何傳波，鄧 婷，魏好程，吳國宏，上官宇晨，熊何健*

（集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021）

生物體內(nèi)自由基的過量積累會造成機體在分子水平、細胞水平及組織器官水平的各種不可逆的氧化損傷[1]，從而加快機體氧化衰老進程，引發(fā)各類疾病[2]。適當攝入外源抗氧化劑，可通過清除體內(nèi)自由基和抑制體內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應，從而保護機體生物大分子免受氧化損傷。在各種外源抗氧化劑中，天然多糖類物質(zhì)具有種類多、來源廣、安全性高、抗氧化效果顯著等優(yōu)點，已經(jīng)引起眾多學者關注，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，各種動植物提取的天然多糖物質(zhì)如黃芪多糖、枸杞多糖、鮑多糖等具有顯著的體內(nèi)或體外抗氧化活性[3-6]。不少研究也表明，多糖的抗氧化活性可能是其促進免疫、抗腫瘤、抗衰老等其他活性的有效作用機制之一[7]。

仙草（Mesona blumes）系唇形科（Labiatae）涼粉草屬（Mesona BI.）一年生草本宿根植物，主要分布于我國福建、廣東、廣西、臺灣及東南亞等地[8]，其中以福建省栽培面積最大。仙草味澀、性寒，具有清暑涼血及利尿之功效，主治中暑、消渴、感冒、高血壓、黃疸、腎臟病和糖尿病等[9-11]，全草可入藥。同時，仙草食用歷史悠久，加工利用價值高，以其為原料的涼茶、仙草凍、仙草茶、燒仙草等多種食品廣受歡迎。目前仙草主要用于涼茶飲料生產(chǎn)，近年來在國內(nèi)涼茶產(chǎn)業(yè)的帶動下，仙草的種植面積和產(chǎn)量迅速增加。作為仙草主產(chǎn)區(qū)的福建省，2005—2014年，仙草栽培面積從500 hm2增加至5 000 hm2，產(chǎn)量從4 000 t迅速增加達到3.8萬 t[12]。但是，仙草用途的單一性也造成其對涼茶產(chǎn)業(yè)的過度依賴，增加了種植風險。為此，亟需深入研究仙草的活性成分，充分挖掘其深層次開發(fā)利用價值，豐富產(chǎn)品結構，這對延伸和完善仙草種植和加工產(chǎn)業(yè)鏈，發(fā)展地方經(jīng)濟具有重要的現(xiàn)實意義。

仙草含有多糖、黃酮類、三萜類、酚類化合物等多種化學成分，多糖是其中含量最多、應用最廣的有效成分，占仙草質(zhì)量的20%左右[13]。有報道證實仙草多糖具有促進凝膠、抑菌和抗氧化等功能作用[14-15]。隨著人們對安全與健康的日益關注，以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品行業(yè)的發(fā)展趨勢，因此仙草多糖作為高效安全的天然抗氧化劑具有廣闊的開發(fā)前景。本研究以福建仙草為原料，通過離子交換層析和凝膠柱層析對堿法提取的仙草粗多糖進行分級純化，構建了人體肝細胞LO2的過氧化氫（H2O2）損傷模型，通過測定乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活力和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量等指標，從細胞水平上探討仙草多糖對氧化損傷細胞的保護作用，以期為仙草多糖天然抗氧化劑的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

仙草，產(chǎn)自福建省龍巖市，洗凈曬干，粉碎后過篩（80 目），置于干燥器中，貯存?zhèn)溆谩Ｈ梭w肝細胞LO2細胞株，來源于中國藥科大學藥學醫(yī)學基礎實驗教學中心。

