肖麗娜李榮沖彭振英田麗彬韓 燕崔 鳳萬書波李國衛(wèi)劉譯陽*

(1.山東師范大學生命科學學院,山東 濟南 250014; 2.山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心,山東 濟南 250100)

AP2/ERF(PETAL/ethylene responsive element binding factor)類轉(zhuǎn)錄因子是一類與植物逆境脅迫相關的轉(zhuǎn)錄因子,DREB(Dehydration Responsive Element Binding Protein)轉(zhuǎn)錄因子則是AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子的一個亞家族[1]。DREB轉(zhuǎn)錄因子含有一個由60個左右的氨基酸殘基組成的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域,其中位于第14位的V(纈氨酸)和第19位的E(谷氨酸)對轉(zhuǎn)錄因子與順式元件的結(jié)合非常重要[2]。DREB家族轉(zhuǎn)錄因子能與DRE/CRT元件特異性結(jié)合,從而調(diào)控下游抗逆基因的表達,最終提高植物對逆境的抵抗和適應能力[3]。擬南芥AtDREB基因家族可分為六個亞族,分別為A1～A6[4-5]。其A1和A4的表達受低溫脅迫的誘導;A2和A3的表達受干旱和高溫誘導;A5可能負反饋A1和A2,A6的表達也受到一定的脅迫的誘導[4-5]。

花生是我國重要的油料作物之一,出油率高達45%～50%,在我國廣泛種植。低溫、干旱和鹽脅迫等逆境脅迫是限制植物生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的重要因素,尋找新的抗逆基因,培育出抗逆花生新品種是育種家追求的目標[6]。然而,相對于模式植物,對花生低溫和耐鹽的非生物脅迫耐受性研究較少,對花生非生物脅迫相關基因的功能和轉(zhuǎn)基因研究正處于起步階段[7]。本研究采用生物信息學方法分析了AhDREB基因家族各成員的物理化學性質(zhì)、進化關系、基因結(jié)構(gòu)、表達情況等,為進一步研究AhDREB轉(zhuǎn)錄因子的生物學功能和提高逆境條件下的花生抗性奠定了一定的理論基礎[8]。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

供試品種為Tifrunner,由美國花生種質(zhì)資源庫提供,本實驗室保存?；ㄉN子在營養(yǎng)土與蛭石(2∶1)的混合土中萌發(fā),培養(yǎng)于16h光照/8h黑暗(28℃/22℃)的光照培養(yǎng)箱中。將萌發(fā)后兩周大小的幼苗進行高溫、低溫、高鹽和干旱脅迫處理后,選取其倒三葉進行材料保存。高溫處理時,將幼苗分別置于45℃培養(yǎng)箱中,分別在0h、6h、12h、24h取材;低溫處理時,將幼苗分別置于4℃培養(yǎng)箱中,分別在0h、4h、8h、12h取材;20%PEG6000進行模擬干旱脅迫處理,分別在0h、4h、6h、12h取材;250 mmol/L NaCl進行高鹽處理,分別在0d、1d、2d、4d取材。以上材料均用液氮冷凍,保存于-80℃冰箱,并用于后續(xù)實驗。

1.2 花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列的鑒定

從TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中搜索下載擬南芥AtDREB轉(zhuǎn)錄因子家族的6個亞組的蛋白全長序列共55個,通過blastp在Peanut Base[9](https://peanutbase.org/)中進行檢索,根據(jù)E-value＜1.0e-10進行篩選,獲得相應花生轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列,并刪除重復序列。對所預測的花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子進行染色體位置、氨基酸數(shù)目、編碼序列等進行統(tǒng)計。

1.3 花生和擬南芥DREB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

擬南芥和花生DREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列利用Clustal X進行多重序列比對,并運用MEGA5.2軟件中的鄰接法(NJ, neighbor-joining)構(gòu)建進化樹,校驗參數(shù)Bootstrap設為1000次[10]。

1.4 花生AhDREB家族基因結(jié)構(gòu)及保守域分析分析

將花生AhDREB基因組序列和編碼序列利用在線GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制外顯子—內(nèi)含子結(jié)構(gòu)圖[11]。利用在線軟件MEME[12](http://meme-suite.org/)對花生AhDREB家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行分析,并利用Adobe Illustrator工具導出圖片。

