范昊安,沙如意,*,方 晟,薛淑龍,陳 雨,黃 俊,崔艷麗,毛建衛(wèi),4,*

(1.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 杭州 310023;2.紹興文理學(xué)院元培學(xué)院,浙江 紹興 312000;3.浙江大學(xué)理學(xué)部,浙江 杭州 310027;4.浙江工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 紹興 312000)

食用酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果和谷豆類、海藻類、食藥兩用本草類、菌菇類等食材為原料,加(或不加)糖類物質(zhì),經(jīng)多種有益菌通過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵而生產(chǎn)的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品,擁有豐富的次生代謝產(chǎn)物、原料本身營(yíng)養(yǎng)成分和益生菌等功能性成分,特別是富含小分子功能成分[1-2]。

蘋果梨是薔薇科(Rosaceae)梨屬果樹的果實(shí),多產(chǎn)自吉林省延邊自治州[3]。蘋果梨富含氨基酸、微量元素、維生素、多酚類及黃酮類化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4-6],研究表明其具有燥濕健脾、消炎止咳、潤(rùn)肺、利尿、抗真菌、抗氧化等多種功效[7-10]。蘋果梨的貯藏方式單一,貯藏量?jī)H占總產(chǎn)量的3%,加工量不足總量的10%,大部分用于鮮果或者凍梨銷售[11],目前蘋果梨可開發(fā)加工的產(chǎn)品形式有蘋果梨酒、蘋果梨澄清飲料、蘋果梨果脯、蘋果梨果汁、蘋果梨脆片等[3],但蘋果梨在加工過(guò)程中極易發(fā)生褐變,影響產(chǎn)品的外觀品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,研究表明果蔬原料中的酶促褐變主要是由多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)引起的[11-12]。PPO能催化酚類物質(zhì)氧化成為醌,進(jìn)而生成棕褐色或黑色的色素。

基于蘋果梨的加工企業(yè)及加工形式較少,食用酵素作為一種綠色高效的農(nóng)產(chǎn)品加工方式,可以在解決蘋果梨貯藏問(wèn)題的同時(shí),實(shí)現(xiàn)蘋果梨的精深加工,拓寬蘋果梨的應(yīng)用市場(chǎng)。本研究以蘋果梨酵素為研究對(duì)象,通過(guò)跟蹤檢測(cè)蘋果梨發(fā)酵過(guò)程中色度、褐變程度、PPO活力等參數(shù)反映蘋果梨酵素在發(fā)酵過(guò)程中的色澤變化與褐變狀況,通過(guò)跟蹤檢測(cè)pH值、可滴定酸、有機(jī)酸、總酚、總黃酮含量變化分析酶促褐變的影響因素及蘋果梨發(fā)酵過(guò)程中活性成分的變化;以1,1-二苯基-2-苦苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽(yáng)離子自由基清除能力、羥自由基清除能力、過(guò)氧化氫清除能力和還原力為抗氧化性指標(biāo),評(píng)價(jià)蘋果梨酵素的抗氧化活性,以期為蘋果梨酵素的綜合開發(fā)提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果梨由吉林省延吉市蘋果梨種植基地提供;白砂糖(食品級(jí)) 太古糖業(yè)(中國(guó))有限公司;酵液由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

標(biāo)準(zhǔn)品(檸檬酸、抗壞血酸) 美國(guó)Sigma公司;甲醇(色譜純) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;KH2PO4(色譜純)、鄰苯二酚、ABTS 上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司;DPPH 日本TCI公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

316L型50 L不銹鋼發(fā)酵罐由浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

916 Ti-Touch電位滴定儀 瑞士Metrohm公司;PHS-3C精密酸度計(jì) 杭州齊威儀器有限公司;UV-5500PC紫外分光光度計(jì) 上海市元析儀器有限公司;CM-5分光測(cè)色計(jì) 日本Konica Minolta公司;e2695高效液相色譜(配有Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器)儀 美國(guó)Waters公司;SpectraMax iD5多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果梨酵素的制備