層析柱填料DEAE Sepharose CL-6B、Sephacryl S-300HR 美國GE Healthcare公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、乙腈（色譜純）、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）、臺盼藍、單糖標準品（甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、半乳糖醛酸） 美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 德國PAN公司；DMEM高糖基礎培養(yǎng)基、雙抗（青霉素/鏈霉素）、質(zhì)量分數(shù)0.25%胰酶 美國HyClone公司；BCA（2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉）蛋白定量試劑盒、LDH、GSH-Px、CAT、SOD、MDA測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其余化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BT1-100L-LCD蠕動泵、SBS-100-LCD自動部份收集器、TH-1000A梯度混合儀 上海琪特分析儀器有限公司；WK-200B高速藥物粉碎機 青州市精誠機械有限公司；JDG-0.2T真空凍干機 蘭州科近真空凍干技術有限公司；3K3D高速冷凍離心機 德國Sigma公司；RNF0460-011多功能卷式膜設備 廈門福美科技有限公司；UV-8000A紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；BS-124S電子天平 德國賽多利斯股份有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；pH211臺式酸度測定儀 北京哈納科技有限公司；MSI微型漩渦振蕩器 廣州科技實驗室技術有限公司；Ultimate3000高效液相色譜儀 美國DIONEX公司；E2695凝膠滲透色譜儀、2417示差檢測器 美國Waters公司；LEAD-2 18角度激光光散射儀 奧豪斯儀器（上海）有限公司；EVOS倒置顯微鏡 美國AMG公司；DW-FL253低溫冰箱 中科美菱公司；M200PRO酶標儀 瑞士Tecan公司；SeriesIIWater CO2細胞培養(yǎng)箱美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 仙草粗多糖的制備

稱取一定量仙草粉末，按液料比30∶1加入質(zhì)量分數(shù)1.2%的NaHCO3溶液，沸水浴浸提3 h，離心收集上清液，過超濾膜后收集截留液，減壓濃縮后加入5 倍體積的體積分數(shù)95%乙醇溶液沉淀，離心，沉淀加水溶解，經(jīng)濃縮、透析、凍干后即為仙草多糖，命名為JMBP-C樣品。

1.3.2 仙草多糖的層析純化流程

仙草粗多糖JMBP-C→DEAE Sepharose CL-6B離子交換層析→收集目標洗脫液→透析→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→Sephacryl S-300HR柱層析→收集目標洗脫液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→冷凍干燥→純化仙草多糖組分JMBP-N、JMBP-A1、JMBP-A2

1.3.3 多糖樣品化學組成測定

多糖質(zhì)量分數(shù)的測定：苯酚-硫酸法[16]；糖醛酸質(zhì)量分數(shù)測定：硫酸-咔唑法[17]；蛋白質(zhì)量分數(shù)的測定：參照GB 5009.5—2010《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》。

1.3.4 單糖組成分析

取8 種標準單糖（甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖）各5 mg，配制成1 mg/mL的標準品溶液。取500 μL單糖標準品，加入500 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，再加入500 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，混勻后于70 ℃水浴條件下衍生60 min，冷卻后，加入500 μL 0.3 mol/L HCl溶液，混勻。再滴加1 mL三氯甲烷，漩渦振蕩2 min，棄去下層，重復操作3 次，最后過0.45 μm微孔濾膜備用。

稱取2 mg仙草多糖樣品，加入2 mol/L三氟乙酸溶液1 mL，充入氮氣密封，110 ℃烘箱中水解6 h，冷卻至室溫。加入1 mL甲醇溶液（色譜純），50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，重復旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)操作3～5 次直到全部去除三氟乙酸，用500 μL超純水溶解，參照上述單糖標準品衍生法制備多糖樣品衍生物。

分離柱采用Symmetry C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長250 nm；柱溫：25 ℃；上樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；流動相：0.1 mol/L磷酸鹽水溶液-乙腈（8∶2，V/V）；洗脫方式：等梯度洗脫；洗脫時間：30 min。

1.3.5 分子質(zhì)量測定

樣品處理：多糖樣品用200 mmol/L NaCl（含有0.02% NaN3）溶液溶解至2 mg/mL，4 ℃保存過夜，12 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜備用。

色譜條件：采用GPC-MALLS技術[18-19]，液相系統(tǒng)：e2695 HPLC；檢測器：2414示差檢測器和DAWN HELEOS-Ⅱfrom Wyatt激光散射儀；色譜柱：Shodex SB-804凝膠分離柱；流動相：200 mmol/L NaCl＋0.02% NaN3溶液；進樣量：100 μL；流速：0.5 mL/min；柱溫：40 ℃。

