常 紅，畢 耀，王 穎，潘道東，黨亞麗，何 俊，曹錦軒*

（農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315211）

金華火腿是中國最著名的傳統(tǒng)干腌肉制品之一，發(fā)酵時(shí)間長達(dá)數(shù)月，期間分解產(chǎn)生多種營養(yǎng)成分，色澤鮮艷，紅白分明，以色、香、味、形“四絕”聞名于世[1]。傳統(tǒng)金華火腿貯藏一般采用吊掛或者堆疊法暴露于空氣中，火腿天然色素易于氧化導(dǎo)致產(chǎn)品色澤變暗、表面脫水、含鹽量升高、質(zhì)構(gòu)變硬和可接受性降低[2-3]。此外，貯藏過程中霉菌等某些微生物易于生長，微生物內(nèi)的脫羧酶表達(dá)導(dǎo)致火腿中游離氨基酸分解產(chǎn)生生物胺，使得產(chǎn)品存在一定的安全隱患[3]。不當(dāng)貯藏引起的脫水、褪色、微生物超標(biāo)和生物胺積累等嚴(yán)重影響了金華火腿的產(chǎn)品品質(zhì)，制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。因此，通過一定的工藝處理提高產(chǎn)品可接受度和食用品質(zhì)安全有著極大的意義。

研究表明，可食性薄膜和保護(hù)性涂層在肉制品氧化、褪色、水分損失和微生物污染引起的異味等方面起到了重要的抑制作用[5]。目前，西班牙和意大利火腿加工過程中，涂層法是常用的品質(zhì)改良方法，在成熟期的火腿表面涂抹一層阻隔介質(zhì)，可降低火腿半膜肌與空氣的接觸面積，從而減少火腿水分散失，維持產(chǎn)品的品質(zhì)穩(wěn)定[6]。動植物油及淀粉、殼聚糖是常用的火腿涂層介質(zhì)[7]，然而這些涂層存在成膜性差、保水性差以及抗菌范圍窄等不足[8]。植物精油是一類植物次生代謝產(chǎn)物，有研究表明其具有抑菌[9]及抗氧化[10]的作用，已被開發(fā)應(yīng)用于肉制品的保藏[11]。其中，黑胡椒精油（black pepper essential oil，BPEO）作為世界上最受歡迎的肉類調(diào)料之一，主要成分是胡椒堿和胡椒堿異構(gòu)體，還有單帖和半萜類化合物[12]，具有良好的抗菌和抗氧化作用[9,13-14]。王穎等[10]的研究結(jié)果表明BPEO具有良好的抗氧化活性，對食品污染菌也有著明顯的抑制作用。Zhang Jing等[15]研究BPEO對鮮豬肉貯藏品質(zhì)的影響，結(jié)果表明革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌對BPEO更敏感。將精油與可食性膜制備成復(fù)合涂層，具備潛在預(yù)防脫水、褪色、微生物超標(biāo)和生物胺積累等作用[16-17]。但是將BPEO用于火腿涂層中提高食用品質(zhì)安全的研究較少。因此，本研究擬采用4 種涂層處理金華火腿表面，評價(jià)其貯存4 個(gè)月后色澤、水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、菌落總數(shù)以及生物胺含量等理化特性及食用品質(zhì)安全的變化，以期為工業(yè)生產(chǎn)實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統(tǒng)金華火腿（NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%）購自于金華宗澤火腿有限公司，采用自然發(fā)酵條件下加工而成[18]。

BPEO（純度不低于98%，4 ℃避光保存） 意大利Moellhausen S.p.A.公司。在使用前，用體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液將BPEO稀釋至體積分?jǐn)?shù)分別為0.05%和0.1%。

丙酮（色譜純） 杭州高晶精細(xì)化工有限公司；乙腈（色譜純） 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；高氯酸、丹磺酰氯等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Allerga冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司；WH966漩渦攪拌器；M124A電子精密天平、pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫水浴鍋 天瑞儀器有限公司；高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；CR-400色差儀 日本柯尼達(dá)美能達(dá)公司；Micropro2000Reader酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；XHF-D高速分散器 寧波新芝生物科技公司；Milli-Q型超純水制備系統(tǒng) 德國Merck公司。

1.3 方法

1.3.1 涂抹液的制備

根據(jù)不同的涂抹混合物，將20 只火腿分為4 組：對照組（不涂抹）、基礎(chǔ)配方涂層（base formula coating，BC）組、低劑量黑胡椒精油復(fù)合涂層（low-dose BPEO containing composite coating，LBPEOC）組、高劑量黑胡椒精油復(fù)合涂層（high-dose BPEO containing composite coating，HBPEOC）組?；A(chǔ)配方包括750 g面粉、375 mL植物油、375 g豬油、75 g β-環(huán)糊精；LBPEOC、HBPEOC組在基礎(chǔ)配方上，再分別加上0.6 mL的0.05% BPEO和0.1% BPEO。

