姜長嶺，代金霞，劉 新，魯成銀，陳紅平,*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100081；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估實驗室，浙江 杭州 310008）

赤霉素（gibberellins，GAs）是一種植物生長激素，能夠刺激細胞伸長并影響各種發(fā)育過程，如刺激莖伸長、種子萌發(fā)、休眠、開花、性別表達、酶誘導(dǎo)以及葉和果實衰老等。1926年，Kurosawa[1]研究一種導(dǎo)致水稻過度生長的常見疾病，發(fā)現(xiàn)患病水稻的過度生長是由感染植物的真菌分泌的化學物質(zhì)所致。Yabuta[2]從培養(yǎng)真菌的濾液中分離出這種化學物質(zhì)，稱其為GAs。GAs是一類四環(huán)二萜酸，它的基本結(jié)構(gòu)是二十碳赤霉烷，根據(jù)赤霉烷上雙鍵和羥基的數(shù)目、位置不同，以及內(nèi)酯環(huán)的有無，形成了不同的GAs。根據(jù)分子中碳原子數(shù)目的不同，GAs可分為兩種類型：C-19 GA和C-20 GA，其對應(yīng)結(jié)構(gòu)如圖1[3]所示。C-19 GA是由C-20 GA轉(zhuǎn)變而來，但是包含的種類多于C-20 GA。雖然在植物中發(fā)現(xiàn)了許多種GAs，但只有很少一部分GAs具有激素的生理活性。通常，C-19 GA是具有生物活性的GAs，其中最常見的具有生理活性的GAs有GA1、GA3、GA4和GA7[4]。GAs按照其發(fā)現(xiàn)的順序依次從GA1到GAn進行命名，GA3是第一個在結(jié)構(gòu)上確認的GAs。截止到目前，在植物、真菌及細菌中已經(jīng)確認有136 種GAs[5]。

圖1 C-19 GA（A）和C-20 GA（B）的結(jié)構(gòu)[3]Fig. 1 Structures of C-19 (A) and C-20 (B) gibberellins[3]

GAs是一種廣譜性的植物生長調(diào)節(jié)劑，被廣泛應(yīng)用于植物生長和發(fā)育的各個階段。同時，GAs也屬于低毒農(nóng)藥，但若短期大量攝入或長期在體內(nèi)蓄積，會對機體各系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重的損傷，例如許春爽等[6]研究發(fā)現(xiàn)GAs會對精子造成損傷。Erin等[7]研究發(fā)現(xiàn)，GAs與腫瘤形成也有一定關(guān)系。因此，植物源性食品中GAs的有效檢測、鑒定與監(jiān)測對于食品安全以及風險評估具有重要的意義。

GAs痕量分析一直是GAs合成途徑、生理活性和代謝調(diào)控研究的難點，隨著分析儀器和分析手段的不斷完善，分析方法靈敏度與精密度不斷提升。GAs分析包括樣品前處理與儀器分析兩個重要環(huán)節(jié)。樣品前處理是整個分析周期中的關(guān)鍵過程，可以分離甚至富集分析物，實現(xiàn)超痕量分析，消除基質(zhì)干擾的影響。因此，選擇一種快速、簡單和自動化的樣品前處理方法，可以幫助節(jié)省時間和精力，降低偶然誤差和系統(tǒng)誤差，減少溶劑用量。GAs檢測的前處理技術(shù)經(jīng)歷了傳統(tǒng)的液液萃?。╨iquid liquid extraction，LLE）向固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）、液相微萃?。╨iquid phase microextraction，LPME）以及一些新興的樣品前處理技術(shù)的發(fā)展過程[8]。此外，在過去20 年中已經(jīng)開發(fā)出固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）和LPME樣品制備的小型化裝置，這種裝置具有進一步減少溶劑消耗的優(yōu)點，特別適用于痕量分析和原位分析。這些創(chuàng)新性的樣品制備方法是GAs分析的有力工具，有希望用于植物內(nèi)源性GAs追蹤和調(diào)節(jié)機制的研究。

近年來，隨著儀器分析技術(shù)的高速發(fā)展，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜、高分辨質(zhì)譜（high resolution mass spectrometry，HRMS）分析儀器在提高靈敏度、精密度以及分辨率方面取得突飛猛進的進步，使得GAs分析技術(shù)邁上一個新平臺，實現(xiàn)了快速、高通量、高靈敏的精準定量分析，解決了植物激素含量低、結(jié)構(gòu)相近以及復(fù)雜基質(zhì)干擾等導(dǎo)致的傳統(tǒng)色譜法無法精準定量的缺陷，同時實現(xiàn)了植物組織微量樣品分析，以及微區(qū)域GAs分布特征分析等。

本文查閱了近10 年來關(guān)于GAs檢測分析的報道，從樣品前處理與儀器分析兩個方面分別介紹各種技術(shù)方法以及應(yīng)用的具體實例。此外，作為可行性更高且可以提高檢測靈敏度的補充方法，還將突出總結(jié)富集效果更好的改良SPE技術(shù)與化學標記法這兩類前處理方法，以及基于液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS）、新型納升電噴霧離子源（nano-electron spray ionization，Nano-ESI）技術(shù)與HRMS的應(yīng)用。