1.3.6 細胞抗氧化實驗

1.3.6.1 LO2細胞的培養(yǎng)

接收到新的LO2細胞后，換成新配制的含有質(zhì)量分數(shù)10% FBS、1%雙抗的DMEM高糖完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3 代后大量凍存細胞，以保證后續(xù)細胞實驗的穩(wěn)定性。新復蘇的LO2細胞傳代至少3 代后開始實驗，所有的實驗應在細胞傳代20 代前完成。

1.3.6.2 仙草多糖對細胞存活率的影響

取對數(shù)生長期的LO2細胞，調(diào)整其細胞密度1×105cells/mL，100 μL/孔接種于96 孔板中，37 ℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗1～2 遍后分為空白組、實驗組和正常對照組?？瞻捉M不加細胞只加完全培養(yǎng)基；實驗組加入不同質(zhì)量濃度（初次篩選時為0.005、0.05、0.5、2.5、5、10 mg/mL，進一步篩選時為0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL）的仙草多糖樣品JMBP-C、JMBP-N、JMBP-A1、JMBP-A2，各質(zhì)量濃度設置6 組平行；正常對照組用完全培養(yǎng)基代替多糖溶液。3 組繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上清液，PBS清洗2 次，加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入150 μL二甲基亞砜，振蕩5 min，用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度。通過下式計算細胞存活率。

1.3.6.3 細胞H2O2氧化損傷模型的建立

調(diào)節(jié)處于對數(shù)生長期的細胞密度為1×105cells/mL，接種于96 孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗2 次。將細胞分為空白組、正常對照組和損傷模型組，其中，空白組和正常對照組同1.3.6.2節(jié)，損傷模型組分別加入100 μL不同濃度的H2O2溶液（以完全培養(yǎng)基配制，濃度分別為0、0.5、1、2、4、6、8、10 mmol/L），各濃度設置6 個平行，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。H2O2損傷后，棄上清液，PBS清洗2 遍，再按照1.3.6.2節(jié)中MTT法測定細胞存活率。

1.3.6.4 仙草多糖對H2O2損傷細胞保護作用的測定

細胞培養(yǎng)同1.3.6.1節(jié)，設正常對照組、H2O2損傷模型組、實驗組和VC陽性對照組。正常對照組和損傷模型組加入完全培養(yǎng)基，實驗組加入不同質(zhì)量濃度的仙草多糖，陽性對照組加入不同濃度的VC，再培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS清洗2 遍，正常對照組加入完全培養(yǎng)基，其余組加入4 mmol/L H2O2溶液進行氧化損傷2 h，培養(yǎng)結束用MTT測定細胞存活率。

1.3.6.5 抗氧化指標的測定

調(diào)整對數(shù)生長期的LO2細胞密度為5×105cells/mL，1.5 mL/孔接種于6 孔板中，放置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設正常對照組、H2O2損傷模型組、JMBP-C組、JMBP-A1組、JMBP-A2組、VC陽性對照組，具體操作同1.3.6.4節(jié)。細胞經(jīng)仙草多糖樣品和H2O2處理后，收集細胞培養(yǎng)液和細胞進行各種指標的測定。其中細胞培養(yǎng)液直接用于LDH活力的測定；細胞用PBS清洗2 次，1 mL 0.25%胰蛋白酶進行消化，1 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，加入1 mL PBS，冰浴條件下超聲破碎細胞（功率300 W，5 s/次，間隔時間30 s，重復5 次）。GSH-Px、CAT、SOD活力及MDA生成量的計算均以蛋白含量為基礎，蛋白含量測定采用BCA法。以上抗氧化指標的測定均使用試劑盒檢測，所有操作嚴格按說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗結果用±s表示，通過Duncan檢驗法進行顯著性分析，P＜0.01為極顯著性差異，P＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 仙草多糖的組成

采用NaHCO3溶液浸提仙草多糖，在前述制備條件下，多糖得率為8.1%。得到的仙草粗多糖JMBP-C經(jīng)離子交換和凝膠柱層析純化后得到3 個組分JMBP-N、JMBP-A1和JMBP-A2，其中，JMBP-N為超純水洗脫的中性糖組分，JMBP-A1和JMBP-A2為NaCl梯度洗脫的酸性多糖組分。各組分占初始進樣量（1 g）的比例分別為22.14%、28.97%和34.07%（以多糖含量計算），多糖總回收率為85.18%。

