 18.30 18.23± 14.72 21.00± 8.89白細胞（×109/L） 8.14± 2.13 10.86± 6.04 7.47± 2.51 15.57± 4.64 13.72± 3.39血小板（×109/L） 303.33±47.07 262.40±68.10 538.14±183.00 371.00±131.23 411.33± 87.01 C反應蛋白（mg/L） - 20.85±18.04 13.88± 9.65 84.92± 53.66 58.32± 35.94谷丙轉氨酶（U/L） 15.67± 3.55 15.47± 7.95 28.36± 15.56 70.38± 92.80 32.42± 42.91谷草轉氨酶（U/L） 35.00± 5.69 33.40±10.74 40.23± 10.91 42.85± 25.79 33.75± 16.67腦鈉肽（pg/mL） - - 297.23±136.65 1013.31±875.08 502.58±324.12 D-二聚體（μg/mL） - - 1.38± 1.90 1.31± 0.74 2.11± 2.52臨床特點 健康兒童 發(fā)熱兒童 KD恢復期兒童

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：空腹采取靜脈血2 mL，放置30 min后，1200×g離心10 min，吸取上清液至離心管中，4 ℃，12000×g離心10 min后分離上清至新離心管中，取250 μL血清加入750 μL TRIzol@LS試劑（美國Invitrogen公司）后所有血清樣本均儲存于-80 ℃，直至使用。

1.2.2 總RNA提取及cDNA第1鏈合成：從-80 ℃冰箱中取出血清樣本冰上放置待解凍后加入200 μL氯仿劇烈震蕩30 s，室溫放置3 min，4 ℃ 12000 r/min離心15 min后，取上清液400 μL于新去RNase的EP管內，加入等量異丙醇-20 ℃過夜后，4 ℃ 12000 r/min離心20 min，棄上清后加入1 mL 75%乙醇洗滌，12000 r/min離心后加入10 μL DEPC水溶解RNA，利用Trans Script?One-Step g DNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）將RNA反轉錄為cDNA。

1.2.3 RT-qPCR檢測血清lncRNA RP11-86H7.1表達：以cDNA為模版，在Bio-Rad CFX96 Touch PCR儀上，RT-qPCR對lncRNA RP11-86H7.1進行定量檢測。lncRNA RP11-86H7.1上游引物：5’-CTCGGCTTCTCCTT ACCTT-3’，下游引物：5’-ACACCACCAATCTGAACCA-3’；以Has-GAPDH為內參，上下游引物分別為：5’-AACTCT GGTAAAGTGGATATTG-3’，5’-GGTGGAATCATATTGGAAC A-3’。按照試劑盒說明書，反應條件為預變性95 ℃3 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，65 ℃ 5 s，擴增39個循環(huán)。所有樣品均做3個平行孔，循環(huán)數(shù)取其均數(shù)。lncRNA RP11-86H7.1的相對表達量用2-△△Ct表示，△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析，2組比較采用配對t檢驗；利用ROC曲線分析和AUC評估血清lncRNA作為疾病診斷標志物的價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA RP11-86H7.1在KD患者血清中的表達

KD急性期與健康兒童、普通發(fā)熱兒童及KD恢復期血清lncRNA相對表達量分別為6.33±7.37，1.57±1.59，1.61±1.13及1.37±0.56，KD急性期患兒血清lncRNA RP11-86H7.1表達水平明顯高于健康兒童和普通發(fā)熱兒童（P＜0.05），而KD恢復期即下降至接近健康兒童水平。見圖1。

圖1 KD急性期、健康兒童、普通發(fā)熱兒童及KD恢復期血清lncRNA表達水平

2.2 血清lncRNA RP11-86H7.1水平對KD的診斷效能 繪制ROC曲線，評價lncRNA RP11-86H7.1在KD中的診斷價值。如圖2所示，血清lncRNA RP11-86H7.1診斷KD的ROC曲線的AUC為0.783（95%CI=0.586～0.981，P＜0.05），當臨界值（診斷閾值）取2.29時，其靈敏度為60.0%，特異度為91.7%，具有較高的診斷價值。

2.3 KD患者血清lncRNA RP11-86H7.1表達水平與KD臨床特征關系 lncRNA RP11-86H7.1在血小板計數(shù)高于300×109/L的兒童血清中的表達明顯高于血小板計數(shù)正常兒童的血清（P＜0.05），而在其他實驗室指標上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