1 GAs前處理方法研究進展

在最近10 年里，GAs檢測的樣品前處理技術(shù)已經(jīng)有了廣泛且深入的研究。對Web of Science數(shù)據(jù)庫中的文獻進行檢索，總結(jié)了2012—2018年以來關(guān)于GAs檢測方法的文章，結(jié)果如圖2所示。平均每年發(fā)表10 篇關(guān)于GAs檢測方法的文章；前處理過程主要采用SPE與LLE，部分文獻開發(fā)了新型的前處理技術(shù)，或是在SPE與LLE的基礎(chǔ)上進一步優(yōu)化，對于一些新型復(fù)雜的標記技術(shù)以及一些快速檢測的傳感器技術(shù)都歸于其他方法中；在分析手段方面，LC法依舊是近年來針對GAs檢測的主流方法，按照LC所連接檢測器的不同，其分為LC-紫外光譜法、LC-熒光檢測法等，其中LC-MS是目前最常用的GAs分析方法。

圖2 基于Web of Science數(shù)據(jù)庫檢索的2012—2018年發(fā)表的關(guān)于GAs檢測的論文Fig. 2 Summary of published papers on gibberellin determination from 2012 to 2018 retrieved from the Web of Science database

1.1 固相萃取法

SPE是運用最為廣泛的樣品純化除雜方法，它主要通過在SPE柱中填充吸附劑從而達到對目標化合物的凈化效果。根據(jù)弱酸類植物激素的極性進行純化，常用的SPE柱按照其填充的吸附劑的不同有如下幾類：十八烷基硅烷鍵合硅膠反相吸附劑（如C18柱）、親水親脂復(fù)合物兩性吸附劑（如HLB柱）、混合模式陰離子交換吸附劑（如MAX柱）、混合模式陽離子交換吸附劑（如MCX柱）。SPE技術(shù)因萃取柱以及提取試劑的不同，其萃取效果有顯著差異。如C18柱可以除去大量非極性的葉綠素基質(zhì)，同時也可以通過調(diào)節(jié)淋洗液和洗脫液來除去一些極性很強的基質(zhì)。但C18除雜能力有限，當植物中含有大量非極性基質(zhì)時常常會產(chǎn)生很大的基質(zhì)干擾峰。所以單純采用C18柱僅適用于一些基質(zhì)不太復(fù)雜的樣品。

Cui Kuanyan等[9]利用LC-ESI-MS/MS檢測油菜中GA1、GA3、GA43 種GAs的回收率，比較MCX、MAX、C18與HLB這4 種SPE柱的凈化效果，結(jié)果顯示單獨使用情況下，MCX柱相對優(yōu)于MAX柱、C18柱與HLB柱（GA3除外，在使用MCX柱時其對應(yīng)回收率低至19.5%），而其他SPE柱對3 種GAs的回收率均小于50%。所以一般來講，單純采用SPE柱的凈化方法難以處理復(fù)雜的植物組織提取液，因此串聯(lián)SPE柱應(yīng)用更為廣泛。

Urbanová等[10]以擬南芥為材料，前處理過程以80%（體積分數(shù)，下同）乙腈＋4%甲酸作為提取液，運用兩次SPE步驟（MCX柱串聯(lián)HLB柱和單一MAX柱）對GAs進行凈化處理，隨后進行超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）-ESI-MS/MS測定，得到一種可行性較高的對多種GAs進行同時定量的方法。最終得到20 種GAs的內(nèi)標平均回收率為72%，檢出限（limit of detection，LODs）小于0.1 pmol/mg。Liu Shichang等[11]也是采用類似的兩次SPE步驟（MCX柱和MAX柱），結(jié)合HPLC-ESI-MSn檢測，成功地對10 種GAs進行定量分析。最終得到10 種GAs的LODs都小于400 fmol/mL（其中8 種GAs小于100 fmol/mL）。

圖3 串聯(lián)SPE結(jié)合LLE的前處理流程[12]Fig. 3 Scheme of sample preparation by tandem solid phase extraction followed by liquid liquid extraction[12]

除了單獨運用SPE技術(shù)，SPE結(jié)合其他技術(shù)原理（如LLE）也常用于GAs檢測。Chen Mingluan等[12]利用SPE結(jié)合LLE對小麥葉中酸性植物激素進行富集，結(jié)合納升LC-電噴霧離子源-飛行時間質(zhì)譜（nano-LC-ESI-quadrupole-time of flight-MS，Nano-LC-ESI-Q-TOF-MS）檢測，得到一種能夠有效檢測10 種GAs的前處理方法。其前處理過程如圖3所示，小麥提取液經(jīng)C18柱與SAX柱凈化后，再經(jīng)LLE萃取，最后通過衍生化試劑3-溴乙?；谆寤@（3-bromoactonyltrimethylammonium bromide，BTA）進行柱前衍生化反應(yīng)，最終得到10 種GAs的LODs均小于60 pg/mL，回收率在85%～105%之間。Cui Kuanyan等[9]用同樣的前處理方式，以SPE與LLE相結(jié)合的前處理方式，LC-EI-MS檢測，成功建立了一種同時測定GA1、GA3、GA43 種GAs的方法，方法回收率為80%～115%，LOD分別為0.012、0.004 2、0.016 ng/mL。