觀察其外觀形態(tài)，4 種組分的顏色為白色或淺黃色；質(zhì)地輕，溶解性良好，溶于水后接近透明。粗多糖除了表1中所列成分外，還含有較多的黃酮，經(jīng)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法測定質(zhì)量分數(shù)為7.71%，這與文獻[13]報道結果一致。4 種組分蛋白含量都很少，除了中性糖組分JMBP-N外，另外3 種多糖均含有較多的糖醛酸，以JMBP-A2的質(zhì)量分數(shù)最高，達到59.14%。這與Lai等[20]的結論一致，其研究發(fā)現(xiàn)臺灣仙草膠主要成分是多糖，含有大量的糖醛酸，并推測仙草膠屬于陰離子性多糖。仙草的凝膠性是其食品加工的重要特性，根據(jù)糖醛酸含量較高的果膠成膠機理推測，糖醛酸可能在仙草凝膠過程中也起著重要的作用。在后續(xù)的研究中也證實了這一點，中性糖JMBP-N無法與淀粉形成凝膠，只有2 種酸性多糖組分才可以成膠。

表1 仙草多糖的外觀及化學組成Table 1 Appearance and chemical composition of Mesona blumes polysaccharides

單糖組成分析是研究多糖結構、性質(zhì)等的基礎，對純化后的3 種多糖樣品進行水解衍生后，通過高效液相色譜測定仙草多糖的單糖組成，結果如表2所示。中性糖JMBP-N的單糖組成較為簡單，由甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）和半乳糖（Gal）組成，以半乳糖質(zhì)量分數(shù)最高。2 種酸性糖中，JMBP-A1由甘露糖、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖、半乳糖、木糖（Xyl）組成，以木糖質(zhì)量分數(shù)最高，JMBP-A2由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖（Ara）和巖藻糖（Fuc）組成，以半乳糖醛酸的質(zhì)量分數(shù)最高。目前，已有文獻報道仙草粗多糖由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖等多種單糖組成[21-22]，這與本實驗結果一致。

表2 仙草多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide compositions of Mesona blumes polysaccharides

2.2 仙草多糖的分子質(zhì)量

采用凝膠滲透色譜-多角度激光光散射法分析3 個純化組分的重均分子質(zhì)量（Mw），結果如表3所示。對比各組分的多分散性（Mw/Mn）可知，JMBP-N和JMBP-A2的多分散性值接近1，說明該樣品純度較高，而JMBP-A1的純度相對較低。3 種多糖組分中JMBP-A1的分子質(zhì)量最大，為15.19 kDa，其次是JMBP-A2，為12.06 kDa，JMBP-N的分子質(zhì)量最小，為1.25 kDa，表征分子尺寸的均方根旋轉(zhuǎn)半徑由大到小也是JMBP-A1＞JMBP-A2＞JMBP-N。

表3 仙草多糖的重均分子質(zhì)量及分子尺寸Table 3 Molecular masses and sizes of Mesona blumes polysaccharides

2.3 仙草多糖對H2O2損傷細胞的影響

2.3.1 仙草多糖對正常細胞生長的影響

圖1 不同質(zhì)量濃度的仙草多糖對LO2細胞生長的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of Mesona blumes polysaccharides on LO2 cell growth

為了確定仙草多糖對正常細胞的毒性作用，在構建細胞氧化損傷模型前，首先探討了不同質(zhì)量濃度的仙草粗多糖及3 種純化樣品對正常LO2細胞生長的影響，以細胞生長率為檢測指標，結果如圖1所示，細胞存活率的檢測采用MTT比色法。結果表明，仙草多糖在質(zhì)量濃度0.005～2.5 mg/mL范圍內(nèi)均對LO2細胞的生長無明顯影響，細胞存活率都達到90%以上。當質(zhì)量濃度達到5 mg/mL時，4 種多糖樣品組的細胞存活率明顯下降，分別下降到正常對照組的21.63%、72.72%、88.70%和92.02%，說明高質(zhì)量濃度的仙草多糖對LO2細胞的生長有一定的抑制作用，縮小多糖處理質(zhì)量濃度范圍為0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL（圖1B）。LO2細胞的存活率均在90%以上，細胞增殖率均在10%以下，多糖對細胞生長無顯著增殖或衰亡作用，因此確定以此多糖質(zhì)量濃度范圍進行進下一步實驗。

