肖夢圓，武瑞赟，譚春明，李平蘭*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，精準(zhǔn)營養(yǎng)與食品質(zhì)量重點實驗室，教育部功能乳品重點實驗室，北京 100083）

細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境，通過分泌胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS），使細(xì)菌包裹在分泌物中而形成的大量細(xì)菌聚集膜狀物，是細(xì)菌的一種自我保護(hù)性生長方式[1]。van Leeuwenhoek首先在牙齒表面發(fā)現(xiàn)細(xì)菌形成生物被膜的現(xiàn)象[2]。隨著對生物被膜認(rèn)識的不斷深入，研究發(fā)現(xiàn)，醫(yī)療設(shè)備、工業(yè)或飲水系統(tǒng)管道以及食品等表面均可以形成細(xì)菌生物被膜。同時生物被膜能夠保護(hù)細(xì)菌免受環(huán)境脅迫，且對噬菌體、多種化學(xué)殺菌劑、宿主免疫系統(tǒng)以及抗生素具有抗性或耐藥性[3]，因此容易造成環(huán)境污染以及人類與動物感染等問題。細(xì)菌生物被膜最典型的感染方式是由致病細(xì)菌，如銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和致病性大腸桿菌等侵染引發(fā)的慢性感染，可導(dǎo)致持續(xù)性炎癥和組織損傷[4]。每年約有570萬 人死于致病細(xì)菌引起的人類感染性疾病，其中有65%～80%的感染是由可形成生物被膜的細(xì)菌引起的[5]。如銅綠假單胞菌是引起囊性纖維化患者嚴(yán)重慢性肺部感染的主要病原體，由銅綠假單胞菌生物被膜引起的肺部損傷，通常會導(dǎo)致患有囊性纖維化的兒童死亡[6]。

細(xì)菌能自發(fā)產(chǎn)生和釋放一些與群體密度相關(guān)的信號分子，調(diào)控細(xì)菌的群體行為，這一調(diào)控系統(tǒng)稱為群體感應(yīng)[7]。生物被膜形成是細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)控的一種主要表型。細(xì)菌合成分泌信號分子，并在周圍環(huán)境中積累，隨著細(xì)菌密度的增大，信號分子水平達(dá)到臨界閾值時，信號分子與受體結(jié)合，刺激與生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)菌生物被膜的形成。群體感應(yīng)系統(tǒng)在調(diào)控細(xì)菌生物被膜形成過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用；因此干擾這種調(diào)控作用為控制細(xì)菌生物被膜的危害提供了重要靶標(biāo)[8]。群體感應(yīng)抑制劑是一類通過影響群體感應(yīng)系統(tǒng)來干擾細(xì)菌生物被膜形成和毒力因子合成等行為的物質(zhì)。同時，群體感應(yīng)抑制劑不會對細(xì)菌生長產(chǎn)生脅迫，避免了細(xì)菌抗藥性的產(chǎn)生[9]。對群體感應(yīng)抑制劑的研究為干擾環(huán)境和人類疾病中生物被膜形成的策略提供了重要基礎(chǔ)。

1 群體感應(yīng)對細(xì)菌生物被膜形成的調(diào)控作用

1.1 細(xì)菌生物被膜

細(xì)菌包裹在自身產(chǎn)生的胞外基質(zhì)中，并黏附在惰性或有生命的物體表面，形成生物被膜[10]。對于相同物種的浮游細(xì)胞，生物被膜中的細(xì)菌具有不同的代謝和基因表達(dá)[11-12]。細(xì)菌生物被膜由EPS和細(xì)菌菌體兩部分構(gòu)成。EPS基質(zhì)厚度為0.2～1.0 μm，占生物被膜體積的65%～95%，其組成包括蛋白質(zhì)（＞2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同））、多糖（1%～2%）、DNA（＜1%）、RNA（＜1%）和水（97%）等，且水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)決定了生物被膜中必需營養(yǎng)物質(zhì)的流動[13]。細(xì)菌生物被膜的形成取決于細(xì)菌、附著表面和周圍介質(zhì)三者間的相互作用[14]。