雖然單獨使用SPE柱對GAs的凈化效果并不理想，但是基于SPE的原理，進行不同SPE柱組合或者SPE結(jié)合LLE卻能夠起到很好的凈化效果。這種改良SPE雖然增加了前處理過程復(fù)雜性，但卻有很好富集效果，可行性高，結(jié)合LC-MS可以對多種GAs進行同時檢測，得到極低的檢出限。該方法是目前針對多種GAs痕量分析最穩(wěn)定、最可靠的方法之一。

1.2 基質(zhì)固相分散萃取法

近年來發(fā)展起來的MSPD是一種用于固體和黏稠液體樣品的前處理技術(shù)，它實際上是使SPE過程和浸提過程同步進行，同時破碎樣品和提取目標化合物，使得提取和凈化步驟合二為一[13]。MSPD首先利用機械混合研磨使樣品完全破裂，加快目標化合物溶出、提取，再利用樣品基質(zhì)與化學固定相選擇性相互作用進行初步分離。其操作步驟簡單來講就是將樣品基質(zhì)與固定相材料混合研磨，并填裝到SPE柱中，再用溶劑將分析物洗脫。

王璐[14]利用MSPD技術(shù)開發(fā)了一種同時檢測3 種GAs（GA1、GA3、GA4）的方法，該方法以擬南芥為材料，將樣品與C18填料混合研磨，80%冷甲醇-水溶液作為提取液，最終得到的3 種GAs回收率在69.2%～87.0%之間，GA1、GA3、GA4檢出限分別為4.1、1.1、1.5 ng/g。Deng Ting等[15]利用微尺度基質(zhì)固相分散萃取結(jié)合柱前衍生化技術(shù)建立了同時檢測8 種GAs前處理方法，如圖4所示，在極低取樣量下通過在單一試管里進行提取以及凈化過程，該方法成功地用于極低濃度下檢測單個葉片中GAs的分布規(guī)律，凸顯了高靈敏度（8 種GAs的LODs均小于1.4 pg/mL）與低樣品消耗量的特點，而且該前處理方法始終在一個試管中進行，有效地避免了樣品的損失，整體回收率在80%～105%。

由于MSPD操作簡單、前處理時間短，尤其適用于穩(wěn)定性較差的化合物，因此MSPD已經(jīng)得到越來越多的關(guān)注。且MSPD與其他前處理技術(shù)具有很強的兼容性，MSPD與離心、超聲波、微波和磁力等工藝結(jié)合，可以提高MSPD的提取效率。它還可以與其他提取技術(shù)相結(jié)合，特別是一些微萃取技術(shù)[16]。目前應(yīng)用MSPD對GAs進行檢測的研究還相對較少，但MSPD對于GAs的痕量檢測卻是具有很大的應(yīng)用前景。

1.3 QuEChERS法

2003年Anastassiades等[17]提出了一種農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)殘檢測中快速簡便的QuEChERS前處理方法，該方法采用乙腈萃取/分配結(jié)合“分散SPE”。該方法巧妙地將提取與純化的步驟結(jié)合在一起，溶劑、鹽與吸附劑的獨特組合使得提取效率得到很大提升。直到目前，QuEChERS法仍是水果蔬菜中農(nóng)殘檢測最為常用的前處理方式。由于該方法具有“綠色化學”特征，因此被迅速應(yīng)用到環(huán)境、農(nóng)業(yè)和生物分析等領(lǐng)域[18]。該方法因其極大的靈活性可以形成很多不同版本的QuEChERS技術(shù)，這些改良QuEChERS技術(shù)，結(jié)合高靈敏、高選擇性的色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)，使得農(nóng)殘檢測前處理技術(shù)邁上一個新臺階。

Chen Yaling等[19]采用改良QuEChERS方法建立了5 種水果中GA3的檢測方法，該技術(shù)采用含4%鹽酸的乙腈為提取溶劑結(jié)合適量的N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化炭黑（graphitized carbon black，GCB）吸附劑，最終得到GA3的LOD為5.68 μg/kg，回收率在78.5%～106%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）小于15%。Liu Shaoying等[20]以含有1%醋酸的乙腈為提取溶劑結(jié)合C18吸附劑的QuEChERS技術(shù)，建立4 種水果中14 種植物生長調(diào)節(jié)劑或殺菌劑的檢測方法，其中GA3的LOD為0.6 μg/kg，回收率在70%～85%之間，RSD小于12%。

QuEChERS是目前使用非常普遍的前處理方法，正如其名稱所含的特點，相對于其他前處理方式，它的靈活性更好。不同的吸附劑組合配合不同的提取溶劑，可以開發(fā)出適合于不同樣品材料的改良QuEChERS技術(shù)。盡管如此，QuEChERS技術(shù)存在一些缺陷，如凈化效果不佳、方法靈敏度不足（通常是稀釋樣液）等導(dǎo)致QuEChERS技術(shù)難以適用于復(fù)雜基質(zhì)中多種GAs的痕量分析，尤其是微量樣品中GAs痕量分析。

圖4 微尺度下樣品制備方案[15]Fig. 4 Schematic illustration of the microscale sample preparation method[15]

