李 躍，李國瑞，陳永勝,,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

花色苷是廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，促使許多植物和果實(shí)形成紅色、藍(lán)色和紫色，屬于類黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、抗疲勞、抗衰老、抗腫瘤以及預(yù)防心腦血管疾病等多種生物活性，是植物界中重要的抗氧化劑和抗菌劑[1-2]。隨著人們對天然營養(yǎng)品需求的不斷提高，將天然提取色素（如花色苷）應(yīng)用于食品加工中已成發(fā)展趨勢[3-4]?；ㄉ盏慕Y(jié)構(gòu)如圖1所示，通過對花色苷R1、R2、R3、R4、R5和R6進(jìn)行糖基化、羥基化、甲基化或乙酰化等修飾，可以產(chǎn)生多種花色苷同源物（表1）。

圖1 花色苷結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Structure of anthocyanins

表1 代表性花色苷及其結(jié)構(gòu)Table 1 Representative anthocyanins and their structures

傳統(tǒng)花色苷主要來源于植物材料的提取，如從水果、鮮花或其他植物組織中提取純化[5-7]。植物提取法具有原料廉價和技術(shù)先進(jìn)等優(yōu)點(diǎn)，同時，隨著人們對植物中花色苷合成及花色苷遺傳代謝工程的研究與應(yīng)用，從植物中提取和純化花色苷的方式已取得較大發(fā)展[8]。然而，從植物中分離獲得的花色苷通常為含有多種分子與化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的混合物。此外，通過植物提取時，所得花色苷性質(zhì)不穩(wěn)定，同時也會受到生產(chǎn)力、季節(jié)以及環(huán)境條件變化的影響[9]。然而，微生物具有增長快速和容易培養(yǎng)等生產(chǎn)特性，并且自動化微生物處理技術(shù)使微生物生產(chǎn)天然產(chǎn)物更加便捷、可控和高效，因此，花色苷的微生物生產(chǎn)法越來越受到人們青睞[10-11]。迄今為止，已有多種植物來源的化合物利用原核和真核微生物加以生產(chǎn)，包括萜類、生物堿和類黃酮[12-13]。有研究表明，可通過添加特定的反應(yīng)底物使微生物生產(chǎn)類黃酮化合物[14-15]?；蚪M測序、DNA合成、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、酶學(xué)和代謝網(wǎng)絡(luò)建模等技術(shù)使微生物代謝工程在食品、現(xiàn)代醫(yī)藥、生物能源方面發(fā)揮重要作用[16-17]。

本文主要綜述了轉(zhuǎn)基因微生物生產(chǎn)花色苷的最新研究進(jìn)展，重點(diǎn)在于提高微生物產(chǎn)品產(chǎn)量的代謝工程策略。此外，還總結(jié)了微生物生產(chǎn)花色苷的流程優(yōu)化和影響因素，以全面理解相關(guān)分子工程和生化生產(chǎn)過程，以期為提高微生物生產(chǎn)花色苷產(chǎn)量提供參考。

1 花色苷的應(yīng)用

花色苷具有抗氧化和抗菌作用，在功能性食品[18]、化妝品[19]和制藥[20-21]等方面具有廣泛應(yīng)用?；ㄉ帐撬苄陨?，能使許多水果、蔬菜、花卉和其他植物呈現(xiàn)誘人的橙色、紅色和藍(lán)色等顏色，且具有獨(dú)特的營養(yǎng)特性；因此，也被廣泛用于食品行業(yè)[22]。4 種花色苷基著色劑已免于美國食品藥品監(jiān)督管理局的認(rèn)證[23]。某些類型花色苷存在特定的多酚結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈基團(tuán)，能強(qiáng)烈吸收可見光和紫外線，因此可減輕紫外線對人類皮膚的氧化損傷，這些新的發(fā)現(xiàn)大大提高了花色苷在化妝品中的應(yīng)用價值[24]?；ㄉ胀ㄟ^阻斷白介素-1β、腫瘤壞死因子α和核因子κβ，抑制神經(jīng)發(fā)炎、神經(jīng)退化和腦衰老[25]，并在預(yù)防癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、肥胖癥和糖尿病以及抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用。花色苷還能夠抑制凝血酶受體激活肽誘導(dǎo)的血小板聚集，然而其作用機(jī)制仍不明確[26-27]。此外，花色苷還可作為光敏染料應(yīng)用于太陽能電池中，以取代太陽能轉(zhuǎn)化為電力過程中有毒、復(fù)雜和昂貴的過渡金屬配合物[28-29]。