具體涂抹液的制作方法：將豬油在40 ℃熔化，加入面粉、植物油和β-環(huán)糊精，用玻璃棒攪拌均勻，最后將BPEO加入混合物中混勻制備成涂抹液。

1.3.2 火腿取樣、涂層和樣品制備

將火腿表面的氧化層剔除，然后按照分組用小刷子將制備的涂抹混合物均勻地涂在火腿表面，厚度約為0.5 cm，平攤，室溫25 ℃和相對濕度60%～70%下貯藏4 個(gè)月。各組均按照每100 g火腿2.1 mL涂抹液進(jìn)行涂抹。貯存4 個(gè)月后，從每組5 條火腿中取出5 塊股二頭肌條，采集肌肉條進(jìn)行指標(biāo)測定。所有樣品待測定色澤后，切成小塊（約1 cm×1 cm×1 cm）測定水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、菌落總數(shù)及生物胺。

1.3.3 水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

按照GB/T 9695.15—2008《肉與肉制品 水分含量測定》測定水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。每組平行測定5 次。

1.3.4 色澤測定

使用色差儀對樣品進(jìn)行亮度（L*）、紅度（a*）和黃度（b*）的測定，使用前對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。參數(shù)光源設(shè)置為D65，測定直徑8 mm。4 個(gè)處理樣品隨機(jī)取3 個(gè)點(diǎn)，每組樣品平行測定5 次。

1.3.5 pH值測定

pH值的測定參照楊帆等[19]的方法。稱取5 g絞碎的火腿樣品，加入20 mL蒸餾水，用高速勻漿機(jī)勻漿1 min，勻漿結(jié)束后，過濾，收集濾液，用pH計(jì)立即測定勻漿液的pH值。

1.3.6 菌落總數(shù)的測定

菌落總數(shù)測定參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》的方法進(jìn)行。

1.3.7 生物胺含量測定

生物胺含量的測定參照Alberto等[20]的方法，并稍作修改。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：將8 種生物胺的標(biāo)準(zhǔn)品制成1 mg/mL儲備液備用。使用0.4 mol/L高氯酸溶液將以上標(biāo)準(zhǔn)品儲備液配成終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。鋁箔避光，-20 ℃冰箱保存。8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線以溶液的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以各標(biāo)準(zhǔn)溶液生物胺和內(nèi)標(biāo)的峰面積比為橫坐標(biāo)繪制。

樣品處理：將20 mL高氯酸溶液（0.4 mol/L）加入到5 g絞碎肉樣中，冰上勻漿，4 ℃離心（5 000 r/min、10 min）后收集上清液，沉淀重復(fù)提取一次。將兩次提取的上清液用0.4 mol/L高氯酸溶液定容到50 mL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的衍生化：分別取1 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣液，加入200 μL NaOH溶液（2 mol/L）使之呈堿性，加入300 μL飽和NaHCO3溶液進(jìn)行緩沖，然后加入2 mL的丹磺酰氯溶液（10 mg/mL，溶劑為色譜級丙酮，現(xiàn)配現(xiàn)用），于40 ℃水浴中暗反應(yīng)處理30 min后加入100 μL氨水終止反應(yīng)，去除殘留的丹磺酰氯溶液。最后用乙腈定容至5 mL，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，然后進(jìn)行高效液相色譜分析。

色譜條件：ZORBAX XDB-C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫：40 ℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣體積：20 μL，紫外檢測波長：254 nm，流動相：水（A相）、乙腈（B相）和0.1 mol/L乙酸銨（C相）。洗脫程序見表1。

表1 高效液相色譜儀分析生物胺的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for high performance liquid chromatography analysis of biogenic amines

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SAS 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值，采用One-way ANOVA（Duncan’s Multiple Range Test模型）進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同涂層處理對火腿水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

圖1 不同涂層處理對金華火腿水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig. 1 Effects of different coating treatments on moisture content of Jinhua ham

由圖1可知，貯存4 個(gè)月后，對照組以及BC、LBPEOC和HBPEOC涂層組的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為33.88%、35.66%、37.48%和39.36%。相比于對照組，涂層處理顯著提高了產(chǎn)品的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（P＜0.05），精油復(fù)合涂層組保水效果更好一些，且保水性改善效果取決于精油使用量。結(jié)果表明，涂抹處理顯著降低了火腿樣品水分流失。