用無(wú)菌水沖洗新鮮蘋果梨(果實(shí)完全成熟且無(wú)蟲害潰爛),自然瀝干后切塊,將蘋果梨和白砂糖以質(zhì)量比1∶1加入高壓蒸汽滅菌過(guò)的50 L不銹鋼發(fā)酵罐中,并加入適量酵液,于(20±5)℃避光發(fā)酵,定期取樣,將樣品離心后的上清液保存于-80 ℃超低溫冰箱中,待測(cè)。

1.3.2 色度的測(cè)定

使用分光測(cè)色計(jì)對(duì)蘋果梨酵素進(jìn)行測(cè)定,記錄L*、a*、b*值。其中,L*值表示樣品色澤的亮度,a*值表示紅度或綠度,b*值表示黃度或藍(lán)度。以鮮榨蘋果梨汁為參比標(biāo)準(zhǔn)溶液,計(jì)算色差值ΔE,ΔE越小表示待測(cè)樣品與參比樣品色澤越接近,反之為相差越大。ΔE計(jì)算公式如下:

1.3.3 褐變程度的測(cè)定[13]

取2 mL酵素樣品,以去離子水作空白對(duì)照,測(cè)定其在420 nm波長(zhǎng)處吸光度,吸光度即為蘋果梨酵素的褐變程度。

1.3.4 PPO活力的測(cè)定[14]

在96 孔板中快速加入磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)160 μL,0.1 mol/L鄰苯二酚溶液15 μL,酵素樣品30 μL,混勻,于30 ℃反應(yīng)5 min,利用酶標(biāo)儀在420 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,記錄反應(yīng)開始與結(jié)束時(shí)的吸光度。在此測(cè)定條件下,吸光度每分鐘增加0.001定義為一個(gè)酶活力單位(U),計(jì)算如式(2)所示:

式中:ΔA420nm為反應(yīng)前后吸光度差值;D為稀釋倍數(shù);t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.3.5 pH值與可滴定酸的測(cè)定

使用精密pH計(jì)測(cè)定酵素樣品的pH值。

使用電位滴定儀測(cè)定酵素樣品的可滴定酸含量,參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定方法》中的pH電位法,結(jié)果參考T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》,以乳酸質(zhì)量濃度(g/100 mL)計(jì)。

1.3.6 有機(jī)酸含量的測(cè)定[15]

取400 μL酵素樣品,使用0.01 mol/L KH2PO4(pH 2.7)溶液稀釋至1 mL,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,待測(cè)。配制質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的抗壞血酸、檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾,待測(cè)。

檢測(cè)條件:色譜柱:Atiantis?T3柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-KH2PO4(pH 2.7)2∶98(V/V);流速:1.0 mL/min;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm。檢測(cè)器:二極管陣列檢測(cè)器。

1.3.7 總酚含量的測(cè)定

采用福林-酚法[16]測(cè)定蘋果梨酵素中總酚含量。取100 μL酵素樣品,用去離子水稀釋至0.5 mL,加入體積分?jǐn)?shù)為10%的福林-酚溶液2.5 mL,常溫避光靜置反應(yīng)3 min后,加入75 g/L Na2CO3溶液2 mL,混勻。于25 ℃反應(yīng)1 h,在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.3.8 總黃酮含量的測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[17]測(cè)定蘋果梨酵素中總黃酮含量。取400 μL酵素樣品,加入50 g/L NaNO2溶液150 μL,混勻靜置6 min,加入100 g/L Al(NO3)3溶液150 μL,混勻靜置6 min,加入40 g/L NaOH溶液2.0 mL,用去離子水定容至5 mL,混勻靜置15 min,在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。

1.3.9 DPPH自由基清除能力的測(cè)定[18]

取200 μL酵素樣品,用去離子水稀釋至2 mL,加入0.1 mmol/L DPPH-甲醇溶液4 mL,50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)450 μL,于25 ℃恒溫水浴反應(yīng)30 min,以去離子水為空白對(duì)照,在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。自由基清除率計(jì)算如式(3)所示:

式中:A0為空白對(duì)照吸光度;A1為樣品吸光度;A2為樣品本底管吸光度。

1.3.10 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的測(cè)定[19]

ABTS稀釋液配制:稱取96.02 mg ABTS和16.55 mg過(guò)硫酸鉀,用5 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)定容至25 mL,在暗處室溫放置12～16 h,使用前,用上述磷酸鹽緩沖液稀釋,使其在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度為0.70±0.02。

取4 μL酵素樣品,用上述磷酸鹽緩沖液稀釋至300 μL,加入ABTS稀釋液5 mL,于30 ℃反應(yīng)1 h。以去離子水為空白對(duì)照,在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率計(jì)算如式(3)所示。

1.3.11 羥自由基清除能力的測(cè)定[20]

取500 μL酵素樣品,用去離子水稀釋至2 mL,加入6 mmol/L H2O2溶液1.4 mL,20 mmol/L水楊酸鈉溶液0.6 mL和1.5 mmol/L FeSO4溶液2 mL,混勻,于37 ℃恒溫水浴反應(yīng)1 h。以去離子水為空白對(duì)照,在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。羥自由基清除率計(jì)算如式(3)所示。

1.3.12 過(guò)氧化氫清除能力的測(cè)定[21]

取500 μL酵素樣品,用去離子水補(bǔ)至1 mL,加入8 mmol/L H2O2溶液1.2 mL,混合均勻,于室溫靜置10 min。以去離子水為空白對(duì)照,在230 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。過(guò)氧化氫清除率計(jì)算如式(3)所示。

1.3.13 還原力的測(cè)定[22]

取200 μL酵素樣品,用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)補(bǔ)至2.5 mL,加入10 g/L鐵氰化鉀溶液2.5 mL,混合均勻,于50 ℃反應(yīng)30 min,再加入100 g/L三氯乙酸溶液2.5 mL,混合均勻,靜置10 min,立即取2.5 mL上清液,加入去離子水2.5 mL和1 g/L三氯化鐵溶液0.5 mL,混合均勻。以去離子水為空白對(duì)照,在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中色度的變化

色澤是衡量酵素品質(zhì)質(zhì)量的重要物理指標(biāo),同時(shí)也可以反映蘋果梨酵素在發(fā)酵過(guò)程中的褐變狀況。如表1所示,發(fā)酵過(guò)程中色度變化顯著(P＜0.05)。L*代表亮度,L*值下降可以直觀反映蘋果梨加工過(guò)程中褐變的發(fā)生[23]。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),L*值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),發(fā)酵第80天L*值達(dá)到最低值,為58.71±0.00,發(fā)酵140 d,L*值回升至96.32±0.11。a*＞0代表紅色色調(diào),b*＞0代表黃色色調(diào),在發(fā)酵過(guò)程中兩者均呈先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵5～80 d,a*值從0.66±0.01上升至18.98±0.02,說(shuō)明隨著褐變的發(fā)生,蘋果梨酵素逐漸呈現(xiàn)紅褐色。發(fā)酵80～140 d,a*值回降至0.90±0.06,說(shuō)明發(fā)酵后期紅色色調(diào)基本消失,復(fù)色為蘋果梨汁本色。在發(fā)酵過(guò)程中,b*值從5.32±0.01上升至10.23±0.15,說(shuō)明長(zhǎng)期發(fā)酵適當(dāng)加深了蘋果梨酵素的淡黃色色調(diào)。結(jié)果表明,發(fā)酵140 d的蘋果梨酵素總色調(diào)呈鮮亮的淡黃色,復(fù)色效果明顯。