2 花色苷的生物合成

花色苷是植物中廣泛存在的次生代謝產(chǎn)物，在自然條件下，植物合成的花色苷有助于吸引授粉昆蟲，以及保護(hù)植物免受輻射危害及病原體侵蝕[30]。植物花色苷由莽草酸途徑合成（圖2）：來自于苯丙氨酸的3分子丙二酰輔酶A和來自于酪氨酸的1分子4-香豆酰輔酶A在查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）催化下生成柚皮素查耳酮，進(jìn)一步由查耳酮異構(gòu)酶（chalcone ammonia lyase，CHI）轉(zhuǎn)換為其異構(gòu)體柚皮素；柚皮素通過羥化酶，如類黃酮3’-羥化酶（flavonoid 3’-hydroxylase，F(xiàn)3’H）和類黃酮3’,5’-羥化酶（flavonoid 3’,5’-hydroxylase，F(xiàn)3’,5’H）進(jìn)行羥基化修飾，產(chǎn)生不同的二羥黃酮醇（二羥槲皮素、二氫楊梅素和二羥山柰酚）。這些分子在二氫黃酮醇還原酶（dihydroflavonol reductase，DFR）催化下生成無色花色素，如無色矢車菊素、白天竺葵苷元和無色翠雀花素；花色苷合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）氧化無色花色素生成不穩(wěn)定的陽離子花色苷，該產(chǎn)物在類黃酮葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid glucosyltransferase，F(xiàn)GT）的作用下發(fā)生糖基化反應(yīng)，生成花色苷。

圖2 植物中花色苷的合成代謝途徑Fig. 2 Anabolic pathways of anthocyanins in plants

在植物中，花色苷合成后被轉(zhuǎn)移并儲存在液泡中，不同液泡pH值存在差異，導(dǎo)致花色苷呈現(xiàn)不同顏色[4,27]。花色苷在堿性和中性pH值條件下不穩(wěn)定，但植物可以通過對花色苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，或降低液泡pH值以及共色作用調(diào)節(jié)其在液泡中的穩(wěn)定性[31]。但由于花色苷生物合成的復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，其商業(yè)化生產(chǎn)過程仍是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。

3 微生物代謝工程生產(chǎn)花色苷

微生物工程生產(chǎn)天然化學(xué)物質(zhì)是一種有前途的、滿足工業(yè)需求和可持續(xù)的生產(chǎn)方式。大腸桿菌（Escherichia coli）是代謝工程中最常用的菌株，具有遺傳背景清晰、操作技術(shù)簡便、培養(yǎng)條件簡單和可大規(guī)模發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于天然類黃酮化合物的生物合成中。Jones等[32]通過優(yōu)化共培養(yǎng)過程中菌株、碳源、溫度、誘導(dǎo)點(diǎn)和接種率等條件，顯著提高了E. coli生產(chǎn)類黃酮化合物的產(chǎn)率。Yan Yajun等[33]發(fā)現(xiàn)，重組E.coli細(xì)胞生產(chǎn)2 種花色苷（天竺葵素-3-O-葡萄糖苷和C3G）的產(chǎn)量可達(dá)到毫克級，為花色苷在藥物和營養(yǎng)品中的商業(yè)化應(yīng)用提供可能。近年來，宿主菌株范圍已擴(kuò)大到釀酒酵母和委內(nèi)瑞拉鏈霉菌[33]。最近，德國科學(xué)家將植物來源的O-甲基轉(zhuǎn)移酶、黃烷酮3-羥化酶和黃酮醇合成酶在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行功能性表達(dá)，得到高濃度和高純度的紫檀芪、山柰酚和槲皮素[34]。