傳統(tǒng)金華火腿質(zhì)構(gòu)較硬，使得消費(fèi)者的可接受程度大大降低[4]，因此，貯藏期間鎖住火腿的水分十分重要。動植物油具有良好的阻水特性，通常添加到多糖等可食性膜中，可提高膜的抗水性，減少食物水分流失；同時(shí)具有較好的機(jī)械性能和屏障作用[21]；BPEO涂抹液是一類黏稠的油狀液體，能阻隔火腿表面的水分過度揮發(fā)，提高樣品的持水性。Menon[22]、Zengin[23]和李文茹[24]等報(bào)道，BPEO主要化合物是萜類化合物，其多為有特殊氣味的疏水性物質(zhì)，具有一定的阻水性。各涂層組火腿水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)從小到大為BC組＜LBPEOC組＜HBPEOC組，可能是因?yàn)锽PEO具有更強(qiáng)的抗氧化能力，使得大部分蛋白質(zhì)水解程度降低，細(xì)胞的完整性遭到較少的破壞。然而對于對照組，肌纖維收縮，擠壓內(nèi)部細(xì)胞，從而進(jìn)一步加速胞內(nèi)物質(zhì)的流出，導(dǎo)致水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低[25]。

2.2 不同涂層處理對火腿色澤的影響

表2 不同涂層處理對金華火腿色澤的影響Table 2 Effects of different coating treatments on color of Jinhua ham

色澤是衡量肉類食品非常重要的食用品質(zhì)參考指標(biāo)，直接從視覺上決定了肉制品的感官品質(zhì)。色澤測定結(jié)果如表2所示。相比對照組和BC組，LBPEOC和HBPEOC組的亮度（L*值）和紅度（a*值）顯著升高（P＜0.05），而黃度（b*值）顯著降低（P＜0.05）。說明與對照和BC處理相比，BPEO復(fù)合涂層處理提高了金華火腿的亮度和紅度，降低了黃度。肉制品的色澤直接影響著消費(fèi)者的感官感受，金華火腿中主要色素為亞硝基肌紅蛋白，該蛋白賦予干腌火腿鮮艷的玫瑰紅色[26]。隨著貯藏時(shí)間的延長和自由基生成，亞硝基肌紅蛋白容易轉(zhuǎn)化為高鐵肌紅蛋白[27]，一些還原性物質(zhì)，如異抗壞血酸鈉可以起到穩(wěn)定亞硝基肌紅蛋白的作用。此外，干腌肉制品貯藏過程中的脂質(zhì)氧化會導(dǎo)致黃度升高[26]。BPEO由于富含萜類化合物，具有較強(qiáng)的抗氧化作用，BPEO復(fù)合涂層處理可以在一定程度上穩(wěn)定亞硝基肌紅蛋白。郭莎莎等[27]發(fā)現(xiàn)將4 種抗氧化劑添加在火腿中，能顯著提高亞硝基肌紅蛋白穩(wěn)定性和抑制脂質(zhì)氧化，使得火腿產(chǎn)品的紅度升高。Zhang Jing等[15]研究結(jié)果表明，使用BPEO降低了高鐵肌紅蛋白的含量，使得豬肉的整體亮度穩(wěn)定提升。BPEO復(fù)合涂層處理顯著降低了火腿的黃度，可能歸因于精油中萜類化合物可以有效減緩脂質(zhì)氧化[26]。戴照琪等[6]研究結(jié)果表明，復(fù)合精油涂層對火腿半膜肌的脂質(zhì)氧化有較好的抑制作用。

2.3 不同涂層處理對火腿pH值的影響

圖2 不同涂層處理對金華火腿pH值的影響Fig. 2 Effects of different coating treatments on pH of Jinhua ham

pH值與肉制品的保水性有關(guān)，肉制品pH值越偏離于肌原纖維蛋白的等點(diǎn)電，其保水性越好。由圖2可知，貯存4 個(gè)月后，與對照組相比，BC組和BPEO復(fù)合涂層組的pH值均升高，且HBPEOC組的pH值顯著升高（P＜0.05）?？赡苁怯捎谳祁惢衔锬軌蚪档臀⑸锬る娢?，破壞其膜結(jié)構(gòu)完整性[24,28-30]，特別是對于革蘭氏陽性細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用[31]。乳酸菌廣泛存在于肉制品中，是一類典型的革蘭氏陽性細(xì)菌，其厭氧發(fā)酵在一定程度上受到了BPEO組高劑量復(fù)合涂層處理的抑制。Fan Wenjiao等[32]研究了殼聚糖涂層對冷藏期間鯉魚品質(zhì)和保質(zhì)期的影響，發(fā)現(xiàn)pH值的增加與在內(nèi)源或微生物酶的作用下蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮物質(zhì)被分解有關(guān)?？傊珺PEO復(fù)合涂層處理金華火腿，能夠在火腿表面形成一層疏水性膜，抑制產(chǎn)品水分損失，同時(shí)也一定程度抑制了乳酸菌等微生物的發(fā)酵，從而使得pH值升高。