1.4 液液萃取法

LLE的原理是基于目標分析物在兩種液相之間的溶解度差異，該技術(shù)基于相似相溶解的原理，具有高極性的溶劑可以更好地溶解和提取植物基質(zhì)中植物激素分子。最經(jīng)典的LLE是在分液漏斗中將目標分析物從含水樣品溶液中提取到非極性或極性較小的有機溶劑中。樣品可單獨進行LLE作為前處理過程，也可反復(fù)LLE后再進行檢測，更多的是LLE與SPE聯(lián)用來提高純化效果。

Wang Qing等[21]通過一種反復(fù)LLE的方式，利用HPLC-MS/MS成功建立了蜂蜜中49 種植物激素的定量方法，其中包括利用乙腈和水相進行LLE建立起的對19 種GAs同時定量的方法。19 種GAs的檢出限為2.1～628.2 pg/mL，回收率在84%～124%之間，日內(nèi)及日間RSD都小于15%。該方法利用LLE的原理，成功對19 種GAs同時進行了檢測。

傳統(tǒng)的LLE顯然不符合對GAs進行痕量分析的要求，除了可以反復(fù)利用LLE步驟之外，LLE與SPE結(jié)合或許更具優(yōu)勢，而且反復(fù)的LLE步驟是一個費時費力且容易產(chǎn)生誤差的過程。所以LLE與其他凈化方式結(jié)合起來或許更適合用于GAs的檢測。

1.5 液液微萃取法

LLME是一項新型樣品前處理技術(shù)，克服了傳統(tǒng)LLE消耗大量溶劑以及SPME萃取頭較昂貴、壽命短、多次使用存在交叉污染等缺點。該技術(shù)操作簡單、無需特殊裝置，具有成本低、富集倍數(shù)高、有機溶劑用量少等特點，是一種環(huán)境友好的樣品前處理技術(shù)，因適應(yīng)了當前綠色化學發(fā)展的需要而受到分析人員的廣泛關(guān)注[22]。LLME主要有3 種操作模式：單液滴微萃取、中空纖維膜LPME和分散液液微萃取等形式。

近年來中空纖維膜的引入使得LLME穩(wěn)定性得到很大提升，應(yīng)用更為簡便。Wu Qian等[23]引入中空纖維膜液-液-液微萃取（hollow fiber-based liquid-liquid-liquid micro-extraction，HF-LLLME）結(jié)合滲透法對水稻中的8 種GAs進行富集，再用HPLC-MS/MS檢測，提高了萃取方法對GAs的選擇性，成功建立了8 種GAs的定量方法，檢出限（0.001 6～0.061 ng/mL）極低，回收率在62%～166%之間。

LLME技術(shù)由于其綠色化學的優(yōu)點具有很大的發(fā)展前景。但是由于微萃取所用的材料量很少，所以造成的誤差較大，穩(wěn)定性較差，且其對前處理過程的精確度要求較高。LLME目前通常結(jié)合其他技術(shù)來提高準確度，對GAs檢測更多的是采用LLME結(jié)合其他處理方式[23-24]。這種與其他技術(shù)結(jié)合的方式將來可能會成為GAs檢測的主流前處理方法。

1.6 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)（molecular imprinting technique，MIT）是源于20世紀中期的一種新方法。由于其具有結(jié)構(gòu)可預(yù)測性、廣泛適用性、特異識別性三大特點，發(fā)展極為迅速。近年來MIT由于其高選擇性、簡便快速性、高穩(wěn)定性以及低成本和環(huán)保等顯著優(yōu)勢，大量地應(yīng)用到了食品中化學污染物的檢測中。MIT是制備具有某種空間結(jié)構(gòu)的分子印跡聚合物（molecularly imprinted ploymers，MIPs）的技術(shù)，該聚合物可特異性地結(jié)合模板分子。制備出的MIPs對模板分子的親和性和選擇性高，對惡劣環(huán)境具有較強的抵抗能力，穩(wěn)定性強、使用壽命長，已被廣泛的應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、材料、食品等多個領(lǐng)域[25]。而MIPs作為SPE吸附劑可以特異性的吸附目標產(chǎn)物，在食品分析中得到了較為廣泛的應(yīng)用。

Zhang Zhuomin等[26]采用快速簡便的微波輻射方法，在最佳制備條件下合成了新型GA3磁性MIP，聚合過程見圖5。該方法用含有丁基化羥基甲苯的80%（體積分數(shù)）甲醇溶液作為提取溶劑，以GA3磁性MIP對目標物進行富集，利用HPLC-MS分析，建立了4 種GAs的定量方法。最終得到4 種GAs的LODs均小于5 μg/L，對小麥和黃瓜檢測回收率分別為76.0%～109.1%與79.9%～93.6%，RSD分別為2.8%～8.8%、3.1%～7.7%。該方法合成的新型GA3磁性MIP有效地對樣品目標物進行了富集，得到了極低的檢出限且有較好的回收率，可以作為MIT應(yīng)用于多種GAs分析的可行性參考。

圖5 GA3磁性MIP珠粒聚合過程的示意圖[26]Fig. 5 Schematic representation of the polymerization process of GA3 mag-molecularly imprinted ploymer beads[26]