細(xì)菌生物被膜的形成一般分為3 個階段[15]。第1階段，細(xì)菌初始黏附于表面。細(xì)菌通過菌毛和鞭毛等附屬物或范德華力、靜電相互作用等物理作用附著于表面。附著表面的性質(zhì)是影響細(xì)菌附著的重要因素。隨著附著表面疏水性的增強，細(xì)菌與附著表面之間斥力降低，因此，細(xì)菌更容易附著在疏水性和非極性的表面，如聚四氟乙烯和其他塑料等[13]。第2階段，生物被膜的成熟。當(dāng)細(xì)菌附著在生物或非生物表面并穩(wěn)定后，細(xì)菌開始分泌EPS，這是一個不可逆的過程，EPS連續(xù)分泌直到生物被膜完全成熟。完全成熟的生物被膜呈三維塔狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)部由小通道組成，輸送養(yǎng)分、水和廢物[16]。第3階段，生物被膜的分散。這一階段，生物被膜內(nèi)的細(xì)菌群落產(chǎn)生不同的糖化酶，并上調(diào)鞭毛形成相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，幫助細(xì)菌釋放[13]。生物被膜的分散在生物被膜相關(guān)感染中具有重要作用，這是因為細(xì)菌從生物被膜中分離出后，通過血液和其他體液擴散到新的感染部位，再次形成生物被膜引起感染[17]。銅綠假單胞菌生物被膜形成的過程如圖1所示。

圖1 銅綠假單胞菌生物被膜形成過程[18]Fig. 1 Biofilm formation process of Pseudomonas aeruginosa[18]

1.2 細(xì)菌群體感應(yīng)

細(xì)菌在生長過程中，合成并分泌自誘導(dǎo)因子（autoinducer，AI）作為信號分子，AI隨著細(xì)菌密度的增加而在周圍環(huán)境中積累，當(dāng)達(dá)到臨界閾值水平時，AI通過與受體結(jié)合抑制或激活特異性基因的表達(dá)，調(diào)控相關(guān)的生物學(xué)功能，這種現(xiàn)象稱為細(xì)菌的群體感應(yīng)[19]。群體感應(yīng)是細(xì)菌之間用來溝通和協(xié)調(diào)相互行為和功能的過程，調(diào)控多種生理過程，如生物發(fā)光、抗生素的合成、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移、生物被膜形成以及毒力因子的產(chǎn)生等[20]。細(xì)菌的群體感應(yīng)主要存在以AI-1、AI-2、AI-3為信號分子的3 種群體感應(yīng)系統(tǒng)。

1.2.1 以AI-1為信號分子的群體感應(yīng)系統(tǒng)

革蘭氏陽性菌的AI-1為自誘導(dǎo)肽（autoinducing peptides，AIP）。AIP通常是由5～87 個氨基酸組成的線性或環(huán)狀肽，在某種情況下會通過內(nèi)酯和硫代內(nèi)酯鍵環(huán)化起到氨基酸修飾和內(nèi)酯化作用，從而提高AIP在細(xì)胞外環(huán)境中的穩(wěn)定性[21]。AIP在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行翻譯，在跨膜轉(zhuǎn)運前和期間進(jìn)行修飾，經(jīng)ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運蛋白運輸?shù)郊?xì)胞外，當(dāng)細(xì)胞外的AIP積累到閾值水平時，雙組分傳感器激酶檢測到AIP，進(jìn)而引發(fā)一系列磷酸化反應(yīng)，最終導(dǎo)致同源反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白磷酸化，磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合DNA的基因啟動子區(qū)，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[22]。

