劉茵茵 羅丹 屈晶晶 閆曉煜

結腸癌是目前全世界高發(fā)的惡性腫瘤［1］，嚴重威脅人們的身心健康。眾所周知，早期結直腸癌患者治愈率比較高，5年生存率可達到90%，但因缺乏有效的早期診斷方法，結腸癌患者確診時多已為中晚期，其生存率僅為10%～15%［2］。最新研究表明，目前結腸鏡檢查仍然是對結腸癌敏感性最高的篩查工具，但有一定風險，且目前尚無更好的篩查方法可以替代［3］。病例分期是術后正確選擇治療方案、制定隨訪計劃和預測生存率的關鍵依據(jù)［4］，而TNM分期仍然是最強大的預測指標［5］。lncRNAs是近年來發(fā)現(xiàn)的一類非編碼RNA，其會產(chǎn)生長＞200bp且多的外顯子轉錄本，這些轉錄本通常不會被翻譯成蛋白質［6］。近年來大量研究表明，腫瘤的復發(fā)、轉移及患者的預后均與lncRNAs的表達失調密切相關，其表達譜可能作為診斷惡性腫瘤的一類新的生物標志物［7-9］。結腸癌的演變進程復雜且緩慢，涉及繁雜的基因和蛋白表達變化。因此，篩查并驗證結腸癌相關基因及蛋白的表達譜有利于提高早期結腸癌的診斷率，從而提高患者治愈率并延長生存時間。多項研究表明［10，11］，在結腸癌組織中多條lncRNAs表達上調，且與患者不良預后緊密關聯(lián)，如CCAT1、HOTAIR。仍有大量結腸癌相關的lncRNAs亟待探索。隨著對lncRNAs與結腸癌的深入研究，其異常表達對結腸癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移的作用也將越來越明確，很有可能尋找到對結腸癌高度敏感的lncRNAs作為結腸癌早期診斷的重要指標。故而，本研究將針對5種篩選出的lncRNAs構建多個指標聯(lián)合篩檢早期結腸癌的Logistic多因素分析模型，探索其在結腸癌患者血清學診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 STEP one plus QPCR(美國ABI公司)，高速冷凍離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)，水平電泳槽(北京六一)，電泳儀電源(北京六一)。

1.2 主要試劑 Trizol Reagent A350-1(invitrogen)，逆轉錄RT試劑盒(Fermentas)，Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI)，RNA酶抑制劑(Fermentas)，96孔PCR板密封蓋(Axygen)，AgaroseⅠ瓊脂糖(Amresco)等試劑。

1.3 方法

1.3.1 43例結腸癌患者(結腸癌組)中各型結腸癌臨床診斷均符合《中國結直腸癌診療規(guī)范(2017)》［2］，男27例，女16例；年齡40～70歲。27例正常對照組(NC組)中男12例，女15例；年齡27～71歲，均為同期體檢正常并排除其他干擾疾病的健康者。

1.3.2 篩選目標lncRNAs采用文獻篩選的方法篩選結腸癌患者中表達差異的lncRNAs(5條)作為研究對象。

1.3.3 qRT-PCR驗證表達差異的lncRNAs采用TRIzol LS法提取血清樣本中的總RNAs。采用qRTPCR相對定量法檢測候選的5種lncRNAs的表達情況。

1.3.4 將結腸癌組與NC組組成一個有序分類變量，分析lncRNAs表達譜診斷結腸癌的正確率。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行ROC和Logistic回歸分析。t檢驗作兩組間的比較；ROC曲線法計算每個lncRNAs診斷結腸癌的Se、Sp、Youden指數(shù)、AUC、cut off等特征參數(shù)。

2 結果

2.1 兩組血清中l(wèi)ncRNAs的表達情況比較 兩組血清中l(wèi)ncRNAs的ROC曲線，見圖1。結腸癌組CCATI、HOTAIR、LincRNAP2、SOX2OT、ANRIL的表達值分別為(25.62±17.07)、(4.71±2.86)、(1.29±0.63)、(2.98±1.41)、(3.81±2.62) ；NC組 CCATI、HOTAIR、LincRNAP2、SOX2OT、ANRIL的表達值分別為(1.39±0.71)、(1.04±0.45)、0.81±0.41)、(1.26±0.63)、(1.36±0.80)；結腸癌組CCATI、HOTAIR、LincRNAP2、SOX2OT、ANRIL的表達值高于NC組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

圖1 結腸癌組血清中l(wèi)ncRNAs的ROC曲線

2.2 5種lncRNAs中ROC分析結果及特征參數(shù) CCAT1的AUCROC最高，達到0.924；其次分別為HOTAIR(0.904)、SOX2OT(0.895)、ANRIL(0.868)，而LincRNAP2的AUCROC最低，僅0.602，故而此次試驗排除該條lncRNAs，不將其作為聯(lián)合預測分期的選擇；靈敏度最高的是CCAT1，最低的是SOX2OT；特異度最高的是CCAT1，最低的是LincRNAP2。見表2。