1.5 花生AhDREB基因家族在不同組織及非生物脅迫下的表達量分析

分析花生AhDREB基因家族在不同組織中的表達量時,從NCBI數(shù)據(jù)庫下載已發(fā)表的花生22個不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(PRJNA291488)[13],查找并下載花生AhDREB基因表達的FPKM值,利用HemI軟件繪制熱圖[14]。

分析花生AhDREB基因家族在不同脅迫條件下的表達量時,挑選萌發(fā)10d后的花生品種“豐花1號”幼苗,分為2個重復組,進行下述脅迫處理:2% NaCl處理24 h,20% PEG6000處理24h,低溫(4℃)處理24h,高溫(37℃)處理24h,不進行任何處理的作為對照。取各處理材料的葉片,用液氮速凍后用于提取總RNA,進行RNA-seq測序,并將原始測序數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(PRJNA553073)。利用此數(shù)據(jù)庫,查找并下載花生AhDREB基因在上述脅迫下的相對表達量,使用Cuffdiff軟件[15]并按以下標準鑒定差異表達基因:① 對照或處理的FPKM值至少有1個大于1;②|Log2 Fold changes|≥1; ③p≤0.05,利用HemI軟件繪制熱圖。

1.6 花生AhDREB基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的qRTPCR驗證

花生RNA 提取采用RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根)。反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(按操作說明進行)。qRT-PCR采用TB Green?remix Ex TaqTMII(Tli RNase H Plus)試劑盒(TaKaRa),按操作說明進行。AhDREB1特異性引物:上游引物:5'-TCCAAGCCATGAAGCCGTAG-3';下游引物:5'-ATTCACTTCCTCGACCACCG-3'。AhDREB12特異性引物:上游引物:5'-TTCGCGAACCAATCAGCAAC-3';下游引物:5'-CCGGAAAGTTCAAACGTGCG-3'。內(nèi)參基因TUA5(NCBI登錄號GO264294)的特異性引物為:上游引物:5'-CTGATGTCGCCGTGCTCTTGG-3';下游引物:5'-CTGTTGAGGTTGGTGTAGGTAGG-3'。所有試驗均設3次生物學重復,數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT法。熒光定量PCR儀采用Roche的Light Cycler 2.0 instrument system。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的鑒定

利用擬南芥AtDREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列在花生數(shù)據(jù)庫進行基因檢索,共得到22個花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列。將這22個AhDREB轉(zhuǎn)錄因子的基因重新命名為AhDREB1到AhDREB22 (表1)。

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),22個AhDREB基因數(shù)目不均勻地分布于A、B兩個基因組中的12條染色體上,其中有8個位于A基因組,14個位于B基因組。在A基因組中,Aradu.A02和Aradu.A04各有1個AhDREB基因,其余的3條染色體存在2個。在B基因組中,Araip.B08上有4個,Araip.B06上有3個,Araip.B04和Araip.B07上分別有2個,其余的染色體上個只有1個。在22個基因中存在多對等位基因,例如,AhDREB5和AhDREB17為一對等位基因,AhDREB1和AhDREB9為一對等位基因。

表1 AhDREB基因信息匯總Table 1 Summary of AhDREB gene information

2.2 花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建

以擬南芥AtDREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員為參考,對花生22條序列進行進化樹的構(gòu)建(圖1)。結(jié)果顯示,與擬南芥AtDREB家族分類相對應,花生AhDREB家族22個成員也可分為6個亞家族:A1、A2、A3、A4、A5和A6,其成員數(shù)量分別為1、12、3、4、1和1個。其中,A1、A4和A5亞家族聚集成一組,A2、A3和A6亞家族聚集成一組,構(gòu)成了進化樹的兩個緊密聯(lián)系的大組。

2.3 花生AhDREB基因結(jié)構(gòu)分析

分析AhDREB的6個亞家族基因結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)他們具有明顯不同的特點(圖2)。22個成員中,除AhDREB2和AhDREB13有4個外顯子,AhDREB10和AhDREB15有3個外顯子外,其余成員只有1～2個外顯子,并且外顯子較多的基因,氨基酸數(shù)目也相對較多,這說明在進化中該家族基因發(fā)生了外顯子數(shù)目增加和長度增長,導致基因大小也隨之增加。