3 討論

圖2 lncRNA RP11-86H7.1對KD急性期診斷作用的ROC曲線

表2 lncRNA RP11-86H7.1與KD臨床特征相關性分析

KD是一種在兒童時期能引起全身系統(tǒng)血管炎的嚴重發(fā)熱疾病，且與成年期的冠狀動脈病變存在極大的相關性，而發(fā)病機制目前尚不清楚。內皮損傷被證實是早期心血管疾病的危險標志物，可影響正常的穩(wěn)態(tài)功能并有炎癥活動特點[4-5]。目前已有報道，有KD病史的兒童在成年期出現(xiàn)冠狀動脈粥樣硬化導致了急性冠狀動脈綜合癥或猝死[6]。因此及時診斷KD是預防冠狀動脈并發(fā)癥的最佳手段。

miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，目前在心血管病中已研究的較為透徹。如已有報道m(xù)iRNA不僅可以作為KD診斷的標記物，而且可以成為KD冠脈損害治療的靶點[7-8]。而lncRNAs是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，通過調節(jié)基因轉錄、蛋白翻譯、mRNA剪切、miRNA吸附及作為蛋白骨架等多種方式發(fā)揮重要作用[9]。但lncRNAs在心血管疾病中的研究報道較少。有報道lncRNA Fendrr通過結合在組蛋白修飾復合體PRC2上，在胎鼠心臟及腹壁發(fā)育過程中起重要的調節(jié)作用[10]。WANG等[11]鑒定了一種心臟富含的lncRNAs，稱為心臟肥大相關表觀遺傳調節(jié)器（chaer），它對心臟肥大的發(fā)展起調節(jié)作用，在心臟出現(xiàn)壓力超負荷之前抑制chaer的表達可顯著減輕心臟肥大和功能障礙。KO等[12]進一步了解了KD和冠狀動脈瘤的發(fā)病機制，通過lncRNA分析表明XLOC_是最高表達的分子，冠狀動脈瘤患者的XLOC_豐度顯著增加，表明CD177 pos中性粒細胞的增加與KD有關，研究還提供了KD、抗IVIG的KD或冠狀動脈瘤患者血液中的全長非編碼RNA轉錄物，流行病學數(shù)據(jù)表明遺傳因素是重要的KD易感性。KIM等[13]為了確定影響KD易感性的遺傳變異，進行了一項全基因組關聯(lián)研究和復制研究，3個位點的6個單核苷酸多態(tài)性與KD易感性顯著相關。JIANG等[14]探討lncRNAs在KD中的作用時，在KD模型中篩選出妊娠誘導的非編碼RNA（PINC）在經(jīng)TNF-α處理的HUVEC中顯著過表達，發(fā)現(xiàn)PINC的敲除增強了用TNF-α處理的人內皮細胞的生存能力，增加了抗凋亡的表達，降低了凋亡基因的表達。提示PINC參與了TNF-α誘導血管內皮細胞凋亡的過程，可能成為KD治療的新靶點。LI等[15]研究表明THRIL表達與KD兒童的一種急性炎癥疾病患者癥狀的嚴重程度相關。lncRNAs和其結合蛋白可以調節(jié)TNF-α表達在人類先天免疫反應和炎癥性疾病中扮演著重要角色。由此可見，lncRNAs在多種心血管疾病中發(fā)揮極為重要的作用，為心血管疾病治療提供了新的靶點。

綜上所述，盡管已可以證明lncRNAs的異常表達與心血管疾病的發(fā)生密切相關，但有關lncRNAs在KD的報道中只進行了一般性的論述，沒有對候選的lncRNAs進行單獨研究，在KD中的作用機制研究尚不深入。本研究結果提示，血清lncRNA RP11-86H7.1表達上調可作為診斷和評估KD預后的生物學指標。本研究通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，lncRNA RP11-86H7.1在KD患者血清中的表達明顯升高，將血清lncRNA RP11-86H7.1作為KD診斷指標，其靈敏度和特異度均大于60%。但本研究所納入樣本量有限，仍存在偶然誤差的可能，其靈敏度和特異度以及臨界值的選擇還需在大樣本量的人群中進一步驗證。