表1 兩組血清中l(wèi)ncRNAs的表達情況比較()

表1 兩組血清中l(wèi)ncRNAs的表達情況比較()

注：與NC組比較，aP＜0.05

表2 5種lncRNAs中ROC分析結果及特征參數(shù)

2.3 系列試驗組合檢測特征參數(shù) 鑒于結腸癌患者血清CCAT1表達值的Se、Sp均較高，為大量研究和試驗所證實，故此以CCAT1為基本檢測項目，結合文獻及試驗篩選出的3種lncRNAs，進行CCAT 1加 1～ 3種的lncRNAs系列試驗，篩選 Youden指數(shù)和準確度高組合項。見表3。

表3 系列試驗組合檢測特征參數(shù)

3 討論

據(jù)報道，腫瘤的復發(fā)、轉移以及患者的預后均與lncRNAs的表達失調緊密關聯(lián)，其表達譜可能成為診斷惡性腫瘤的一類新的生物標志物。作為標志物，Se與Sp越高，準確性越高，用于早期診斷、療效評估、預后判定等的價值越高［12］。目前結腸鏡檢查是對結腸癌敏感性最高的篩查工具，但過程有一定風險；而lncRNAs僅需抽取患者血清即可進行檢測，無風險，但若應用于臨床，還需有較高的Se或 Sp［13］。一種lncRNAs檢測能力有限，若聯(lián)合幾種lncRNAs標志物可以提高診斷效率。本研究所檢測的5種腫瘤標志物，其中CCAT1在結腸癌中的作用研究已相對成熟，但其尚未應用于臨床，Se與Sp還需進一步提高。本文聯(lián)合Logistic多因素分析方法和ROC曲線，用AUCROC、Se、Sp等指標探索lncRNAs的診斷價值。

3.1 單項指標鑒別診斷結腸癌的臨床價值 本研究對ROC區(qū)線下面積和Se、Sp、Youden等指標進行了綜合評價，最大限度提高評價診斷試驗準確性。本研究結果顯示，用于診斷結腸癌的lncRNAs中，AUCROC≥0.7的指標有CCAT1、HOTAIR、SOX2OT、ANRIL，表明其有一定的準確性，可作為預測結腸癌的單項指標。其中又以CCAT1的AUCROC最大，診斷價值最高，其Sp、Youden指數(shù)、Se也最大；而LincRNAP2的AUCROC最低，故而舍棄。

3.2 多指標聯(lián)合診斷對診斷結腸癌的臨床價值 理想的鑒別指標要求既靈敏又特異，高Se利于篩選，減少漏診; 高Sp則有助于診斷，避免誤診。在臨床實踐中，經(jīng)常會應用多指標的聯(lián)合進行診斷。本文聯(lián)合診斷常采用系列試驗，可提高Sp。本研究結果顯示，多指標聯(lián)合診斷的效率明顯優(yōu)于單項指標，且隨著聯(lián)合指標的增加，系列試驗的Sp隨之升高，表明聯(lián)合診斷的指標越多其診斷效率越高。但并非指標越多越好，鑒于CCAT1研究相對成熟其作用已被證實［14］，本研究以CCAT1為基本檢測項目，聯(lián)合其他標志物進行CCAT1加其他1～3項隨機組合的聯(lián)合試驗，做等級多分類Logistic回歸分析，然后用其概率做ROC曲線，結果顯示，系列試驗中CCAT1+HOTAIR+SOX2OT的平行線檢驗大于0.05，該假設被認可，而且其組合Sp為98.4%，Youden指數(shù)0.856，Se為87.2%，AUCROC為0.982。

本研究嘗試應用Logistic回歸綜合多指標信息，根據(jù) ROC曲線確定診斷界值，同時增加診斷的Se和Sp。本次研究中單個CCAT1用于診斷結腸癌，其AUCROC達到0.924，Se達到0.903，Sp達到0.894，說明其對結腸癌的鑒別效能較高。

綜上所述，CCAT1將可能作為結腸癌的診斷、病情監(jiān)測及患者預后評估的分子標記物，但其對結腸癌TNM分期的鑒別效能有待進一步研究。經(jīng)文獻篩選出的LincRNAP2，在本次研究中卻不具有檢驗效能，可能與樣本量過少有關，其具體效能有待商榷。多指標聯(lián)合診斷的效率優(yōu)于單項指標，且聯(lián)合指標增加，系列試驗的特異度隨之升高。該方法亦可應用于其他疾病診斷實驗的資料分析中，有著廣泛的應用前景。