表1 發(fā)酵過(guò)程中色度的變化Table 1 Changes in chroma during fermentation

圖1 發(fā)酵過(guò)程中色差的變化Fig. 1 Changes in chromatic aberration during fermentation

色差值ΔE越小,蘋果梨酵素的色度越接近鮮榨蘋果梨汁(L*=96.94±0.01,a*=-0.56±0.01,b*=8.26±0.03)。如圖1所示,發(fā)酵過(guò)程中ΔE值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵前15 d,ΔE值均小于5,說(shuō)明無(wú)明顯褐變發(fā)生。發(fā)酵20～80 d,ΔE快速上升,酵素總體呈現(xiàn)紅褐色。發(fā)酵80 d后,ΔE值急劇下降,并在發(fā)酵第140天達(dá)到最低值2.53±0.19。發(fā)酵第140天時(shí)色澤變化最小,且其ΔE值與發(fā)酵第10天無(wú)顯著差異(P＞0.05),說(shuō)明較長(zhǎng)期的發(fā)酵過(guò)程保持了蘋果梨的綜合色度,起到了有效的護(hù)色復(fù)色效果。

2.2 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中褐變程度的變化

圖2 發(fā)酵過(guò)程中褐變程度的變化Fig. 2 Changes in browning degree during fermentation

由圖2可知,褐變程度在發(fā)酵過(guò)程中呈先上升后下降的趨勢(shì),其變化趨勢(shì)與L*值相反。發(fā)酵5～40 d,褐變程度快速上升且于發(fā)酵15～20 d上升速度最快,增幅達(dá)到312.46%。發(fā)酵40～80 d,褐變程度進(jìn)一步上升,并在發(fā)酵第80天時(shí)達(dá)到最高值2.010±0.002。發(fā)酵前期褐變程度的上升主要源于PPO引起的酶促褐變,高糖滲透壓導(dǎo)致多酚、黃酮類物質(zhì)的溶出與細(xì)胞內(nèi)PPO的釋放,使得底物、酶與氧氣充分接觸,從而促進(jìn)酶促褐變的發(fā)生[24]。在發(fā)酵后期,褐變程度持續(xù)下降至0.706±0.004,由此可知酶促褐變?cè)诎l(fā)酵后期受到控制。李梅等[25]研究發(fā)現(xiàn)毛竹筍自然發(fā)酵63 d的L*值相較發(fā)酵21 d明顯回升,更有效保持毛竹筍的綜合色澤,說(shuō)明延長(zhǎng)發(fā)酵具有一定的生物護(hù)色效果。

2.3 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中PPO活力的變化

梨中的PPO是引起酶促褐變的主要原因之一,酚類物質(zhì)在PPO催化作用下氧化為鄰醌及其聚合物類黑色素,進(jìn)而導(dǎo)致色澤加深、變暗[26]。如圖3所示,PPO活力在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),與褐變程度變化趨勢(shì)相似,說(shuō)明蘋果梨酵素的褐變一定程度上由PPO引起的酶促褐變所致。發(fā)酵前50 d,PPO活力快速上升,于第50天達(dá)到酶活力峰值(26.26±0.28)U/mL,發(fā)酵前期PPO活力增強(qiáng)可能與蘋果梨果肉組織損傷有關(guān)[27]。發(fā)酵50 d后,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),PPO活力不斷下降,發(fā)酵第80天蘋果梨酵素中PPO活力與發(fā)酵第20天己無(wú)明顯差異(P＞0.05),這可能與發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸、多酚類、黃酮類化合物等活性物質(zhì)的生成代謝有關(guān)。在生產(chǎn)實(shí)踐中,抑制PPO活力是加工過(guò)程中抑制酶促褐變的主要方法,在蘋果梨酵素制作的過(guò)程中,通過(guò)自身因素抑制PPO活力,從而達(dá)到護(hù)色目的,為有效控制酶促褐變提供了經(jīng)濟(jì)環(huán)保的新思路。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中PPO活力的變化Fig. 3 Changes in PPO activity during fermentation

2.4 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中pH值與可滴定酸的變化

圖4 發(fā)酵過(guò)程中pH值和可滴定酸含量的變化Fig. 4 Changes in pH value and total titratable acidity during fermentation