2.3.2 細胞氧化損傷模型的建立

不同細胞對H2O2氧化損傷的耐受程度不同，需要確定氧化損傷模型的H2O2濃度，篩選條件為與空白對照組比較達到半數(shù)細胞致死。不同濃度H2O2處理對LO2細胞存活率的影響如圖2所示。結果表明，細胞存活率隨H2O2濃度的增加明顯呈下降趨勢，濃度為4 mmol/L時，細胞的存活率為51%，接近半數(shù)致死，當濃度為10 mmol/L，細胞存活率甚至低至20%左右。因此，選擇H2O2濃度4 mmol/L建立LO2細胞損傷模型。

圖2 不同濃度H2O2對LO2細胞相對存活率的影響Fig. 2 Effects of different concentrations of H2O2 on the relative survival rate of LO2 cells

2.3.3 仙草多糖對氧化損傷細胞的保護作用

圖3 仙草多糖對LO2細胞氧化損傷的保護作用Fig. 3 Protective effect of Mesona blumes polysaccharides on oxidative damage in LO2 cells

仙草多糖對H2O2誘導LO2細胞氧化損傷的保護作用見圖3。與H2O2模型組相比，JMBP-N對細胞氧化損傷基本無保護作用，JMBP-A1的保護效果最好，其各質(zhì)量濃度組的細胞存活率均極顯著增長（P＜0.01），0.5 mg/mL時，細胞存活率比模型組增加49.47%。JMBP-C組和JMBP-A2組在質(zhì)量濃度為0.125 mg/mL時細胞存活率增長顯著（P＜0.05），質(zhì)量濃度達到0.25 mg/mL以上時細胞存活率增長極顯著（P＜0.01），表明仙草多糖對H2O2誘導LO2細胞氧化損傷有保護作用。因此選擇JMBP-C、JMBP-A1及JMBP-A2進行后續(xù)的抗氧化實驗，選取多糖樣品質(zhì)量濃度0.125、0.5 mg/mL和2 mg/mL進行后續(xù)抗氧化指標的測定。

2.3.4 仙草多糖對氧化損傷細胞LDH的影響

圖4 仙草多糖對LDH活力的影響Fig. 4 Effect of Mesona blumes polysaccharides on LDH activity

LDH廣泛存在于生物體內(nèi)，細胞受到氧化損傷后，體內(nèi)活性自由基增加，破壞細胞膜，細胞膜破裂會使胞內(nèi)LDH漏出，上清液中LDH釋放量能間接反映細胞的損傷程度。從圖4中可看出，H2O2作用于LO2細胞后，LDH釋放量為正常對照組的1.24 倍，呈極顯著升高（P＜0.01）。仙草多糖能明顯減少培養(yǎng)液中LDH的釋放，且隨著多糖劑量的增大，效果越明顯，呈現(xiàn)一定的量效關系，與模型組相比，3 種多糖樣品組在高劑量（2 mg/mL）時均達到達到極顯著水平（P＜0.01）。粗多糖和2 種純化多糖相比，各劑量組均沒有顯著差異。與陽性對照組相比，3 種多糖樣品的中、低劑量組降低LDH釋放的水平相當，無顯著差異。但VC高劑量組降LDH的效果極顯著高于多糖樣品組（P＜0.01）。這表明仙草多糖能有效降低氧化損傷細胞的LDH釋放，對氧化損傷細胞有一定的保護作用。

2.3.5 仙草多糖對氧化損傷細胞抗氧化酶活力的影響

GSH-Px、CAT、SOD是機體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，可以有效清除機體產(chǎn)生的氧自由基，保護細胞免受自由基攻擊[23]。因此，3 種抗氧化酶活力的高低可以反映機體抗氧化能力的強弱。