革蘭氏陰性菌的AI-1為N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl homoserine lactones，AHL）類物質(zhì)。不同細(xì)菌甚至同一細(xì)菌的不同AHL合成系統(tǒng)，其合成的AHL結(jié)構(gòu)不盡相同，?；兼滈L度為4～16個碳原子，通常是以2 個碳原子為基本單元（如C4、C6和C8等）[23]。AHL是由AHL合成酶LuxI家族蛋白以S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）和?；d體蛋白為底物，將與?；d體蛋白結(jié)合的脂肪?；苌镛D(zhuǎn)移到SAM的氨基上進(jìn)行合成[15]。當(dāng)AHL濃度達(dá)到臨界閾值時，AHL與LuxR家族的DNA結(jié)合受體蛋白相互作用形成AHL-LuxR復(fù)合體，AHL-LuxR復(fù)合體再與DNA的基因啟動子區(qū)結(jié)合，啟動下游基因的表達(dá)。早期研究發(fā)現(xiàn)，來自海洋的費氏弧菌中含有發(fā)光基因lux，其群體感應(yīng)信號分子為N-3-氧代己?；?1-高絲氨酸內(nèi)酯（N-3-oxohexanoyl-1-homoserine lactone，3OC6-HSL），luxI基因編碼3OC6-HSL合成所需的自誘導(dǎo)合成酶LuxI，luxR基因編碼3OC6-HSL的反應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活因子LuxR[24]。

1.2.2 以AI-2為信號分子的群體感應(yīng)系統(tǒng)

AI-2群體感應(yīng)系統(tǒng)最早在哈維弧菌中被發(fā)現(xiàn)，是一些革蘭氏陽性菌和陰性菌產(chǎn)生的群體感應(yīng)信號，涉及種間交流，AI-2為呋喃酰硼酸二酯，由luxS基因合成，luxS基因存在于大量細(xì)菌中[25]。AI-2合成涉及2 個主要的酶促步驟。首先，由pfs基因編碼的甲硫腺苷核苷酶去除S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosyl-homocysteine，SAH）的腺嘌呤，生成S-核糖同型半胱氨酸（S-ribosyl homocysteine，SRH）；然后，由luxS基因編碼的SRH酶將SRH轉(zhuǎn)化為同型半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD）；最后，DPD自發(fā)重新排列形成AI-2[26]。

1.2.3 以AI-3為信號分子的群體感應(yīng)系統(tǒng)

AI-3是一種芳香化合物，其結(jié)構(gòu)未被準(zhǔn)確描述，與腎上腺素/去甲腎上腺素具有交叉作用，構(gòu)成AI-3/腎上腺素/去甲腎上腺素信號級聯(lián)系統(tǒng)。AI-3/腎上腺素/去甲腎上腺素信號級聯(lián)系統(tǒng)存在于一些細(xì)菌中，例如志賀氏菌、沙門氏菌、歐文氏桿菌、多殺巴斯德桿菌、流感嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、青紫色素桿菌、柯氏桿菌、耶爾森氏鼠疫桿菌、土拉熱桿菌和青枯雷爾氏菌[27]。腸出血性大腸桿菌可感知AI-3（正常腸道菌群產(chǎn)生）和腎上腺素/去甲腎上腺素（宿主產(chǎn)生），激活腸細(xì)胞脫落位點毒力島基因和鞭毛調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。

1.3 群體感應(yīng)對細(xì)菌生物被膜的調(diào)控

群體感應(yīng)是細(xì)菌生物被膜形成的調(diào)控途徑之一，其通過調(diào)節(jié)鞭毛、胞外多糖、黏附素、表面活性劑等物質(zhì)的合成基因從而影響細(xì)菌生物被膜的形成。銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作為主要的細(xì)菌被膜侵染菌，已被廣泛用于群體感應(yīng)對細(xì)菌生物被膜調(diào)控作用的研究中。

1.3.1 銅綠假單胞菌

大多數(shù)慢性細(xì)菌感染是由于生物被膜的形成，慢性肺部感染是患有囊性纖維化患者的常見感染，也是典型的生物被膜疾病。銅綠假單胞菌是主要的囊性纖維化病原菌之一[28]。由于囊性纖維化基因缺陷導(dǎo)致肺部上皮細(xì)胞頂膜的氯離子通道丟失，有利于銅綠假單胞菌的定植，造成肺部持續(xù)的細(xì)菌感染，引起肺損傷。