作為重要的類黃酮物質(zhì)，花色苷因其巨大的工業(yè)和商業(yè)價值而備受關(guān)注。Yan Yajun等[35]利用重組E. coli進(jìn)行花色苷的生物合成，產(chǎn)物C3G產(chǎn)量高達(dá)110 mg/L。將ANS和類黃酮-3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶（flavonoid-3-O-glycosyltransferase，F(xiàn)3GT）克隆到E.coliBL21中并進(jìn)行表達(dá)[36]，該重組E. coli使用柚皮素和圣草酚為原料時，可分別產(chǎn)生6.0 μg/L C3G和5.6 μg/L氯化天竺葵素3-O-葡萄糖苷；對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用阿福豆素和兒茶酚作為前體物質(zhì)時，這2 種產(chǎn)物的產(chǎn)量可分別提高到113 mg/L和350 mg/L。E. coli生物合成花色苷示意圖見圖3。

圖3 E. coli生物合成花色苷示意圖[23]Fig. 3 Schematic diagram of anthocyanins biosynthesis in Escherichia coli[23]

3.1 微生物生產(chǎn)花色苷時酶的篩選

由于不同植物中同源基因編碼的酶在催化反應(yīng)時表現(xiàn)出不同的動力學(xué)和熱力學(xué)活性，當(dāng)這些酶在外源微生物中表達(dá)時，會產(chǎn)生不同的代謝行為且目標(biāo)化合物生產(chǎn)水平不同。因此，從不同物種中篩選合適的酶是提高花青素等黃酮化合物和花色苷等類黃酮化合物產(chǎn)量的關(guān)鍵[37]。Yan Yajun等[33]對來自非洲菊、矮牽牛、金魚草和蘋果的異源ANS活性進(jìn)行體外測試，并比較其體內(nèi)催化效率，發(fā)現(xiàn)使用矮牽牛ANS在E. coli中制備花色苷時產(chǎn)量最高。同樣，在E. coli中生產(chǎn)柚皮素時，通過對不同同源物上游酶組合可以提高E. coli中柚皮素的產(chǎn)量，如將不同來源的4-香豆酰輔酶A上游酶4-香豆酸輔酶A連接酶、柚皮苷查耳酮上游酶CHS以及柚皮素上游酶CHI進(jìn)行組合，柚皮素產(chǎn)量發(fā)生顯著變化[32]。采用該方法利用E. coli生產(chǎn)白藜蘆醇時，白藜蘆醇產(chǎn)量提高了2 300 mg/L[38]。

即使最適酶系統(tǒng)中酶的來源和組合均為最佳，但在微生物生產(chǎn)花色苷時并不一定能夠提高產(chǎn)量，這是因?yàn)檫@些植物來源的酶在原核細(xì)胞中屬于異源表達(dá)。通常，這些酶的編碼基因在表達(dá)之前需要經(jīng)過一定的修飾（圖3）。例如，P450還原酶的原核表達(dá)可在其C端融合來自長春花的F3’,5’H片段，通過刪除其N端膜錨定位點(diǎn)處的4 個密碼子，修改起始密碼子后第5～6個堿基，使其由亮氨酸變?yōu)楸彼?，從而?gòu)造一個適合細(xì)菌的表達(dá)結(jié)構(gòu)，形成C端融合了長春花來源的F3’,5’H-P450嵌合羥化酶，該酶能更好地催化槲皮素的形成[39]。

除對個別代謝途徑中的酶進(jìn)行修改外，將多種酶融合表達(dá)也是一種有效提高微生物生產(chǎn)花色苷產(chǎn)量的方法。研究表明，將擬南芥F3GT與牽?；ˋNS的N端通過五肽連接進(jìn)行融合，與單獨(dú)的ANS或F3GT相比，2 種酶融合后可極大提高C3G的產(chǎn)量。與獨(dú)立的酶相比，這種復(fù)合酶能夠更有效地進(jìn)行連續(xù)生化反應(yīng)，催化產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物，并迅速糖基化，從而減少了降解的可能，極大提高了花色苷的合成效率[33]。