GSH-Px能夠催化GSH轉(zhuǎn)化為GSSG，對防止體內(nèi)自由基引起的膜脂質(zhì)過氧化起著重要作用。仙草多糖對細胞內(nèi)GSH-Px活力影響結果如圖5所示，可以看出，模型組細胞內(nèi)GSH-Px活力降低到正常對照組的48.49%，達到極顯著水平（P＜0.01），表明氧化損傷后會大幅降低細胞GSH-Px活力。與模型組相比，3 種多糖樣品組能明顯提高GSH-Px活力，且隨著多糖質(zhì)量濃度升高，GSH-Px活力也呈上升趨勢。JMBP-A2對GSH-Px活力的提高作用最強，3 個劑量組提升作用均達到極顯著水平，JMBP-A1作用次之，在中、高劑量組能達到極顯著效果，而JMBP-C在高劑量時才能極顯著提高GSH-Px活力。說明仙草多糖可以有效提高氧化損傷細胞的GSH-Px活力，可以通過抑制膜脂質(zhì)過氧化而發(fā)揮其抗氧作用。與陽性對照VC相比，仙草多糖提高GSH-Px活力的效果稍差，VC的高劑量組能將損傷細胞的GSH-Px活力提高到正常細胞的83.60%，而JMBP-A2的高劑量組只能提高到正常細胞的71.01%。但是，仙草多糖的低劑量組提高酶活力的效果要遠高于VC，JMBP-A2的低劑量組能將GSH-Px活力提高到正常細胞的69.20%，而VC的低劑量組只能提高到正常細胞的53.59%。

圖5 仙草多糖對GSH-Px活力的影響Fig. 5 Effect of Mesona blumes polysaccharides on GSH-Px activity

SOD通過清除O2-·而發(fā)揮抗氧化作用，圖6顯示，模型組細胞內(nèi)SOD活力較正常對照組極顯著降低64.48%（P＜0.01），表明氧化損傷能降低SOD活力。與模型組相比，3 種多糖樣品組能提高SOD活性，但提升效果不如GSH-Px，且JMBP-C和JMBP-A1隨質(zhì)量濃度升高，呈現(xiàn)一定的量效關系。3 種多糖樣品中，JMBP-A1提高SOD活力能力最強，其高劑量組將SOD活力恢復到正常對照組的80.32%，極顯著高于模型組（P＜0.01），與VC高劑量組接近（正常對照組的84.37%）。表明仙草多糖能提高受損細胞中SOD活力，防止其受損后快速氧化，具有一定的保護能力。

圖6 仙草多糖對SOD活力的影響Fig. 6 Effect of Mesona blumes polysaccharides on SOD activity

CAT主要存在于能呼吸的生物體內(nèi)，如植物的葉綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、動物的肝和紅細胞中，它能分解H2O2而保護細胞免受氧化損傷。圖7是仙草多糖對細胞內(nèi)CAT活力的影響，結果顯示，氧化損傷能顯著降低CAT活力，模型組細胞內(nèi)CAT活力降低到正常對照組的42.20%，且達到極顯著水平（P＜0.01）。仙草多糖能明顯提高受損細胞內(nèi)CAT活力，與模型組比較，3 種樣品的各質(zhì)量濃度均達到極顯著水平（P＜0.01）。3 種多糖樣品中，JMBP-A1提高CAT活性能力最強，3 個劑量組均與對照組無顯著差異，其高劑量組將受損細胞的CAT活力提高了108.82%，將CAT活力恢復到正常對照組的88.14%。

圖7 仙草多糖對CAT活力的影響Fig. 7 Effect of Mesona blumes polysaccharides on CAT activity

2.3.6 仙草多糖對氧化損傷細胞MDA含量的影響

圖8 仙草多糖對MDA含量的影響Fig. 8 Effect of Mesona blumes polysaccharides on MDA content

MDA是機體自由基攻擊細胞生物膜中的不飽和脂肪酸產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，其含量與細胞氧化損傷的程度呈正相關[24]，因此，MDA作為脂質(zhì)過氧化的生物標記物之一，其含量可以間接地反映細胞受損傷程度。由圖8可知，模型組細胞MDA含量為正常對照組的1.63 倍，極顯著升高（P＜0.01），表明細胞受到氧化損傷后會大量增加MDA生成。與模型組相比，3 種多糖樣品均能有效減少MDA生成，兩種純化多糖的中、高劑量組均達到顯著水平（P＜0.05）。3 種多糖中，JMBP-A1降MDA效果最好，中劑量組使受損細胞的MDA含量降低了31.50%，與VC中劑量組效果（32.00%）接近。