銅綠假單胞菌具有3 個主要的群體感應(yīng)系統(tǒng)，分別是lasI/lasR系統(tǒng)、rhlI/rhlR系統(tǒng)以及基于喹諾酮信號（Pseudomonas aeruginosaquinolone signal，PQS）的群體感應(yīng)系統(tǒng)[29]（圖2）。lasI/lasR系統(tǒng)的信號分子為N-(3-氧代十二烷?；?-L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone，3-oxo-C12-HSL），其激活lasI、lasB、lasA、toxA基因的表達(dá)；rhlI/rhlR系統(tǒng)的信號分子為N-丁?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯（N-butyryl-L-homoserine lactone，C4-HSL），其激活rhlI、rhlAB基因的表達(dá)，rhlAB編碼鼠李糖脂（熱穩(wěn)定的溶血素）合成所需的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶[30-31]。las系統(tǒng)和rhl系統(tǒng)之間相互聯(lián)系，las系統(tǒng)通過2 種方式控制rhl系統(tǒng)：LasR和3-oxo-C12-HSL的復(fù)合物激活rhlR基因的轉(zhuǎn)錄；以及3-oxo-C12-HSL阻止C4-HSL與RhlR結(jié)合，從而抑制rhlAB的表達(dá)[31]。PQS系統(tǒng)的信號分子為2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮，屬于2-烷基-4-喹諾酮家族，其前體為2-庚基-4-喹諾酮（2-heptyl-4-quinolone，HHQ），2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮的合成由pqsABCDE操縱子編碼。3-oxo-C12-HSL-LasR復(fù)合物正向調(diào)控PqsR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，PqsR結(jié)合pqsABCDE基因的啟動子，pqsABCDE基因產(chǎn)物指導(dǎo)HHQ的合成，HHQ通過PqsH的作用轉(zhuǎn)化為2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮[32]。PQS系統(tǒng)也會調(diào)控RhlR和RhlI的表達(dá)，從而影響C4-HSL的積累，las和rhl系統(tǒng)對pqsR調(diào)節(jié)起拮抗作用，因此，pqsABCDE的表達(dá)取決于3-oxo-C12-HSL和C4-HSL之間的比例[32]。

群體感應(yīng)信號分子3-oxo-C12-HSL是銅綠假單胞菌生物被膜形成所必需的，阻止3-Oxo-C12-HSL的合成會導(dǎo)致銅綠假單胞菌生物被膜的分化受阻，形成異常的生物被膜[33]。銅綠假單胞菌主要產(chǎn)生3 種胞外多糖：藻酸鹽、Pel和Psl，它們對生物被膜形成和對抗生素抗性具有關(guān)鍵作用。rhl系統(tǒng)可以正向調(diào)控Pel多糖的生物合成；LasR通過結(jié)合到psl操縱子的啟動子區(qū)域，從而調(diào)節(jié)Psl多糖的生物合成；PQS系統(tǒng)與生物被膜形成過程中的eDNA（與野生型生物被膜形成相關(guān)）釋放相關(guān)，pqsA突變體形成的生物被膜含有更少的eDNA[34]。這些結(jié)果表明，銅綠假單胞菌生物被膜的形成受到已知的3 個群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控。此外，鼠李糖脂可作為生物表面活性劑和毒力因子，其在rhl系統(tǒng)控制下合成，在銅綠假單胞菌生物被膜的形成中發(fā)揮多種作用，促進(jìn)銅綠假單胞菌生物被膜中三維蘑菇狀結(jié)構(gòu)的形成，但鼠李糖脂的過量合成會導(dǎo)致生物被膜的分散。銅綠假單胞菌生物被膜的形成除了受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，還受到第2信使雙-(3’-5’)-環(huán)二聚鳥苷單磷酸（bis-(3’-5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate，C-di-GMP）的調(diào)控，高水平的C-di-GMP通過促進(jìn)多糖（藻酸鹽和Pel）的生物合成從而促進(jìn)生物被膜的形成，低水平的C-di-GMP通過增強鞭毛形成和細(xì)菌分散從而引起生物被膜的分散[35]。

圖2 銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)[36]Fig. 2 Quorum sensing circuits in Pseudomonas aeruginosa[36]