MIT是一種新興的應(yīng)用于樣品前處理的技術(shù)，由于其廣泛的應(yīng)用前景得到越來越多的關(guān)注。雖然已有相關(guān)研究將該方法應(yīng)用于對GAs的檢測中，但吸附劑的制備過程太過復(fù)雜，且還沒有制備出成功應(yīng)用于多種GAs痕量分析的MIPs。但該方法高親和性與選擇性十分有利于目標物的富集，因此對于多種GAs的痕量分析還需進一步研制出更為有效的MIPs。

1.7 化學標記

化學標記（包括衍生化、熒光標記和同位素標記）以其高靈敏度成為目前研究前處理技術(shù)的熱門方法。該方法通過一些特殊的試劑對目標物進行標記，這些標記可以顯著降低實際樣品中初級和次級代謝物的干擾，并提高檢測選擇性與靈敏度。目前化學標記的方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物激素的痕量分析方面。

Zhu Guimei等[27]提出了一種基于叔胺標記的毛細管電泳結(jié)合電化學發(fā)光技術(shù)（capillary electrophoresis combined with electrochemical luminescence，CE-ECL）用于檢測GAs的新方法，該方法以2-(2-氨乙基)-1-甲基吡咯烷作為衍生化試劑，樣品經(jīng)LLE與SPE處理后，采用CE-ECL檢測。對黃豆中GA3的檢出限為8×10-8mol/L，回收率在89.6%～99.3%之間。Li Guoliang等[24]提出了一種采用2-(11H-苯[a]咔唑)乙基對甲苯磺酸酯作為標記試劑的新型柱前熒光標記方法，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）結(jié)合熒光檢測器對7 種植物生長調(diào)節(jié)劑進行定量分析。最終得到5 種水果GA3的回收率為90%～105%，檢出限為2.1 nmol/L。

Cai Wenjing等[28]建立了一步式多功能衍生化的方法，對31 種植物激素進行同時檢測，其中包括14 種GAs，該方法采用乙腈進行提取，以N,N-二乙基乙二胺（N,N-diethyl ethylenediamine，DEED）作為GAs的衍生化試劑，衍生化條件在40 ℃持續(xù)10 min，最后由UPLC-MS/MS檢測。最終得到14 種GAs的檢出限為1.8～20.0 fg/mL，回收率為80.7%～120.4%，日內(nèi)以及日間RSD都小于11.8%。該方法充分利用衍生化過程來對多種GAs進行痕量分析，結(jié)果顯示該方法可行、簡便且具有高靈敏度。

Hao Yanhong等[29]提出了一種穩(wěn)定同位素標記的方法，成功對水稻中的11 種GAs進行定量分析。該方法以N,N-二甲基乙二胺（N,N-dimethyl ethylenediamine，DMED）及其氘代對應(yīng)物d4-DMED為衍生化試劑標記GAs，經(jīng)SPE結(jié)合LLE的前處理富集、凈化后，再由HPLC-ESI-MS/MS檢測。其前處理過程及同位素標記衍生化過程如圖6所示。該方法最終得到水稻中11 種GAs的LODs為0.02～0.74 pg/mL，回收率為72%～128%，RSD為1.0%～13.9%。

圖6 樣品前處理和穩(wěn)定同位素標記衍生化的程序[29]Fig. 6 Procedure for sample pretreatment and stable isotope labeled derivatization[29]

Sun Xiaohong等[30]提出了一種穩(wěn)定同位素標記的方法用于8 種酸性植物激素的定量分析。該方法以溴化溴代膽酰（bromocholine bromide，BETA）對經(jīng)過SPE與LLE之后的樣品提取液進行衍生化標記，以其氘代對應(yīng)物d9-BETA對標樣進行衍生化標記，然后將兩組已經(jīng)衍生化的提取液（一個輕標記、一個重標記）合并，進行UPLC-MS/MS分析。最終得到GA4的檢出限為0.754 pg/mL，回收率為79%～92%。該方法實現(xiàn)了基于內(nèi)標的多種植物激素的相對定量，與每種分析物的內(nèi)標可用性無關(guān)，靈敏度提高了1～3 個數(shù)量級。

化學標記方法已經(jīng)成功應(yīng)用于GAs的痕量分析中，這些方法都具有很高的靈敏度和極低的檢出限，是目前對于多種GAs痕量分析極為有效的方法?；瘜W標記法關(guān)鍵在于衍生化試劑的選擇，不同的試劑決定了其所能分析目標化合物種類和最終的檢測靈敏度。化學標記法通常需要與其他前處理技術(shù)相結(jié)合，甚至可以將化學標記法看作是其他前處理技術(shù)的一個補充?；瘜W標記法是目前對于植物痕量分析的主流趨勢，更合適的衍生化試劑結(jié)合富集效果更好的提取和凈化過程將會是決定多種GAs痕量分析的關(guān)鍵，也是目前研究的熱點。

2 GAs分析方法研究進展

目前植物激素的檢測方法較多，主要可分為生物鑒定法、免疫分析法和色譜分析法3 類[31]。生物鑒定法是一種非常經(jīng)典的植物激素檢測分析法。例如油菜素內(nèi)酯的水稻葉彎曲測試法可達到0.05 ng/mL的檢測限[32]。但它只是一種半定量方法，而且其耗時長、對檢測條件要求嚴苛，一般的化學分析實驗室難以實現(xiàn)。而免疫分析法近年來顯示出較低的檢測限，但是其仍需解決制備的抗體的交叉反應(yīng)問題。目前，色譜法應(yīng)用最廣，可同時檢測多種植物激素，且定量準確。近年來，色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速發(fā)展極大提高了對植物激素的選擇性檢測能力，能夠?qū)崿F(xiàn)準確的定性與定量分析[33]。