圖1 花生和擬南芥DREB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進化樹Fig.1 A phylogenetic tree of DREB transcription factors from peanut and Arabidopsis

圖2 花生AhDREB基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Gene structure analysis of AhDREB

2.4 花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子motif搜索及保守序列分析

利用MEME軟件對AhDREB蛋白質(zhì)序列進行motif搜索,并構(gòu)建AhDREB轉(zhuǎn)錄因子進化樹及motif分布圖(圖3)。結(jié)果顯示,花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子共鑒定出6種motif,其中motif1和motif2分布最廣泛,保守性最高,分別有29個和27個保守氨基酸。motif1和motif2對應的則是AP2/ERF結(jié)構(gòu)域,motif1的第13位和第18位對應的是AP2/ERF結(jié)構(gòu)域的第14位的纈氨酸(V)和第19位的谷氨酸(E),這是DREB與ERF家族的主要區(qū)別。另外其他4個保守序列motif3、motif4、motif5和motif6,也分布于不同的亞家族中,在亞家族內(nèi)具有保守性。在A2亞家族中,所有成員均含有motif1、motif2和motif3,其 中AhDREB1、AhDREB2、AhDREB9和AhDREB10蛋白序列尾部含有特殊的motif4。A6和A3亞家族中的AhDREB20、AhDREB5、AhDREB17含有特有的motif6。A1、A5及A4亞家族中,除AhDREB3只含有motif1之外,其余成員都含有motif1和motif2,這與進化樹中的分組相一致。上述結(jié)果表明,盡管AhDREB蛋白質(zhì)序列大小存在一定的差異,但內(nèi)部具有高度的保守性。亞家族內(nèi)的AhDREB轉(zhuǎn)錄因子成員motif的種類、數(shù)目和分布相對具有一致性,這同樣也反映了進化樹分組的可靠性。

2.5 花生AhDREB轉(zhuǎn)錄因子基因家族的不同組織表達分析

圖3 花生AhDREB基因家族保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved motifs of AhDREB family members in peanut

利用已發(fā)表的22個花生組織的表達量數(shù)據(jù)對AhDREB進行分析(圖4)。結(jié)果表明,大多數(shù)AhDREB基因在各個組織中的表達量均較低,部分基因在特定組織或發(fā)育時期具有較高的表達水平?；ㄉ鶤hDREB7、AhDREB12和AhDREB21在種子發(fā)育后期表達量較高。AhDREB8和AhDREB21作為一對同源基因具有相同的表達模式,在莖尖、果莢及種子發(fā)育等時期表達量相對較高,這表明兩者在花生發(fā)育過程中具有重要作用。AhDREB6和AhDREB16作為一對同源等位基因,在果針入土后表達量升高,這暗示著兩者可能參與了果針入土后的胚胎發(fā)育過程。

2.6 花生AhDREB基因在不同脅迫條件下的表達分析

為進一步分析花生AhDREB基因在不同脅迫處理條件下的表達變化,利用本實驗室在干旱、高鹽、高溫與低溫脅迫下的花生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(PRJNA354652),分析花生AhDREB家族基因在上述脅迫下的表達量。結(jié)果如圖5所示,共有12個AhDREB基因在高溫、低溫、鹽與干旱脅迫下具有不同的響應模式。其中,有4個AhDREB基因響應干旱脅迫上調(diào)或下調(diào)表達;6個AhDREB基因響應高溫脅迫上調(diào)或下調(diào)表達;4個AhDREB基因響應鹽脅迫上調(diào)或下調(diào)表達,5個AhDREB基因響應低溫脅迫上調(diào)或下調(diào)表達。其中AhDREB1基因在干旱和低溫脅迫下均上調(diào)表達,AhDREB12基因在鹽和高溫脅迫下均上調(diào)表達,推測這兩個基因在脅迫反應中起重要作用。

圖4 花生AhDREB基因表達模式熱圖Fig.4 Expression pattern analysis of AhDREB in peanut

圖5 花生AhDREB家族基因在干旱、鹽、高溫及低溫脅迫下的表達分析Fig.5 Expression pattern analysis of AhDREBs under drought, salt, high temperature and low temperature stresses