1.3.2 金黃色葡萄球菌

金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞表面毒力因子和外毒素，在人體組織和醫(yī)療設(shè)備表面定植并形成生物被膜，導(dǎo)致嚴(yán)重的醫(yī)療問題。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的生物被膜相關(guān)感染包括牙周炎、慢性鼻竇炎、眼部感染、慢性傷口感染、骨髓炎、心內(nèi)膜炎和住院醫(yī)療設(shè)備污染等[37-38]。

金黃色葡萄球菌毒力因子的產(chǎn)生以及生物被膜的形成主要是受到由信號分子AIP介導(dǎo)的agr群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控（圖3）。agr基因由2 個分開的轉(zhuǎn)錄單元RNAII和RNAIII組成，分別從P2和P3啟動子上啟動轉(zhuǎn)錄[37]。P2驅(qū)動的操縱子包含agrBDCA基因，agrD編碼的產(chǎn)物經(jīng)過AgrB修飾，在內(nèi)部半胱氨酸和羧基末端之間形成環(huán)狀硫代內(nèi)酯鍵，從而形成特征性含硫代內(nèi)酯的AIP，AIP激活雙組分AgrC/AgrA調(diào)節(jié)系統(tǒng)，跨膜蛋白AgrC（組氨酸激酶）與細(xì)胞外AIP結(jié)合，AgrC磷酸化后激活細(xì)胞內(nèi)AgrA蛋白；P3驅(qū)動的操縱子編碼δ-溶血素（hld基因編碼），RNAIII上調(diào)包括TS-1和其他溶血素等毒力因子的轉(zhuǎn)錄，并降低以纖連蛋白結(jié)合蛋白A為主的幾種表面黏附素的表達(dá)[22]。

Vuong等[39]研究105 株金黃色葡萄球菌菌株agr系統(tǒng)與其對聚苯乙烯表面黏附能力的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)約有78%的agr陰性菌株和6%的agr陽性菌株形成了生物被膜，證明agr基因?qū)ι锉荒さ男纬捎泻苤匾挠绊憽gr對生物被膜的影響不是由自溶素或細(xì)胞間黏附素的合成引起的，而是取決于毒素的表面活性劑性質(zhì)。群體感應(yīng)對表面活性劑分子表達(dá)的調(diào)控對生物被膜成熟過程至關(guān)重要。這些表面活性劑通過破壞生物被膜細(xì)胞與基質(zhì)成分間的非共價相互作用，導(dǎo)致生物被膜擴散。δ-溶血素具有表面活性劑的作用，由agr系統(tǒng)調(diào)控合成，可能有助于細(xì)胞從金黃色葡萄球菌生物被膜上脫離[40]。酚溶性調(diào)節(jié)蛋白（phenol-soluble modulin，PSM）是具有α-螺旋結(jié)構(gòu)的兩親性葡萄球菌肽，具有表面活性劑特性，psm操縱子的轉(zhuǎn)錄受AgrA反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白嚴(yán)格控制，psm基因的表達(dá)促進(jìn)了生物被膜通道的形成、生物被膜分散和再生等過程[41]。由于agr基因的表達(dá)，從生物被膜中脫落的細(xì)胞不僅可以在宿主中建立其他感染位點，而且還可能導(dǎo)致與急性金黃色葡萄球菌感染相關(guān)的毒血癥。因此，抑制agr基因的表達(dá)，通常導(dǎo)致黏附素因子表達(dá)的增加以及分散因子表達(dá)的降低，從而導(dǎo)致急性感染轉(zhuǎn)化為慢性感染。

圖3 金黃色葡萄球菌的agr型群體感應(yīng)系統(tǒng)[42]Fig. 3 agr quorum sensing system in Staphylococcus aureus[42]

此外，金黃色葡萄球菌還具有其他的群體感應(yīng)系統(tǒng)，如sae系統(tǒng)參與毒力因子的調(diào)控，sae突變體產(chǎn)生的溶血素和凝固酶明顯減少；arl系統(tǒng)抑制溶血素和外切酶的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)自溶活性以及金黃色葡萄球菌的多藥外排泵NorA；srr系統(tǒng)調(diào)節(jié)能量代謝過程，該系統(tǒng)的信號分子可能是甲萘醌，一種氧化呼吸途徑的中間體[40]。