2.4 不同涂層處理對火腿菌落總數(shù)的影響

圖3 不同涂層處理對金華火腿菌落總數(shù)的影響Fig. 3 Effects of different coating treatments on aerobic plate count in Jinhua ham

菌落總數(shù)常作為一項(xiàng)重要指標(biāo)，用于評價(jià)肉制品的安全性[33]。由圖3可知，與對照組和BC組相比，兩個(gè)精油復(fù)合涂層處理能夠顯著降低火腿的菌落總數(shù)（P＜0.05），主要由于BPEO的疏水性使其在微生物的細(xì)胞膜和線粒體的脂質(zhì)中分配，增加了微生物細(xì)胞膜通透性，使得細(xì)胞內(nèi)容物滲漏，從而有效使微生物致死[15,34]；另一方面由于面粉、β-環(huán)糊精和動植物油等載體可能有一定吸附BPEO的能力，起到緩慢釋放的效果，從而達(dá)到長效抑菌作用。對照組的菌落總數(shù)在4 組中最高。因此，涂層對火腿中微生物數(shù)量有一定的抑制作用，高劑量精油復(fù)合涂層組的抑菌效果最好。

2.5 不同涂層處理對生物胺含量的影響

圖4 生物胺混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig. 4 Chromatographic profiles of standard solution of biogenic amines

本實(shí)驗(yàn)使用高效液相色譜儀測定了8 種生物胺的含量。8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與其質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，R2均大于0.99。圖4為8 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖。在5 min內(nèi)可以洗脫出全部溶劑峰和雜質(zhì)峰，30 min內(nèi)可以洗脫并有效分離全部生物胺標(biāo)準(zhǔn)品。因此該方法能較好地分析各生物胺的含量。對照單標(biāo)色譜圖以及保留時(shí)間可以確定8 種生物胺的出峰順序。

表3 不同涂層處理對金華火腿生物胺含量的影響Table 3 Effects of different coating treatments on biogenic amine contents of Jinhua ham

不同涂層處理的金華火腿貯存4 個(gè)月后生物胺的含量如表3所示。對照組的總生物胺含顯著高于其他在4 個(gè)涂層處理組。在BPEO復(fù)合涂層處理組中，與對照組相比，苯乙胺、腐胺和尸胺的含量顯著降低，未檢測到色胺，且酪胺僅在高劑量組中未檢測到。在所有生物胺中，組胺的毒性最強(qiáng)，是發(fā)酵肉類產(chǎn)品中重要的生物胺，對人類健康具有很大的威脅[35]。在對照組中，組胺所占總生物胺的比例最低，涂層處理的火腿中均未檢測到組胺。精胺和亞精胺是存在于新鮮豬肉中的天然生物胺[36]。與對照相比，BPEO復(fù)合涂層處理能顯著降低精胺和亞精胺的含量。綜上所述，涂層處理對火腿中的生物胺產(chǎn)生具有較強(qiáng)的抑制作用，BPEO復(fù)合涂層組能起到很好的抑制效果，提高產(chǎn)品的安全性。

生物胺的產(chǎn)生歸因于存活的微生物和由微生物產(chǎn)生的脫羧酶的殘余活性[37]。在發(fā)酵肉制品中有生物胺產(chǎn)生能力的微生物主要有：乳桿菌屬、腸桿菌科、假單胞菌屬和腸球菌[38]。與對照組和BC組相比，BPEO復(fù)合涂層處理能使得火腿中的菌落總數(shù)顯著下降。Zhang Xin等[11]研究發(fā)現(xiàn)，在新鮮香腸的貯存期間，肉桂精油可以降低微生物的數(shù)量防止生物胺的形成。此外，BPEO的抑菌作用也可能通過抑制氨基酸脫羧酶的活性進(jìn)一步阻止生物胺的形成。Zhang Xin等[11]研究發(fā)現(xiàn)BPEO能顯著抑制大腸桿菌的繁殖，并進(jìn)一步抑制賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶活性，從而抑制尸胺和腐胺的生成，使總生物胺水平顯著下降。高鹽食品中的氯化鈉含量高，可以提高精油的效果，增加細(xì)菌細(xì)胞的滲透性，降低脫羧酶的活性[39]。金華火腿13%的含鹽量一定程度上也能抑制微生物的生長，降低脫羧酶的活性，從而抑制生物胺的生成。朱志遠(yuǎn)等[40]的研究結(jié)果表明使用高鹽量腌制對生物胺的產(chǎn)生有抑制作用。

3 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，BPEO復(fù)合涂層處理金華火腿，能通過在火腿表面形成一層疏水性膜并提高pH值，抑制產(chǎn)品水分損失；通過抑制色素、脂質(zhì)氧化，改善了產(chǎn)品色澤；通過抑制微生物繁殖，極大程度上降低了生物胺帶來的安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，BPEO復(fù)合涂層處理是一種有效的金華火腿貯藏方法。