如圖4所示,pH值和可滴定酸含量在發(fā)酵過(guò)程中呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)。pH值在20 d內(nèi)由5.10±0.05迅速下降至4.37±0.06,后期緩慢下降直至穩(wěn)定于4.14±0.02。權(quán)伍榮等[28]研究表明當(dāng)pH值小于4.20時(shí),蘋果梨PPO活力幾乎為0。其原因在于PPO為含銅蛋白質(zhì),在低pH值時(shí),PPO中的輔基銅會(huì)被解離成銅離子,同時(shí)酸性較強(qiáng)會(huì)使蛋白質(zhì)變性,導(dǎo)致PPO失活[29]。發(fā)酵第50天,蘋果梨酵素pH值降至4.20±0.02,由圖3可知,同期PPO活力亦開始下降,說(shuō)明發(fā)酵產(chǎn)生的低pH值環(huán)境較好地抑制了PPO活力。發(fā)酵過(guò)程中,可滴定酸呈逐漸上升趨勢(shì),且在前30 d上升速率較快,后期趨于平緩,由(0.017±0.003)g/100 mL上升至(0.320±0.004)g/100 mL。發(fā)酵前期可滴定酸含量的快速上升是由于發(fā)酵過(guò)程中醋酸、草酸等多種有機(jī)酸的生成所致[30]。發(fā)酵后期可滴定酸含量的緩慢上升可能是因?yàn)镻PO引起的酶促褐變消耗大量氧氣,微生物在溶氧不足的條件下將乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸,將己糖轉(zhuǎn)化為乳酸等有機(jī)酸[31],但同時(shí)檸檬酸與抗壞血酸含量不斷下降,使可滴定酸含量上升趨勢(shì)較為平緩。

2.5 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化

如圖5所示,發(fā)酵過(guò)程中抗壞血酸和檸檬酸含量呈先上升后下降的趨勢(shì)。檸檬酸前15 d未檢出,說(shuō)明檸檬酸是由蘋果梨酵素發(fā)酵代謝產(chǎn)生的,并在發(fā)酵第40天達(dá)到最大值(0.587±0.011)mg/mL?？箟难崾翘O果梨中主要有機(jī)酸之一[32],其質(zhì)量濃度在發(fā)酵第50天達(dá)到最大值(0.794±0.001)mg/mL。發(fā)酵后期兩者含量的降低可能是與PPO及其褐變產(chǎn)物反應(yīng)消耗所致。部分有機(jī)酸對(duì)酶促褐變具有雙重抑制作用,在降低pH值的同時(shí),抗壞血酸可以將醌類及其衍生物還原成酚類物質(zhì)[33],甚至可以作為競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑被PPO直接氧化,從而起到控制褐變的作用;檸檬酸可以鰲合PPO的銅離子輔基,進(jìn)而抑制其活力[27]。Sapers等[34]研究發(fā)現(xiàn)相較單獨(dú)使用褐變抑制劑,抗壞血酸和檸檬酸兩者聯(lián)用具有更好的褐變抑制效果。由此可知,蘋果梨酵素通過(guò)微生物發(fā)酵代謝生成抗壞血酸和檸檬酸,在解決抗壞血酸自身成本問(wèn)題的同時(shí),有效控制酶促褐變,達(dá)到護(hù)色效果。

圖5 發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸含量的變化Fig. 5 Changes in organic acid content during fermentation

2.6 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化

圖6 發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的變化Fig. 6 Changes in total phenolic content during fermentation

如圖6所示,發(fā)酵過(guò)程中總酚含量呈迅速上升后趨于平緩的趨勢(shì)。在發(fā)酵前20 d,總酚含量快速上升,增長(zhǎng)約17.52 倍,可能與發(fā)酵前期蘋果梨中的多酚類物質(zhì)大量溶出有關(guān)。發(fā)酵20 d后,總酚含量緩慢上升,于第140天達(dá)到最大值(0.426±0.004)mg/mL,這可能是隨著發(fā)酵的進(jìn)行,在微生物作用下,單體酚類物質(zhì)的合成所致[35]。王磊等[36]研究表明底物濃度(即總酚含量)在低范圍時(shí),隨著總酚含量的增加,PPO活力也相應(yīng)增強(qiáng),但隨著總酚含量的持續(xù)增長(zhǎng),高濃度的底物會(huì)對(duì)PPO活力起到抑制作用,進(jìn)一步說(shuō)明蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中總酚含量的上升抑制了PPO活力,從而控制酶促褐變的發(fā)生。