1.3.3 大腸桿菌

大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，是引起復(fù)發(fā)性尿路感染、腦膜炎、敗血癥和出血性結(jié)腸炎等疾病以及醫(yī)療器械感染的主要細(xì)菌[43-44]。大腸桿菌運動性、生物被膜形成、毒力因子產(chǎn)生等相關(guān)基因的表達(dá)與群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控密切相關(guān)。由旋轉(zhuǎn)鞭毛介導(dǎo)的細(xì)菌運動是生物被膜形成的關(guān)鍵特征，細(xì)菌運動到固體表面定植并進(jìn)一步形成生物被膜；鞭毛是細(xì)菌最初到達(dá)固體表面所必需的，隨后鞭毛物理黏附在固體表面[45]。大腸桿菌中不含有編碼AHL合成酶的luxI基因，因此無法合成AHL，但菌體自身含有LuxR同源物SdiA，可響應(yīng)環(huán)境中其他細(xì)菌產(chǎn)生的AHL以調(diào)節(jié)uvrY（毒力因子調(diào)控）和csrA（負(fù)責(zé)細(xì)菌的運動性和鞭毛的生物合成）等基因的表達(dá)，從而促進(jìn)大腸桿菌生物被膜形成、運動性和毒力因子的合成[46]。大腸桿菌luxS基因合成AI-2[47]。AI-2合成后被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，當(dāng)達(dá)到臨界閾值時，通過轉(zhuǎn)運蛋白LsrABCD（一種ABC轉(zhuǎn)運蛋白）進(jìn)入細(xì)胞，然后AI-2被LsrK激酶磷酸化，磷酸化AI-2結(jié)合同源轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子LsrR并抑制基因表達(dá)（圖4）[48]。腸道致病性大腸桿菌還可利用AI-3群體感應(yīng)系統(tǒng)控制黏附素和其他毒力因子的合成。

圖4 大腸桿菌的LsrR/AI-2型群體感應(yīng)系統(tǒng)[48]Fig. 4 LsrR/AI-2 quorum sensing system in E. coli[48]

Bai等[46]研究N-丁酰高絲氨酸內(nèi)酯和N-己酰高絲氨酸內(nèi)酯對大腸桿菌生物被膜形成（附著能力和EPS產(chǎn)生）的影響，發(fā)現(xiàn)1 μmol/mL的N-丁酰高絲氨酸內(nèi)酯和N-己酰高絲氨酸內(nèi)酯均可以增強大腸桿菌對固體表面的附著力和提高EPS產(chǎn)生量，促進(jìn)生物被膜的形成。近年的研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌生物被膜中的胞外多糖主要為β-1,6-N-乙?；?D-葡糖胺聚合物（β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine polymer，PGA）、纖維素和莢膜異多糖酸這3 種。PGA介導(dǎo)細(xì)胞間黏附和附著于表面幫助生物被膜的形成；纖維素介導(dǎo)形成剛性生物被膜；莢膜異多糖酸在細(xì)菌細(xì)胞周圍形成囊并保護(hù)它們免受惡劣環(huán)境的影響，但同時也有抑制生物被膜形成的作用[44]。有研究表明，AI-2與LsrR結(jié)合，協(xié)調(diào)莢膜異多糖酸合成調(diào)節(jié)基因wza和flu的相互作用，介導(dǎo)生物被膜的形成。在lsrR和lsrK突變體中，大腸桿菌生物被膜的形成和結(jié)構(gòu)被顯著改變，與野生型相比，突變體細(xì)菌菌毛和EPS結(jié)構(gòu)以及厚度存在差異[3]。抑制AI-2合成必需的甲硫腺苷核苷酶表達(dá)干擾了大腸桿菌生物被膜形成并減弱了毒力因子的合成[49]。這些結(jié)果表明，群體感應(yīng)系統(tǒng)對大腸桿菌生物被膜的形成不可或缺。