2.7 花生AhDREB基因qRT-PCR分析

通過對花生AhDREB基因在不同脅迫條件下的表達分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)AhDREB1基因在干旱和低溫脅迫誘導下均上調(diào)表達,AhDREB12基因在高溫和鹽脅迫誘導下均上調(diào)表達。為了進一步驗證上述結(jié)果,利用qRT-PCR分析AhDREB1與AhDREB12基因在250mmol/L NaCl,20%PEG6000,低溫(4℃)和高溫(45℃)處理下的表達特性。結(jié)果如圖6所示,AhDREB1基因在PEG模擬干旱脅迫條件下呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢,在低溫脅迫條件下逐漸上調(diào)表達;AhDREB12受鹽脅迫誘導上調(diào)表達并呈現(xiàn)先上升后下降而后又上升的表達趨勢,而在高溫脅迫條件下則劇烈上調(diào)表達。

圖6 qRT-PCR分析花生AhDREB基因在干旱、鹽、高溫及低溫脅迫下的表達模式Fig.6 Expression pattern analysis of AhDREBs under drought, salt,high temperature and low temperature stresses using qRT-PCR

3 討論與結(jié)論

花生是我國重要的糧食與油料作物,而干旱、鹽與冷等非生物脅迫嚴重影響著花生的產(chǎn)量與品質(zhì)[16]。因此,培育抗逆的優(yōu)良花生品種,對提高花生產(chǎn)量具有重要的意義[6]。研究表明,轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控在植物響應非生物脅迫方面起著重要的作用[17]。隨著花生基因組測序的完成,越來越多的響應非生物脅迫的轉(zhuǎn)錄因子被鑒定出來。趙小波[18]等利用轉(zhuǎn)錄組測序技術分析了干旱條件下抗旱花生品種“J11”中轉(zhuǎn)錄因子的表達變化,確定存在236個轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生了差異表達,其中60%的轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào),這表明轉(zhuǎn)錄因子能夠提高花生的耐旱性。趙小波[19]等分析了鹽脅迫條件下花生轉(zhuǎn)錄因子的表達情況,共計發(fā)現(xiàn)33個轉(zhuǎn)錄因子家族,包括102個轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào)。陳娜[20]等在花生中篩選到99個與低溫脅迫相關轉(zhuǎn)錄因子,主要包括MYB、WRKY、NAC及AP2/ERF等家族蛋白。

DREB轉(zhuǎn)錄因子家族能夠與DRE/CRT順式作用元件特異性的識別和結(jié)合,同時調(diào)控多個抗逆基因的表達,廣泛參與抗逆生理生化過程,從而調(diào)高植物的抗逆性[21]。利用DREB轉(zhuǎn)錄因子來增強植物的抗逆性的手段目前備受關注。本研究利用生物信息學方法,從花生數(shù)據(jù)庫中分離鑒定了22個AhDREB轉(zhuǎn)錄因子,聚類分析將其分為6個亞組,這與擬南芥中的分類一致[22]。蛋白質(zhì)保守基序分析表明,亞組內(nèi)部蛋白質(zhì)保守基序分布高度相似,均含有AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域,而不同亞組之間存在明顯的不同,這暗示著不同亞組間可能具有不同的功能。在不同組織的表達量分析表明,多數(shù)AhDREB基因在各個組織中表達量均較低甚至不表達,而部分基因在花生特定組織及發(fā)育時期具有較高的表達量。例如AhDREB8、AhDREB12、AhDREB13和AhDREB21在花生莢果發(fā)育時期表達較高;AhDREB13在根中具有較高的表達量。在非生物脅迫條件下,A2組受低溫誘導后表達的基因數(shù)量較多;A1和A2組在干旱及熱激誘導后表達的基因數(shù)量較多,而A3組在鹽處理后表達的基因數(shù)量較多。其中,AhDREB1受干旱及冷條件下誘導顯著上升,AhDREB12在鹽及熱激條件下顯著上升,這暗示著這兩個基因在花生響應非生物脅迫條件下具有重要的作用。