李春娟閆彩霞王 娟孫全喜苑翠玲單世華趙小波

(山東省花生研究所,山東 青島 266100)

花生(ArachishypogaeaL.)是世界四大油料作物之一,是人類食用植物蛋白質(zhì)和植物油的重要來源[1]。我國是世界花生生產(chǎn)大國,占世界花生總產(chǎn)的40%以上,居世界第一位[2]。但是花生產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展深受黃曲霉毒素污染的影響。黃曲霉毒素污染可發(fā)生在花生全產(chǎn)業(yè)鏈的各個環(huán)節(jié),如生長、收獲、晾曬、儲藏和加工等過程,并容易進入食物鏈形成累積效應(yīng)[3],從而危害食品安全。在我國,南方產(chǎn)區(qū)黃曲霉毒素污染主要發(fā)生在生產(chǎn)環(huán)節(jié),而北方產(chǎn)區(qū)污染主要發(fā)生在收獲、加工等過程中[4]。國家近年來提高了花生相關(guān)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn),加之花生黃曲霉毒素污染問題難以解決,導(dǎo)致我國花生出口受到嚴(yán)重影響[5]。

花生防治黃曲霉毒素污染的方法目前主要有三類:物理方法、生物防治和育種方法。目前認(rèn)為,培育抗黃曲霉花生品種是控制毒素污染最理想的途徑[6]。通過基因工程手段將抗黃曲霉基因?qū)牖ㄉ?使花生獲得抗黃曲霉性狀,是快捷、方便培育抗黃曲霉花生種質(zhì)的途徑。高通量測序是系統(tǒng)整體的研究花生抗黃曲霉分子機制、篩選抗黃曲霉基因的重要方法。目前,已有一些研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析了花生抗黃曲霉分子機制[7-10]。

但是,基因表達(dá)存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控編輯過程,轉(zhuǎn)錄組與蛋白組也存在互作因素,總體而言兩者的相關(guān)性不高[11]。利用這種差異可以區(qū)別真正的mRNA與蛋白質(zhì)之間的一致性或不一致性,避免出現(xiàn)假陽性,透露出更多的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控情況。目前,關(guān)于花生抗黃曲霉蛋白質(zhì)研究較少,因此本研究應(yīng)用iTRAQ技術(shù)分析黃曲霉侵染下花生蛋白質(zhì)組表達(dá)變化,以期從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度分析其抵抗機制,為探明花生抗黃曲霉的機制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與處理

以在以往研究中被證實為高抗黃曲霉品種[8,12]的J11為材料,種植于山東省花生研究所萊西試驗基地。所用黃曲霉菌株NRRL3357購自USDA-ARS Culture Collection。菌株在察氏培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7d,收集菌絲于無菌蒸餾水中?；ㄉ镩g生長120d后,侵染花生莢果,方法參照本團隊的國家發(fā)明專利(一種花生種子的黃曲霉田間侵染方法,ZL201510758036.0)。采集侵染0、3、5、7和10d后的花生種皮,混合樣品液氮冷凍后保存于-80℃。以0d的花生種皮為對照,設(shè)3次重復(fù)。

1.2 蛋白質(zhì)組提取與iTRAQ標(biāo)記實驗

標(biāo)記實驗采用冷丙酮方法提取花生根部組織蛋白質(zhì)。提取的蛋白質(zhì)以SDS-PAGE法檢測質(zhì)量。質(zhì)量合格的樣品,每份取蛋白100μg用于后續(xù)實驗。采用iTRAQ Reagent8 Plex Multi-plex試劑盒(AB Sciex,美國)進行樣品處理和標(biāo)記?；旌蠘?biāo)記后的樣品用C18色譜柱進行分級。采用Thermo ScientificTMVanquishTMUHPLC系統(tǒng)高效液相色譜儀(賽默飛公司,美國)和Orbitrap ID-XTMTribridTM質(zhì)譜儀(賽默飛公司,美國)進行液相分離和質(zhì)譜分離。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用Mascot search engine 2.3.02分析軟件(Matrix Science,英國),對質(zhì)譜的原始數(shù)據(jù)RAW文件進行定性分析。檢索數(shù)據(jù)庫為花生基因組數(shù)據(jù)庫(https://peanutbase.org)。肽段搜庫假陽性率FDR設(shè)定為1%。設(shè)定蛋白的差異倍數(shù)(fold change)＞1.2或＜0. 83,且統(tǒng)計檢驗p＜0. 05為差異表達(dá)蛋白(DEPs,different expression proteins)。差異表達(dá)蛋白分別進行GO(Gene Ontolog)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析?；ㄉ鶤hhevamine-A基因生物信息學(xué)分析參照本課題組前期的研究[13]。