2 群體感應(yīng)抑制劑干擾細(xì)菌生物被膜形成的研究

細(xì)菌引起的感染由于生物被膜的形成難以根除，常規(guī)抗生素（如頭孢菌素、亞胺培南、慶大霉素、林可霉素）較難滲透，使細(xì)胞對抗生素的敏感性下降，因此，迫切需要尋找替代抗生素的物質(zhì)來治療細(xì)菌生物被膜引起的感染。群體感應(yīng)抑制劑是一類以群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶標(biāo)，干擾細(xì)菌生物被膜形成、毒力因子產(chǎn)生或致病基因表達(dá)的物質(zhì)，與傳統(tǒng)抗生素不同的是，在不影響細(xì)菌生長的情況下，可以特異性地抑制細(xì)菌致病性狀的表達(dá)，最大限度減少耐藥突變體的出現(xiàn)[9]。群體感應(yīng)抑制劑通過不同機制干擾細(xì)菌生物被膜的形成，主要包括：1）抑制信號分子合成；2）酶解信號分子；3）利用信號分子類似物與信號分子競爭結(jié)合受體[5]（圖5）。這些具有生物活性的群體感應(yīng)抑制劑的使用，通過破壞生物被膜和減少抗生素劑量優(yōu)化了感染性疾病治療的效果。

2.1 抑制信號分子合成

AHL以SAM和?；d體蛋白為底物合成，因此，可以將SAM合成的抑制劑用作AHL的群體感應(yīng)抑制劑。SAH、5-甲基硫代腺苷（5-methyl thioadenosine，MTA）等SAM類似物和環(huán)亮氨酸等SAM生物合成抑制劑均可以抑制AHL的合成。抑制AHL合成過程中某一種酶的活性，也可阻斷AHL的合成。Christensen等[50]研究發(fā)現(xiàn)，色氨酸衍生物吲哚-3-乙酸（即植物激素生長素）可抑制鼻疽伯克霍爾德氏菌AHL合成酶BmaI1的活性。由于甲硫腺苷核苷酶和SRH酶是AI-2信號分子合成中的關(guān)鍵酶，且僅存在于細(xì)菌中，因此可以作為群體感應(yīng)抑制劑的靶標(biāo)，從而抑制AI-2信號分子的合成[51]。有研究發(fā)現(xiàn)，Ambuic acid是一種真菌次生代謝物，它可以通過抑制AgrB合酶的活性，進(jìn)而抑制不同革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌和單核增生李斯特菌）AIP的生物合成[52]。

2.2 酶解信號分子

信號分子合成后，對其酶解可防止其積累和激活群體感應(yīng)系統(tǒng)。降解群體感應(yīng)信號分子的酶稱為群體猝滅（quorum quenching，QQ）酶。常見的芽孢桿菌屬、銅綠假單胞菌、不動桿菌屬、代爾夫特食酸菌、鞘氨醇單胞菌屬、根癌農(nóng)桿菌、節(jié)桿菌屬和肺炎克雷伯菌均可以產(chǎn)生能夠降解AHL的酶。目前，關(guān)于降解AIP和AI-2的QQ酶研究較少。

AHL降解主要有以下4 種方式：AHL內(nèi)酰胺酶和AHL酰基酶分別水解AHL的高絲氨酸內(nèi)酯環(huán)和酰胺鍵；AHL氧化酶和還原酶修飾AHL改變其活性[26]。其中AHL的內(nèi)酯分解是最典型的一種信號分子酶解方式，通過添加水分子，AHL在水溶液中可自發(fā)打開內(nèi)酯環(huán)，且在高溫和堿性條件下，酯解更易發(fā)生[53]。Gui Meng等[54]研究AHL內(nèi)酯酶AiiAAI96對維氏氣單胞菌LP-11群體感應(yīng)系統(tǒng)的猝滅作用，發(fā)現(xiàn)AiiAAI96通過酶解作用使維氏氣單胞菌LP-11產(chǎn)生的AHLs失活，從而抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致維氏氣單胞菌LP-11的蛋白酶活性和運動性降低。Vanelslander等[55]研究發(fā)現(xiàn)，來自底棲硅藻透明帶的天然鹵過氧化物酶通過H2O2依賴的方式降解AHL側(cè)鏈的鹵代基團，從而使AHL失活。雖然降解信號分子的酶有很多種，但這些酶存在活性偏低、活性受環(huán)境影響較大、且專一性不夠高等缺點，因此，仍需要進(jìn)一步對群體感應(yīng)信號分子降解酶進(jìn)行篩選和改性研究[56]。