2.7 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量的變化

圖7 發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量的變化Fig. 7 Changes in total flavonoid content during fermentation

如圖7所示,發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量呈先迅速上升,后有所下降,再持續(xù)上升的趨勢(shì)。在發(fā)酵前30 d,總黃酮質(zhì)量濃度快速上升,并于第30天達(dá)到最大值(44.522±0.338)μg/mL。發(fā)酵第50天總黃酮含量的下降可能是因?yàn)榇藭r(shí)PPO活力最強(qiáng),黃酮類化合物在PPO的作用下被氧化分解。隨后,總黃酮質(zhì)量濃度持續(xù)上升至(44.443±0.276)μg/mL,這可能是由于游離態(tài)的黃酮醇類物質(zhì)與糖苷結(jié)合而成的黃酮醇配糖體在發(fā)酵后期發(fā)生水解,導(dǎo)致總黃酮含量回升[37]。

2.8 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除率的變化

圖8 發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除率的變化Fig. 8 Changes in DPPH radical scavenging activity during fermentation

如圖8所示,發(fā)酵過(guò)程中DPPH自由基清除率呈迅速上升后趨于平緩的趨勢(shì)。發(fā)酵前30 d,DPPH自由基清除率快速上升至最大值(90.91±0.74)%,隨后趨于平緩,說(shuō)明適當(dāng)延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間可明顯提高蘋果梨酵素的抗氧化活性。Galvis Sáchez等[38]研究表明6 種不同梨品種的果實(shí)及其果皮均具有良好的DPPH自由基清除能力,且清除DPPH自由基可能是梨中多種酚類物質(zhì)共同作用的結(jié)果。

2.9 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的變化

如圖9所示,發(fā)酵過(guò)程中ABTS陽(yáng)離子自由基清除率呈迅速上升后趨于平緩的趨勢(shì)。發(fā)酵前20 d,ABTS陽(yáng)離子自由基清除率從(12.86±0.48)%快速上升至(93.74±0.65)%。隨后清除率緩慢上升直至平緩,并于第80天達(dá)到最大值(99.82±0.18)%。蘋果梨酵素ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力變化趨勢(shì)與其總酚含量變化相似,說(shuō)明兩者具有極顯著的相關(guān)性(P＜0.01),與葡萄酵素的研究結(jié)果一致[39]。

圖9 發(fā)酵過(guò)程中ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的變化Fig. 9 Changes in ABTS cation radical scavenging activity during fermentation

2.10 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中羥自由基清除率的變化

圖10 發(fā)酵過(guò)程中羥自由基清除率的變化Fig. 10 Changes in hydroxyl radical scavenging activity during fermentation

如圖10所示,發(fā)酵過(guò)程中羥自由基清除率呈持續(xù)上升的趨勢(shì)。發(fā)酵前10 d,蘋果梨酵素對(duì)羥自由基具有促氧化作用,但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),羥自由基清除率不斷上升,當(dāng)發(fā)酵第110天時(shí)達(dá)到最大值(70.74±0.88)%。趙金偉等[10]研究表明蘋果梨酚類物質(zhì)對(duì)羥自由基的清除能力較強(qiáng),說(shuō)明適當(dāng)發(fā)酵可以抑制蘋果梨酵素發(fā)酵前期不良的促氧化作用,并進(jìn)一步增強(qiáng)其在發(fā)酵后期的羥自由基清除能力。

2.11 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中過(guò)氧化氫清除率的變化

圖11 發(fā)酵過(guò)程中過(guò)氧化氫清除率的變化Fig. 11 Changes in hydrogen peroxide scavenging activity during fermentation