3.2 輔因子和輔底物對微生物生產(chǎn)花色苷產(chǎn)量的影響

充足的輔因子和輔底物對花色苷生物合成中的電子轉(zhuǎn)移、酶活化以及穩(wěn)定性有重要意義。亞鐵離子、抗壞血酸鈉是ANS的輔因子，2-酮戊二酸是ANS的輔底物，它們可以幫助ANS氧化底物，促進(jìn)花色苷的生成[40-41]。研究表明，抗壞血酸鈉和亞鐵離子的加入顯著提高了兒茶素底物的消耗和C3G的產(chǎn)量[33,39]。但在微生物生產(chǎn)花色苷過程中，輔底物2-酮戊二酸的添加并不是必須的，這可能是由于2-酮戊二酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，因此其供應(yīng)豐富[33]。

尿嘧啶核苷-5’-二磷酸葡萄糖（uridine-5’-diphosphate glucose，UDP-G）是一種重要的葡萄糖供體，能催化C3位糖基化反應(yīng)，使不穩(wěn)定的花色苷變得穩(wěn)定，UDP-G的含量可影響糖基化花色苷的生產(chǎn)。常用的處理方法是提高其生物合成基因的表達(dá)或?qū)ζ浣到馔緩郊右砸种疲缭贓. coli中上調(diào)UDP-G合成代謝途徑關(guān)鍵基因（pyrE、pyrR、cmk、ndk、pgm、galU）的表達(dá)或抑制UDP-G消耗通路，這些改造使C3G產(chǎn)量較對照組提高了20 倍以上（從4 mg/L增加至97 mg/L）[15,33]。另一項(xiàng)研究顯示，pgm、galU、ANS和3GT過表達(dá)可以使C3G產(chǎn)量增加57.8%[33]。

S-腺苷甲硫氨酸也是花色苷生產(chǎn)時必不可少的輔底物，如芍藥素3-O-葡萄糖甲基花色苷的生產(chǎn)。通過CRISPR干擾介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄阻遏物MetJ沉默技術(shù)可提高S-腺苷-L-蛋氨酸的可用性，利用UDP-G和S-腺苷甲硫氨酸的雙重改善技術(shù)可將E. coli中芍藥花色苷產(chǎn)量提高到56 mg/L[42]。

3.3 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對微生物生產(chǎn)花色苷產(chǎn)量的影響

轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常分為3 類：攝取泵、外排泵和調(diào)節(jié)劑[43]。許多工程微生物產(chǎn)生的目標(biāo)產(chǎn)物對宿主菌株有害，從而抑制了目標(biāo)產(chǎn)物的生成。解決該問題的有效方法是利用外排泵將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的目標(biāo)化合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外環(huán)境，使產(chǎn)物維持在適當(dāng)?shù)乃?，從而達(dá)到減毒的作用。例如，為提高E. coli中生物燃料的產(chǎn)量，引入一系列外排泵，負(fù)責(zé)將細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的生物燃料排出細(xì)胞外[44]。這種方法已被廣泛用于多種生物系統(tǒng)中，包括花色苷的生物合成。Lim等[36]選擇4 種外排泵acrAB、tolC、aaeB和yadH，發(fā)現(xiàn)只有yadH過表達(dá)能將細(xì)胞外C3G產(chǎn)量提高15%，說明C3G可能是yadH外排泵的底物；而acrAB和aaeB過表達(dá)，細(xì)胞外兒茶素和花色苷的含量與野生型細(xì)胞相當(dāng)；此外，去除1 種負(fù)責(zé)兒茶素的分泌外排泵可進(jìn)一步提高C3G產(chǎn)量。