2.3 信號分子類似物

AIP的截短類似物、修飾AHL?；鶄?cè)鏈和內(nèi)酯后形成的AHL類似物以及AI-2和DPD類似物，可以競爭性地抑制信號分子與受體結(jié)合，從而阻斷群體感應(yīng)通路的激活。鹵代呋喃酮與AHL結(jié)構(gòu)相似，可參與銅綠假單胞菌群體感應(yīng)的rhl系統(tǒng)，影響生物被膜形成相關(guān)基因的表達(dá)，改變生物被膜的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)菌從生物被膜中脫落。Chang Yiqun等[57]設(shè)計合成了帶烷基鏈、乙烯基溴和芳香環(huán)的呋喃酮類物質(zhì)，研究其對銅綠假單胞菌生物被膜的抑制率，發(fā)現(xiàn)C5芳香族取代的呋喃酮對銅綠假單胞菌生物被膜形成以及毒力因子的產(chǎn)生具有顯著抑制作用。間溴硫代內(nèi)酯（meta-bromo-thiolactone，mBTL）為AHL的類似物，可引起LuxR受體的構(gòu)象變化，削弱LuxR受體與RNA聚合酶的相互作用，降低LuxR受體的轉(zhuǎn)錄激活電位，從而抑制銅綠假單胞菌毒力因子基因的表達(dá)，阻止生物被膜的形成[58]。Vuong等[39]通過合成表皮葡萄球菌的信號分子及其衍生物抑制了金黃色葡萄球菌RN6390的agr系統(tǒng)激活，發(fā)現(xiàn)其與聚苯乙烯塑料的黏附性降低。但這些結(jié)果表明，群體感應(yīng)抑制劑在抗金黃色葡萄球菌治療中的應(yīng)用僅限于急性感染，將急性感染轉(zhuǎn)化為慢性感染。Roy等[59]證明了AI-2類似物異丁基-DPD可以顯著抑制體外培養(yǎng)大腸桿菌生物被膜的成熟，并且異丁基-DPD與抗生素慶大霉素聯(lián)合使用可以清除已形成的大腸桿菌生物被膜。使用群體感應(yīng)抑制劑與傳統(tǒng)抗生素治療相結(jié)合的方法為清除細(xì)菌生物被膜提供了新的途徑。

圖5 群體感應(yīng)抑制劑機制示意圖[60]Fig. 5 Schematic diagram of the mechanism underlying quorum sensing inhibition[60]

3 結(jié) 語

由于生物被膜可以保護(hù)細(xì)菌在惡劣環(huán)境中生存，常規(guī)的抗生素和殺菌劑不能穿透胞外基質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)菌對抗生素和殺菌劑敏感性下降，因此與生物被膜相關(guān)的污染在環(huán)境、食品以及人類與動物感染性疾病方面造成了嚴(yán)重的問題。群體感應(yīng)是調(diào)控細(xì)菌生物被膜形成的關(guān)鍵。盡管目前關(guān)于群體感應(yīng)調(diào)控生物被膜的形成、成熟和分散過程的機制尚不清晰，但已提出群體感應(yīng)抑制劑可作為新型抗生物被膜劑。目前，許多已知的群體感應(yīng)抑制劑具有細(xì)胞毒性，但對其抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)的機理知之甚少，并且這些群體感應(yīng)抑制劑的安全性有待進(jìn)一步探究。因此，需要進(jìn)行更深入的研究以確定群體感應(yīng)抑制劑在生物被膜形成、維持和擴散中的作用，結(jié)合體內(nèi)以及臨床實驗，開發(fā)低毒、高活性的群體感應(yīng)抑制劑，為未來在細(xì)菌感染的治療中提供更大的應(yīng)用價值。