基于色譜法針對多種GAs痕量分析方法的研究，主要是對GAs定性問題以及檢出限問題研究。由于樣品基質(zhì)種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜，在色譜圖上往往會出現(xiàn)干擾峰，影響樣品的定性定量分析。同時，由于GAs在植物體內(nèi)含量極低，因此對GAs分析方法的精密度、準確度和靈敏度提出了非常高的要求。以下將從GC和GC-MS、LC和LC-MS兩方面綜述近年來GAs痕量分析手段的優(yōu)缺點。

2.1 氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜法

GC是利用氣體作流動相的色譜分離方法。汽化的樣品被載氣帶入色譜柱中，柱中的固定相與試樣中各組分分子作用力不同，各組分從色譜柱中流出時間不同，組分彼此分離。GC與火焰離子化檢測儀（flame ionization detector，F(xiàn)ID）或MS等檢測器相結(jié)合已被廣泛用于分析植物激素及其相關(guān)代謝物。其中，MS由于其較高的靈敏度和選擇性已經(jīng)成為最常用的一種檢測工具。GAs是一類具有高沸點的極性化合物，難以被汽化，所以不能直接采用GC-MS分析。對于非揮發(fā)性化合物而言，在GC-MS之前通常需要衍生化步驟以產(chǎn)生揮發(fā)性產(chǎn)物并改善色譜信號[34]。因此，合適且穩(wěn)定的衍生化過程對于GC-MS成功分析GAs至關(guān)重要。衍生化過程可以被認為是一種特殊類型的微尺度化學合成過程，其可能需要在極端溫度和壓力條件下持續(xù)長時間的反應(yīng)[35]?，F(xiàn)有的GAs衍生化反應(yīng)原理通常是利用GAs都含有羧酸基團的化學特征，利用衍生化的過程對GAs的羧基進行反應(yīng)[24,27-28,30]，進而得到相應(yīng)的衍生化產(chǎn)物。

Nehela等[36]利用GC-MS建立一種對甜橙（Citrus sinensis (L.) Osbeck）葉和根進行植物激素分析的方法，該方法采用混合溶劑（V（甲醇）∶V（水）∶V（鹽酸）＝80∶19.9∶0.1）作為提取液，以N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺（N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide，MSTFA）作為衍生化試劑對GAs進行衍生化反應(yīng)，反應(yīng)過程在加熱至85 ℃的條件下持續(xù)45 min，再通過GC-MS以選擇性離子檢測模式分析。最終得到3 種GAs的LODs為0.02～0.07 ng/g，回收率也穩(wěn)定在110%左右。該方法有效地利用GC-MS結(jié)合衍生化過程對3 種GAs進行分析，檢出限極低，為GC-MS對多種GAs痕量分析提供了非常重要的參考。GC-MS是用于分析GAs的標準方法。到目前為止，有超過100 個GAs的標準MS譜圖，它們構(gòu)成了GAs鑒定的堅實基礎(chǔ)。但是，GAs是具有高沸點的非揮發(fā)性化合物，因此通常需要耗時且復(fù)雜的衍生程序，以便GC-MS檢測。利用GC-MS對多種GAs的痕量分析，關(guān)鍵在于衍生化過程，而目前用于GC-MS分析的GAs衍生化試劑研究太少，無法滿足對多種GAs痕量分析的要求。但卻存在許多用于提高LC-MS檢測信號的GAs衍生化試劑，這些試劑增強了目標物的信號強度，提高了利用LC-MS檢測的靈敏度。近年來，LC-MS已經(jīng)成為了檢查GAs的主要分析手段之一。

2.2 液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜法

LC由于其高分辨率己成為一個強大的分離工具，從1970年代初以來，已廣泛用于痕量植物激素的分析。傳統(tǒng)的檢測器如紫外、熒光檢測器通常不能提供目標化合物的結(jié)構(gòu)信息，且很難實現(xiàn)多種分析物的同時檢測[37]，LC-MS由于其高靈敏度和選擇性成為目前最常見與最實用的結(jié)合方式。LC-MS結(jié)合了LC有效分離熱不穩(wěn)性及高沸點化合物的分離能力與MS很強的組分鑒定能力，是一種分析復(fù)雜有機混合物的有效手段。LC-MS具有良好的重現(xiàn)性和廣泛的覆蓋率，LC-MS技術(shù)通常不需要衍生化步驟，相比于GC-MS節(jié)省了時間。LC-MS還具有可與不同質(zhì)量分析器配合使用的優(yōu)點，使大分子物質(zhì)（如Nano-ESI源）、極性（ESI源）與非極性（大氣壓化學電離源）物質(zhì)都能夠有效離子化[38]。隨著近年來對LC-MS的需求進一步提升，一些新技術(shù)的引入使得LC-MS得到進一步發(fā)展，如立體選擇性LC-MS[39]對手性農(nóng)殘的分析，以及多維LC[40]對基質(zhì)復(fù)雜的樣品的有效分離。