除微生物自身運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)外，對植物運(yùn)輸調(diào)節(jié)系統(tǒng)的引進(jìn)也是改善工程微生物中花色苷產(chǎn)生的可能途徑。花色苷在天然植物中合成后，被特定的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)并積聚在液泡中[45]。在玉米中，花色苷的轉(zhuǎn)運(yùn)主要是利用液泡膜中存在的ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體ZmMRP3實(shí)現(xiàn)的[46]，通過Bronze-2編碼的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶實(shí)現(xiàn)花色苷在液泡中的沉積[47]。在其他植物中，花色苷的運(yùn)輸也與H＋梯度有密切聯(lián)系。在擬南芥中，Testa12基因編碼1 種屬于MATE家族的二級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白類蛋白，其可通過H＋梯度逆向轉(zhuǎn)運(yùn)花色苷至液泡中，而缺乏這種基因的突變體會大大降低花色苷在液泡中的積累[48]。但關(guān)于這些植物中的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，目前鮮有在微生物生產(chǎn)花色苷的工程中得以應(yīng)用或嘗試。

3.4 微生物生產(chǎn)花色苷培養(yǎng)條件的優(yōu)化

花色苷的高度不穩(wěn)定性是其微生物生產(chǎn)過程中面臨的一個難題。在植物中，花色苷合成后穩(wěn)定的存儲在液泡中[8,49]，與植物不同的是，細(xì)菌細(xì)胞作為人工生產(chǎn)的宿主缺乏花色苷穩(wěn)定機(jī)制。

圖4 E. coli兩步催化法生物合成花色苷[23]Fig. 4 Two-step catalytic biosynthesis of anthocyanins by E. coli[23]

由于代謝工程細(xì)菌細(xì)胞正常生長的pH值約為7，使得花色苷合成后極不穩(wěn)定。為穩(wěn)定微生物中花色苷的合成，有學(xué)者提出了兩步催化法（圖4）[33]：第1步，在pH 7的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，以維持細(xì)胞正常生長和外源酶表達(dá)；第2步，培養(yǎng)到一定階段后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到pH 5的新鮮培養(yǎng)基中，以減少花色苷降解。此外，也可以添加相應(yīng)保護(hù)劑，如添加谷氨酸可在低pH值條件下維持細(xì)胞生存，該方法可使E. coli的C3G產(chǎn)量提高15 倍左右[33]。

除pH值外，其他因素在花色苷生產(chǎn)中也發(fā)揮重要作用，如誘導(dǎo)時間、補(bǔ)料量、溶解氧和溫度。Lim等[36]發(fā)現(xiàn)定期誘導(dǎo)時工程化E. coli中C3G的產(chǎn)量最高，并且UDP-G和兒茶素與定期誘導(dǎo)結(jié)合后花色苷產(chǎn)量的提高效果更佳。

溶解氧對花青素微生物生產(chǎn)具有雙重效應(yīng)。一方面，氧是ANS發(fā)揮功能的關(guān)鍵因素；另一方面，氧會氧化花青素。因此，最佳溶解氧濃度是微生物生產(chǎn)花色苷的關(guān)鍵。在利用微生物生產(chǎn)圣草酚的研究中發(fā)現(xiàn)，通過增加溶解氧濃度能促進(jìn)兒茶素的合成，這可能與充足的還原型輔酶II供應(yīng)有關(guān)[37]。然而，目前還鮮有關(guān)于氧氣對花色苷產(chǎn)量影響的報(bào)道。

溫度是影響細(xì)胞活性和外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素。溫度的波動會影響蛋白折疊，進(jìn)而影響某些蛋白質(zhì)形成，從而間接影響微生物生產(chǎn)有用化合物。在E. coli中生產(chǎn)阿夫兒茶素時，反應(yīng)溫度為20 ℃時其產(chǎn)量可達(dá)到22.9 mg/L，而溫度為10 ℃時只能達(dá)到6.1 mg/L[32]。微生物生產(chǎn)花色苷的研究進(jìn)展如表2所示。

表2 E. coli生產(chǎn)花色苷的影響因素及優(yōu)化方法Table 2 Optimization of factors influencing the production of anthocyanins by E. coli

4 結(jié) 語

微生物代謝工程在花色苷生產(chǎn)中具有廣闊前景，本文概述了微生物代謝工程在花色苷生產(chǎn)中的研究進(jìn)展，特別側(cè)重于廣泛應(yīng)用的E. coli，同時，對微生物生產(chǎn)花色苷過程中影響因素的優(yōu)化策略進(jìn)行綜述。