1.4 Ahhevamine-A基因生物信息學(xué)分析

Ahhevamine-A基因編碼的蛋白在之前的研究中被證實具有直接抑制黃曲霉菌生長的功能[10]。以Peanut Base(http://peanutbase.org/)上的數(shù)據(jù)(Arahy.RKK33X)為參考,設(shè)計引物5'- ATTAGTTCACAGTCTCTATGC-3'與5'-AAAGTAGGTCTACG-3'擴增其CDS序列。擴增產(chǎn)物與栽培花生基因組中的結(jié)果進行比對。使用DNAMAN對擴增后的產(chǎn)物進行生物信息學(xué)分析。利用ClustalW軟件對Ahhevamine-A基因PCR擴增獲得的序列與GenBank中已有序列信息進行比對與排序。選擇Kimura 2-parameter公式[14]計算遺傳距離。并在MEGA6.0中采用鄰近法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)樹,自舉值Bootstrap為1000次重復(fù)。

1.5 差異表達(dá)蛋白質(zhì)對應(yīng)的基因表達(dá)模式驗證

根據(jù)擴增得到的序列,用 Beacon Designer 7.0設(shè)計熒光定量PCR特異引物(表1)。依據(jù)之前使用的方法,提取花生黃曲霉脅迫的種皮的RNA。使用7500 FAST熒光定量PCR儀(ABI公司)分析14個基因的相對表達(dá)情況。反應(yīng)條件95℃10 s;95℃5 s,60℃30 s,72℃10 s,40個循環(huán);繪制溶解曲線,溫度每10 s升高0.5℃。實驗設(shè)3次重復(fù)。相對表達(dá)量的計算采用2-ΔΔCT方法[15],選擇Actin 11作為內(nèi)參基因[18],實驗數(shù)據(jù)采用SPSS12.0分析(SPSS Inc., Chicago, USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)蛋白鑒定結(jié)果

本試驗共獲得肽段(unique peptide)5245個。經(jīng)過基因組數(shù)據(jù)庫篩選,共鑒定了1382個蛋白質(zhì)。鑒定的蛋白質(zhì)肽段長度主要分布在7～26。在本研究中,黃曲霉侵染脅迫下共計84個蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生變化,包括74個上調(diào)表達(dá)與10個下調(diào)表達(dá),差異倍數(shù)范圍為-1.25～13.04。

2.2 差異蛋白的功能分析

表1 熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers used for analysis of gene expression by Real Time-qPCR

圖1 差異表達(dá)蛋白GO分析Fig.1 GO classifications of proteins differentially expressed in peanut

對鑒定到的84個差異表達(dá)蛋白質(zhì)進行GO(gene ontology)和KEGG數(shù)據(jù)庫功能分析。其中67個蛋白質(zhì)GO注釋成功,并將注釋成功的蛋白質(zhì)分成細(xì)胞組分CC、生物學(xué)過程BP和分子功能MF三大類。最為富集的GO項目為“cell cycle”、“negative regulation of signal transduction”、“2-alkenal reductase activity”與“signal transducer activity”。其他一些GO項目也在花生應(yīng)答黃曲霉侵染中發(fā)揮作用,例如“regulation of response to stress”、“detection of external stimulus”和“flavonoid biosynthetic process”(圖1)。KEGG分析發(fā)現(xiàn),差異蛋白質(zhì)主要富集于“plant pathogen interaction”和“l(fā)ysosome”及“fatty acid metabolism”(圖2)。綜合GO與KEGG分析的結(jié)果, 黃曲霉侵染主要影響花生的代謝通路,且誘導(dǎo)植株抗性機制的運行。

2.3 Ahhevamine-A基因生物信息學(xué)分析

經(jīng)過比對,發(fā)現(xiàn)J11的Ahhevamine-A基因序列與栽培花生基因組(Tifrunner)中相關(guān)序列一致。Ahhevamine-A基因開放閱讀框有1023個堿基,編碼蛋白質(zhì)含有340個氨基酸。其中異亮氨酸、絲氨酸、甘氨酸為含量前三位的氨基酸,分別為36個,29個及26個,占比分別為10.59%,8.53%及7.65%。其編碼蛋白的分子量大小為37.981kD、等電點為5.31,其二級結(jié)構(gòu)見圖3。由TMpred程序預(yù)測該編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)合區(qū)域由內(nèi)到外為6個、由外到內(nèi)的跨膜區(qū)域為4個(圖4)。