GAs是一種二萜類酸，屬于中等極性的分子，因而在LC中固定相宜選擇極性較小的鍵合固定相，流動相宜選擇極性較強的溶劑[41]。因此，目前較多采用反相色譜柱C18柱進行分離。流動相一般采用甲醇-水、乙腈-水兩大體系。乙腈洗脫能力強，黏度比甲醇低，系統(tǒng)壓力較低，但價格較高，毒性較強。甲醇的優(yōu)勢體現(xiàn)在經(jīng)濟、低毒等環(huán)保優(yōu)勢上，但系統(tǒng)壓力高，洗脫能力較差。GAs在LC中的流動相通常都含有低濃度的甲酸，有助于酸性目標化合物的分離。

Cao Zhaoyun等[42]利用LC-MS結(jié)合SPE（PAX小柱）的前處理過程有效測定小麥中43 種植物激素（包括10 種GAs）。其中LC采C18色譜柱，流動相包含甲醇和5×10-3mol/L甲酸銨，以梯度洗脫的方式進行目標物分離。該方法檢測10 種GAs的回收率穩(wěn)定在70%～110%之間，LODs為0.19～7.57 fmol/mL，日內(nèi)及日間的RSD都小于15%。

本文總結(jié)了近10 年國內(nèi)部分應(yīng)用LC-MS檢測不同作物中GAs含量的文章（表1），發(fā)現(xiàn)其中前處理絕大部分都是應(yīng)用SPE，色譜的色譜柱基本為C18柱，流動相大多用酸化的甲醇。

表1 LC-MS在檢測GAs中的應(yīng)用Table 1 Applications of liquid chromatography coupled with mass spectrometry in the detection of gibberellins

GAs檢測方法的評價，不僅包括檢出限以及回收率，能檢測的GAs數(shù)量也是一個重要指標。近年來，植物激素檢測方法研究中取得突破性進展，GAs不僅在檢測限（即靈敏度）取得較大突破，同時實現(xiàn)了GAs高通量檢測，表2總結(jié)了近10 年來利用LC檢測多種GAs的部分文獻。

表2所示利用LC檢測GAs的研究中，均同時檢測了3 種以上的GAs，且檢測限都很低，穩(wěn)定性較好。這些文獻中LC的色譜柱大多使用C18柱，流動相以酸化的甲醇使用較多，也有采用乙腈與水作為流動相。上述文獻所用材料以擬南芥與小麥為主，這類材料的基質(zhì)效應(yīng)相對與一些內(nèi)含物質(zhì)豐富的材料（如茶葉）要小很多，因而在針對不同材料的定量分析時，要調(diào)整相對應(yīng)的樣品前處理方式。

在LC-ESI-MS檢測GAs的基礎(chǔ)上，近些年來，一種新型的Nano-ESI結(jié)合MS被應(yīng)用于GAs的痕量分析。Chen Mingluan等[12]采用一種甲基丙烯酸-乙二醇二甲基丙烯酸酯（methacrylic acid-co-ethylene glycol dimethacrylate，MAA-co-EDMA）整體柱代替常規(guī)的C18色譜柱，利用Nano-LC-ESI-Q-TOF-MS檢測（圖7）。該方法首先采用50 nL樣品環(huán)（定量環(huán)），通過直接進樣方式優(yōu)化目標分析物在MAA-co-EDMA整體柱上的分離條件（流動相與洗脫梯度），然后用約85 μL MAA-co-EDMA（長7 cm、內(nèi)徑100 μm、外徑360 μm）捕集柱代替50 nL樣品環(huán)，20 μL樣品液體以10 μL/min流速進樣9 min后，15 種酸性植物激素衍生物通過MAA-co-EDMA整體柱被有效分離與富集（流速為0.6 μL/min），經(jīng)TOF MS檢測，從而提高目標化合物的進樣量，克服樣品液體中大量陽離子對免疫親和色譜柱分離和TOF MS離子化效率的影響。該方法利用Nano-ESI-MS超高靈敏度的檢測，成功對15 種植物激素（包括10 種GAs）進行定量分析。Zhang Zheng等[50]也采用相似的Nano-LC-MS系統(tǒng)，成功建立了對10 種GAs定量分析的方法，10 種GAs的檢出限為0.004～0.032 ng/mL，回收率為80%～105%。該方法采用PT-SPE結(jié)合衍生化過程（衍生化試劑為DEED）的前處理，再結(jié)合基于陽離子交換/反相（cation exchange/reversed-phase，CX/RP）整體毛細管柱的Nano-LC-MS進行檢測。該CX/RP整體柱的制備原理是基于“硫醇-烯”點擊化學和微乳液體系中的溶膠-凝膠方法。但該CX/RP整體柱使用不同于Chen Mingluan等[12]以單一MAA-co-EDMA整體柱在線捕獲后再以另一MAA-co-EDMA整體柱進行分離，而是C18色譜柱在線捕獲目標物后，再采用CX/RP整體柱進行分離。這種基于Nano-ESI的新型分析技術(shù)由于其樣品消耗少與超高靈敏度已經(jīng)得到越來越多的關(guān)注，且已成功應(yīng)用于植物激素的痕量分析。Nano-ESI發(fā)射器具有微尺度孔，可降低分析物消耗，具有很高的離子轉(zhuǎn)移效率，十分有利于對有限可用性分析物的質(zhì)譜分析[51]。針對多種GAs痕量分析，該技術(shù)具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