目前，重組微生物生產(chǎn)花色苷的成本仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于植物提取的成本，其中最重要的原因是微生物生產(chǎn)花色苷產(chǎn)量較低。因此，要實(shí)現(xiàn)生物合成途徑的潛力最大化而副作用最小化，就必須對微生物合成花色苷的過程進(jìn)行系列調(diào)整與優(yōu)化。充分利用基因組測序、基因擴(kuò)增等技術(shù)發(fā)現(xiàn)新的酶，以及基于目前的研究成果重新設(shè)計(jì)關(guān)鍵酶，構(gòu)建花色苷生物合成的新途徑。同時，進(jìn)一步優(yōu)化微生物生產(chǎn)花色苷中雙磷酸葡萄糖供應(yīng)的調(diào)節(jié)，由于UDP-G可參與海藻糖、糖原、甘油聚合物及其他生物活性化合物的合成，是細(xì)胞新陳代謝、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和防御體系至關(guān)重要的參與者，因此如何滿足UDP-G供應(yīng)問題也將成為一個巨大的挑戰(zhàn)。Cas9依賴的工具酶已發(fā)展到可同時調(diào)控E. coli多個基因的表達(dá)[50-51]，可以利用此方法對多種酶的表達(dá)水平、與花色苷生產(chǎn)直接或間接相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和輔助因子、限速因素和潛在調(diào)節(jié)劑進(jìn)行微調(diào)。

代謝平衡作為另一個重要因素，也應(yīng)被納入花色苷生產(chǎn)的過程優(yōu)化中。代謝平衡可減少對宿主菌株的代謝負(fù)擔(dān)，即使在花色苷生產(chǎn)過剩情況下也能最大程度地維持細(xì)胞的正常生長和代謝。目前許多技術(shù)和方法都已在平衡代謝途徑中得以應(yīng)用，如ePathBrick載體、ePathOptimize計(jì)劃、組合啟動子工程、合成RNA開關(guān)和動態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝物等[52-58]。

除途徑相關(guān)因子外，運(yùn)輸效率低下和缺乏儲存器也能導(dǎo)致微生物生產(chǎn)過程中花色苷被破壞。與植物相比，微生物缺乏花色苷運(yùn)輸和穩(wěn)定的內(nèi)在機(jī)制[59]。目前，對花色苷在微生物細(xì)胞內(nèi)部和跨細(xì)胞膜移動的路徑知之甚少，對花色苷和微生物結(jié)構(gòu)之間的相互作用研究也較少。這些機(jī)制的闡明以及特異運(yùn)輸?shù)鞍椎囊M(jìn)，將對花色苷的微生物生產(chǎn)提供支持。此外，類黃酮化合物前體物質(zhì)價格昂貴，也增加了花色苷生產(chǎn)的總成本。利用這一技術(shù)以葡萄糖為起始生產(chǎn)C3G，將極大降低微生物培養(yǎng)成本，使該生產(chǎn)過程商業(yè)化變得可行[60]。

微生物生產(chǎn)花色苷的優(yōu)化是一個復(fù)雜和耗時的過程。目前，研究者已鑒別出對花色苷生物轉(zhuǎn)化有顯著影響的多種因素，包括菌株和基質(zhì)的選擇、酶的表達(dá)、生長和誘導(dǎo)條件等。然而，仍存在很多亟待解決問題。例如，不同酶動力學(xué)對目標(biāo)產(chǎn)品生產(chǎn)的影響；正常細(xì)胞代謝對酶活性的作用；以及花色苷生產(chǎn)過剩對宿主表觀遺傳學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)的影響等。對這些信息加以了解，有助于調(diào)整與優(yōu)化控制微生物生產(chǎn)花色苷過程，因此，利用多學(xué)科技術(shù)相結(jié)合的方法同時對多方面因素進(jìn)行評價，將成為微生物花色苷合成關(guān)鍵路徑控制和優(yōu)化的關(guān)鍵。