3 討 論

生活水平的提高、飲食方式的變化，以及工作壓力的增大和生活環(huán)境的日益惡化，都會促使人體內(nèi)氧自由基快速增加[25-26]，不可避免地產(chǎn)生氧化損傷。目前市售的合成抗氧化劑主要用于食品、藥品的保存，包括二丁基羥基甲苯和丁基羥基茴香醚等，其對人體有一定的不良反應；因此，高效低毒的天然抗氧化劑受到越來越多關注。大量研究發(fā)現(xiàn)，天然多糖不僅能通過捕獲鏈式反應中的自由基直接阻斷自由基鏈式反應，還能對引發(fā)鏈式反應的自由基進行清除[27]，具有顯著的抗氧化活性。本實驗采用堿液浸提法從仙草中提取多糖，通過離子交換、凝膠柱層析和超濾方法對粗多糖成分進行分離純化，獲得3 種單一的多糖組分，并構建了人肝LO2細胞的H2O2損傷模型，通過細胞質(zhì)膜標記酶LDH的釋放、抗氧化酶GSH-Px、SOD、CAT的活力和脂質(zhì)過氧化物MDA的含量探討不同仙草多糖對氧化損傷細胞的保護作用。

目前，評價抗氧化活性的實驗方法主要包括動物模型法、化學檢測法和細胞模型法[6]。細胞模型能夠模擬機體內(nèi)部環(huán)境和生物行為，比傳統(tǒng)的體外化學抗氧化測定更具生物相關性，且實驗周期較短，可以有效彌補體外評價方法的不足。常用的細胞氧化損傷模型有H2O2損傷模型和過氧化脂損傷模型兩種，其中H2O2的應用最為廣泛。H2O2極易穿透細胞膜，并通過Fenton反應形成具有鐵分子的高反應性自由基，從而引起細胞正常結構和功能的損傷，是構建細胞氧化損傷模型最常用的物質(zhì)。已有大量學者利用H2O2損傷模型進行多糖抗氧化活性的研究，劉洋等[28]用H2O2誘導的氧化損傷細胞模型對黑果枸杞葉多糖LRLP3的抗氧化活性進行研究，結果表明，LRLP3能明顯提高細胞存活率，當質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，細胞相對存活率達到101.4%，與未損傷細胞存活率無顯著差異。Shan Tieying等[29]通過構建H2O2誘導的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞ESCs氧化損傷模型探討枸杞多糖LBPs的抗氧化活性，采用形態(tài)學觀察、細胞增殖測定、SOD和MDA檢測等方法，證實LBPS能夠抑制H2O2誘導的EEC細胞凋亡，并且能對ESCs細胞的氧化應激提供顯著的保護。本實驗采用H2O2對人肝LO2細胞進行氧化損傷，結果表明，細胞存活率隨H2O2濃度的增加明顯呈下降趨勢，H2O2濃度為4 mmol/L時，細胞的存活率為51%。經(jīng)2 h的H2O2處理，LDH釋放量極顯著增加到正常細胞的1.24 倍，細胞內(nèi)抗氧化酶GSH-Px、SOD和CAT活力分別降低到正常對照組的48.49%、64.48%和42.20%，且均達到極顯著水平（P＜0.01），同時，還使得脂質(zhì)過氧化物MDA含量極顯著增加到正常細胞的1.63 倍。