表2 LC法在檢測多種GAs中的應(yīng)用Table 2 Applications of liquid chromatography in the detection of gibberellins

圖7 Nano-LC-ESI-Q-TOF-MS系統(tǒng)原理圖[12]Fig. 7 Schematic diagram of nano-liquid chromatography-electron spray ionization-Q-quadrupole-time of flight-mass spectrometry system[12]

除了Nano-ESI這種新型技術(shù)應(yīng)用于MS的分析中，近年來，越來越多的HRMS代替了傳統(tǒng)的MS。如磁偏轉(zhuǎn)質(zhì)譜、TOF-MS、靜電場軌道阱質(zhì)譜以及傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜等，這些高分辨質(zhì)譜的分辨率都大于10 000，質(zhì)量精度均小于5×10-6[52]。而在GAs檢測中被常應(yīng)用到的高分辨質(zhì)譜為Q-TOF-MS[12]，Q-TOF-MS是一種強大的工具，通過建立每種化合物的碎裂過程來表征痕量化合物。Zhao Hongzhi等[53]利用ESI-Q-TOF-MS首次建立了植物激素（包括GA3、GA4、GA9）的綜合MS/MS譜庫。謝寒冰等[54]利用HPLC-Q-TOF-MS測定了豆芽中的3 種外源植物激素殘留，該方法采用QuEChERS的前處理技術(shù)，以酸化的乙醇-乙腈溶液提取目標物，經(jīng)硅藻土分散固相凈化。LC以甲醇-水作為流動相梯度洗脫，C18色譜柱分離。MS采用高分辨質(zhì)譜、負離子模式，以精確質(zhì)量數(shù)和二級特征離子定性，以準分子離子峰面積定量。最終檢測大豆芽和綠豆芽兩個品種，得到GA3的回收率為79%～87%，LOD為5.0 μg/kg，3 種加標水平（10、50、100 μg/kg）下RSD小于10%。這種高分辨質(zhì)譜可通過多級掃描結(jié)合譜庫檢索使得目標物的分析更加準確，可以有效區(qū)分混合物，大幅降低了對前處理的要求，相較于傳統(tǒng)的MS/MS，HRMS也降低了對色譜分離的要求，可同時對數(shù)百種化合物進行分析，是對多種GAs痕量分析極為有效的手段。

3 結(jié) 語

GAs檢測技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了從最開始的傳統(tǒng)生物測定法[55]到免疫測定法，又隨著20世紀60年代GC-MS的興起以及GC-MS被普遍應(yīng)用于GAs檢測[56-57]，到現(xiàn)在以LC-MS為主的過程。在LC-MS的基礎(chǔ)上，近年來發(fā)展起來的一種新型Nano-ESI因其低消耗和超高靈敏度在植物激素痕量分析方面得到越來越多的關(guān)注，并且已成功應(yīng)用于多種GAs的痕量分析[12,50]。同時，隨著HRMS的發(fā)展及其對傳統(tǒng)MS/MS的影響，近年來也逐漸被應(yīng)用于GAs的痕量分析[12]。在利用色譜法分析GAs的前提下，GAs檢測的前處理技術(shù)也得到了極大的發(fā)展。創(chuàng)新性的SPE技術(shù)（如高效、高選擇性的新型吸附劑或SPME技術(shù)）以及化學標記法的應(yīng)用，使得目標物的凈化與富集效果得到很大的提升，提高了分析方法的靈敏度。

雖然目前已經(jīng)存在許多檢測GAs的優(yōu)秀方法，尤其是隨著Nano-ESI與HRMS的引入之后，GAs分析方法的靈敏度得到很大提升。但對基質(zhì)復(fù)雜的植物成分進行GAs的痕量、精準及高通量分析仍有缺陷，表現(xiàn)在靈敏度還需要進一步提高，從而實現(xiàn)超低的痕量分析，解決極低樣品取樣量下GAs的痕量分析。同時，由于GAs同系物存在同分異構(gòu)體，因此對GAs光學異構(gòu)體鑒別與定量分析技術(shù)有待于進一步開發(fā)。另外，GAs代謝產(chǎn)物研究極少，主要是由于分析手段不足，代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)解析是今后GAs分析技術(shù)需要克服的難點。

針對上述存在的問題，可以從不同的方向進行解決。在前處理上，高通量、選擇性的材料在GAs分析的應(yīng)用能夠提高GAs的富集能力，從而提高GAs分析的靈敏度。如功能性石墨烯材料在GAs分析的應(yīng)用，一方面提高了SPE與QuEChERS的凈化能力；另一方面也增加了前處理方法的富集系數(shù)，提高了方法靈敏度。在同系物、同分異構(gòu)體分析上，新型色譜柱在GAs的應(yīng)用提高了色譜分離度，高分辨MS或MS/MS的高選擇性有望解決GAs同分異構(gòu)體或光學異構(gòu)體的分析。利用HRMS結(jié)合體外模擬實驗，可以初步推斷GAs降解產(chǎn)物和代謝產(chǎn)物，再將核磁共振以及紅外光譜等技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，是今后研究GAs代謝行為的方向。