過(guò)氧化氫自身在細(xì)胞內(nèi)并不活躍,但其在金屬離子作用下會(huì)產(chǎn)生羥自由基,從而造成細(xì)胞損傷[40]。如圖11所示,發(fā)酵過(guò)程中過(guò)氧化氫清除率呈迅速上升后趨于平緩的趨勢(shì)。在發(fā)酵第20天快速上升至(96.25±1.06)%后,過(guò)氧化氫清除率基本穩(wěn)定,且于發(fā)酵第80天達(dá)到最大值(98.81±1.21)%。陳斐冷等[41]研究表明高異黃酮和酚類等物質(zhì)具有極強(qiáng)的過(guò)氧化氫清除能力,蘋果梨酵素過(guò)氧化氫清除能力的快速提升可能與其總酚和總黃酮含量的變化有關(guān)。

2.12 蘋果梨酵素發(fā)酵過(guò)程中還原力的變化

Fe3+的還原反應(yīng)通常被用來(lái)判斷供電子基團(tuán)的強(qiáng)弱,其所反映的還原力與眾多抗氧化機(jī)制密切相關(guān)[42]。如圖12所示,發(fā)酵過(guò)程中還原力呈持續(xù)上升的趨勢(shì),并于發(fā)酵第140天達(dá)到最大值0.666±0.001,相較發(fā)酵第5天增長(zhǎng)了4.4 倍。郭紅蓮等[43]研究表明相較于未發(fā)酵的枸杞液,枸杞酵素的還原力顯著提高。發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)有利于蘋果梨酵素還原力的增強(qiáng)。

圖12 發(fā)酵過(guò)程中還原力的變化Fig. 12 Changes in reducing power during fermentation

2.13 相關(guān)性分析

圖13 發(fā)酵過(guò)程中各理化指標(biāo)與抗氧化活性的相關(guān)性分析熱圖Fig. 13 Heatmap from correlation analysis between physicochemical parameters and antioxidant activity during fermentation

由圖13可知,褐變狀況方面,L*值、色差、褐變程度、PPO活力間呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P＜0.01);褐變控制方面,pH值、可滴定酸、抗壞血酸、檸檬酸、總酚、總黃酮與褐變程度、PPO活力亦具有顯著相關(guān)性(P＜0.05),說(shuō)明pH值、可滴定酸、抗壞血酸、檸檬酸、總酚、總黃酮等因素可以有效抑制蘋果梨酵素的褐變;抗氧化活性方面,總酚、總黃酮、檸檬酸含量與DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基、羥自由基清除能力、過(guò)氧化氫清除能力、還原力之間均存在極顯著正相關(guān)性(P＜0.01),說(shuō)明多酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)和有機(jī)酸具有較好的抗氧化活性。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)測(cè)定色度、色差、褐變程度、PPO活力等參數(shù)反映蘋果梨酵素在發(fā)酵過(guò)程中的色澤變化與褐變狀況,結(jié)果表明:較長(zhǎng)期發(fā)酵可以有效控制PPO引起的酶促褐變,其褐變控制與pH值、可滴定酸、抗壞血酸、檸檬酸、總酚、總黃酮等理化指標(biāo)的變化顯著相關(guān)(P＜0.05),為蘋果梨的加工、護(hù)色、復(fù)色提供科學(xué)合理的新方法。同時(shí)測(cè)定DPPH自由基清除率、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率、羥自由基清除率、過(guò)氧化氫清除率、還原力等指標(biāo),結(jié)果表明:蘋果梨酵素在發(fā)酵過(guò)程中抗氧化活性均呈先快速增加后趨于平緩的趨勢(shì)。經(jīng)過(guò)發(fā)酵,其抗氧化活性得以大幅度提升,抗氧化活性的提高與總酚、總黃酮、檸檬酸含量的變化顯著相關(guān)(P＜0.05)。蘋果梨酵素富含有機(jī)酸、多酚類化合物、黃酮類化合物等活性成分,其協(xié)同作用可能抑制褐變,且具有良好的抗氧化活性,說(shuō)明發(fā)酵制備酵素是蘋果梨高值化利用的一種加工方式。