圖3 Ahhevamine-A基因氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)Fig.3 Secondary structure of three Ahhevamine-A amino acids

圖4 Ahhevamine-A基因氨基酸序列的多肽跨膜結(jié)合區(qū)域Fig.4 Polypeptide transmembrane binding region of Ahhevamine-A amino acid

圖5 Ahhevamine-A序列系統(tǒng)進化樹Fig.5 Neighbor-Joining (NJ) phylogeny estimated using Ahhevamine-A sequence

2.4 系統(tǒng)進化分析

利用MEGA軟件對Ahhevamine-A基因與部分已知序列在核苷酸水平上進行聚類分析(圖5),結(jié)果表明,落花生屬的幾個種聚成一類,顯示Ahhevamine-A基因在該屬內(nèi)的保守性較強。分析發(fā)現(xiàn)Ahhevamine-A基因與Arachisduranensis和A.ipaensis相關(guān)基因的相似度極高,均達(dá)99%以上。2016年公布的花生基因組測序結(jié)果表明,Arachis duranensis與A.ipaensis經(jīng)自然雜交,形成了今天栽培花生的祖先。Arachisduranensis的基因組與A亞基因組、A.ipaensis的基因與B亞基因組幾乎完全相同[16]。該研究也印證了作為栽培花生,J11的Ahhevamine-A基因與Arachisduranensis及A.ipaensis相關(guān)基因高相似度這一發(fā)現(xiàn)。

3 討 論

目前檢索的有關(guān)花生蛋白質(zhì)組學(xué)方向研究論文,數(shù)量較少,且使用的是雙向(two-dimensional electrophoresis,2-DE)或單向電泳技術(shù)(1-DE)[17-21]。該技術(shù)通過切斷條帶,再用質(zhì)譜方法測量條帶中的蛋白質(zhì)。但是電泳技術(shù)敏感度與精確度相對較低,獲取的數(shù)據(jù)也偏少。iTRAQ技術(shù)具有高度敏感性和精確性,可獲得相對和絕對定量的蛋白質(zhì)結(jié)果,其操作也較為簡便,不需要凝膠[22-23]。

赤霉素是主要的植物激素,且具有調(diào)控植物免疫的功能[24]。本研究發(fā)現(xiàn)赤霉素相關(guān)基因gibberellin20oxidase2-like編碼的蛋白在黃曲霉侵染時上調(diào)表達(dá),相對于轉(zhuǎn)錄組研究的結(jié)果,更加證實其在花生響應(yīng)黃曲霉侵染時的作用。

轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)生物脅迫中發(fā)揮重要作用。bZIP轉(zhuǎn)錄因子被證實參與了植物響應(yīng)生物脅迫,并發(fā)揮了重要作用[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn),一些屬于bZIP家族的轉(zhuǎn)錄因子,例如bZIP17,在花生受到黃曲霉脅迫時上調(diào)表達(dá)。這一結(jié)果與之前的發(fā)現(xiàn)類似[27]。此外,ERF轉(zhuǎn)錄因子家族也參與了花生應(yīng)答黃曲霉脅迫的響應(yīng)過程。本研究中,ERF9編碼的蛋白上調(diào)表達(dá),與Wang等[27]的一致。

大量的抗菌蛋白,例如幾丁質(zhì)酶參與了花生抵御黃曲霉菌侵染的過程[28]。幾丁質(zhì)酶可降解細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì),從而抑制菌絲的生長。此外,幾丁質(zhì)酶可參與合成例如低聚糖等誘導(dǎo)因子,從而激發(fā)植物防御體系[29]。Moore等發(fā)現(xiàn),幾丁質(zhì)酶基因的大量表達(dá)是玉米抵御病菌侵染的主要因素。當(dāng)幾丁質(zhì)酶基因編碼的蛋白含量達(dá)到20 μg/mL時,黃曲霉菌的生長速率降低了50%;當(dāng)?shù)鞍缀窟_(dá)到2.0 mg/mL時,黃曲霉菌的含量趨近為0[28]。在本課題組之前的研究中,也發(fā)現(xiàn)了花生幾丁質(zhì)酶蛋白具有明顯的體外抑制黃曲霉菌生長的特點[10]。