抗氧化機制的研究已經(jīng)深入到體內(nèi)信號通路層面，天然活性物質(zhì)作為誘導劑，能夠影響核轉(zhuǎn)錄因子與結合蛋白的結合，進而對下游抗氧化酶的表達進行調(diào)控，發(fā)揮抗氧化保護作用，Keap1-Nrf2-ARE、PI3K/Akt/eNOS等信號通路都是當前細胞氧化應激機制研究中的熱點[4]。而這些信號通路最終體現(xiàn)的結果就是生物體內(nèi)各種抗氧化酶的變化，并且體內(nèi)多余的自由基也是在這些酶的催化作用下最終還原生成對人體無害的H2O和O2[30-31]，因此GSH-Px、SOD、CAT的活性能直接反映機體抗氧化能力。此外，血清中脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA含量和LDH的漏出量也能夠間接反映細胞損傷程度。本研究采用上述建立的氧化損傷模型對不同質(zhì)量濃度仙草粗多糖JMBP-C及純化樣品JMBP-A1和JMBP-A2的抗氧化活性進行評價。結果表明，仙草多糖能顯著增加氧化損傷細胞的存活率，JMBP-A1在0.5 mg/mL質(zhì)量濃度時，細胞存活率比模型組增加49.47%，高于陽性對照。3 種多糖樣品能明顯降低上清液中LDH的泄漏量以及MDA的生成量，同時，顯著增加受損細胞內(nèi)GSH-Px、SOD和CAT 3 種抗氧化酶的活力。很多研究者認為植物多糖通過清除各種活性氧自由基，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的生成量，提高如SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，通過多種途徑發(fā)揮抗氧化作用。Jin Yue等[32]從中藥穿山龍中提取多糖（Rhizoma dioscoreaenipponicae polysaccharides，RDNP），通過H2O2對人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVECs進行氧化損傷，采用LDH活力、MDA含量、SOD活力、T-AOC和GSH-Px活力等指標對抗氧化活性進行評價，證實RDNP可以降低H2O2處理的HUVECs細胞的LDH和MDA水平，增強細胞內(nèi)SOD活力、T-AOC以及GSH-Px活力。另外，有關仙草活性的眾多報道也證實仙草提取物和仙草多糖具有抗氧化功能。楊敏[33]發(fā)現(xiàn)仙草提取物能通過提高提高大鼠肝勻漿中GSH-Px的活性，抑制MDA的生成，發(fā)揮抗氧化作用。Yeh等[34]發(fā)現(xiàn)，仙草水提物WEHT具有降血壓和提高抗氧化活性，能有效降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓及血漿和肝臟中MDA含量，并顯著增加肝臟抗氧化酶的活性，氧自由基清除能力和總谷胱甘肽水平也明顯高于對照組。Lai等[35]以碳酸氫鈉溶液提取的仙草粗多糖，對超氧自由基的清除作用和Fe2＋螯合能力優(yōu)于市售的α-生育酚和二丁基羥基甲苯，并且對MDA的形成具有一定的抑制作用。綜合現(xiàn)有關于仙草多糖抗氧化活性的報道發(fā)現(xiàn)，鮮有對純化多糖的抗氧化活性進行研究，因此，本實驗是對現(xiàn)有研究的有效補充。

多糖的結構決定了多糖的性質(zhì)和活性，多糖的化學組成、分子質(zhì)量、單糖組成、糖苷鍵構型等一級結構和高級結構都與其功能活性密切相關。有研究報道，茶葉多糖清除超氧自由基和DPPH自由基的能力與其糖醛酸含量呈正相關[36]。本實驗得到的4 種多糖樣品，JMBP-N不含有糖醛酸，沒有表現(xiàn)出明顯的抗氧化活性，JMBP-C、JMBP-A1、JMBP-A2均含有糖醛酸，都表現(xiàn)出一定的抗氧化活性。JMBP-A2糖醛酸含量最高，但在多項抗氧化指標中并沒有表現(xiàn)出最強的活性，這說明糖醛酸基團的存在與否可能是影響其抗氧化活性的重要因素，但是糖醛酸含量和活性并不是簡單的正相關。另外，比較粗多糖和純化多糖的活性發(fā)現(xiàn)，粗多糖表現(xiàn)的活性最弱，表明采用柱層析和超濾方法不僅能較好地對粗多糖進行分級純化，并且也有助于獲得生物活性更高的組分。但是，在個別指標，如降低LDH漏出量方面表現(xiàn)較好，推測可能是因為粗多糖中除多糖外，還含有黃酮等抗氧化活性物質(zhì)所致。

福建作為全國仙草種植面積最大的省份，在行業(yè)里存在加工產(chǎn)品單一，全值化、高值化利用水平低的問題。而作為仙草中含量最高的多糖，其工業(yè)化提取、純化、加工及活性研究更是仙草綜合利用過程中首先需要解決的問題。本研究證實了仙草多糖對氧化損傷細胞具有良好的保護作用，是一種具有很大開發(fā)潛力的天然抗氧化功能因子，因此，后續(xù)應進一步完善制備工藝，并深入探討其抗氧化作用機制。