林 楊，楊 平，張 琦，郎宇曦，鄧皓天，孟憲軍,*

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.沈陽師范大學(xué)糧食學(xué)院，遼寧 沈陽 110034）

炎癥性腸病包括克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎兩種形式，是一種與腸道免疫相關(guān)的在結(jié)腸和直腸反復(fù)發(fā)作的炎癥性疾病[1]。在過去幾十年，炎癥性腸病在西方發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率很高，近年來，炎癥性腸病的發(fā)病率在發(fā)展中國家迅速增加，已經(jīng)發(fā)展成為一種全球性疾病[2]。炎癥性腸病是結(jié)腸癌的最主要誘因，炎癥性腸病患者的結(jié)腸癌發(fā)病率高達(dá)非炎癥性腸病患者的3 倍[3]。研究表明，包括白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor α，TNF-α）、IL-1β在內(nèi)的炎癥因子通過調(diào)控腸道上皮細(xì)胞的增殖、分化及存活而影響癌癥的發(fā)生[4]，而這一過程的發(fā)生與由腸道上皮細(xì)胞中活性氧失衡引起的氧化應(yīng)激密切相關(guān)[5]。目前，臨床通過手術(shù)切除結(jié)腸及服用一些抗炎或免疫調(diào)節(jié)藥物來治療炎癥性腸病，然而這些藥物因為有很強的副作用而不適合長期服用。因此，尋求一種副作用小且安全、有效、健康、綠色的天然替代品對于炎癥性腸病及其相關(guān)結(jié)直腸癌的防治具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，黑果枸杞花色苷提取物[2]、蜂花粉多酚提取物[1]、霉菌胞外多糖提取物[6]、石榴提取物[7]等天然產(chǎn)物可以通過抑制炎癥因子，調(diào)控細(xì)胞增殖、分化明顯的改善炎癥性腸病及其相關(guān)結(jié)直腸癌。

藍(lán)莓是杜鵑花科（Ericeceae）越橘屬（Vaccinium spp.）植物，因其富含生物活性化合物且具有很強的抗氧化能力而受到廣大消費者青睞[8]，其主要活性化合物為花色苷。近年來，已有文獻(xiàn)報道來源于其他植物的花色苷提取物具有抗腫瘤[9]、抗癌[10]、清除體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)生的自由基[11]及改善腸道健康[12]的功效?；ㄉ找呀?jīng)在一些歐盟國家、澳大利亞及新西蘭被批準(zhǔn)作為‘E163’食品添加劑使用[13]?？寡趸芰?shù)據(jù)庫（http://oracdatabase.com）的數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，每克藍(lán)莓提取物的氧化自由基吸收能力為234.7 μmol（以Trolox計，下同），明顯高于葡萄（5.18 μmol/g）、歐洲越橘（56.48 μmol/g）、石榴（188.00 μmol/g）等漿果提取物，研究表明該類漿果中的抗氧化能力主要源自于花色苷[14]。控制炎癥是預(yù)防和治療癌癥的有效手段，國內(nèi)外對于藍(lán)莓花色苷提取物的研究主要集中在提取[15]、純化[16]及穩(wěn)定性[17]方面。而就藍(lán)莓花色苷提取物對炎癥、結(jié)腸癌的防治作用及機制方面鮮有報道。本實驗采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥模型及結(jié)腸癌細(xì)胞模型，研究藍(lán)莓花色苷提取物對炎癥及結(jié)腸癌的功效，探討其可能的機制，為藍(lán)莓花色苷提取物預(yù)防炎癥性腸病及其結(jié)腸癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓鮮果采購于遼寧省大連市的有機藍(lán)莓基地，冷鏈運回沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)漿果中心實驗室，于-80 ℃冰箱凍存至制備提取物。

鹽酸（分析純）、甲醇（分析純）、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純） 國藥集團化學(xué)試劑公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、噻唑藍(lán)（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）、LPS 美國Sigma公司；MEM、DMEM培養(yǎng)基 美國HyClone公司；青霉素 美國通用電氣醫(yī)療集團；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國生命技術(shù)公司；對氨基苯甲酸、磷酸、N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽 北京鼎國生物試劑有限公司；IL-6、TNF-α試劑盒 美國BioLegend公司；鼠抗GAPDH單克隆抗體、兔抗一氧化氮合酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）單克隆抗體、鼠抗環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）單克隆抗體、鼠抗細(xì)胞周期蛋白-2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）單克隆抗體、兔抗p53單克隆抗體 美國Proteintech公司。

1.2 儀器與設(shè)備

攪拌機 美的集團；電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SB25-12DTN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份公司；1100高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器）、1100質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；CKX41倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司；SANYAOM10-11AL CO2型恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本ANTYO公司；酶標(biāo)儀、C-Digit WB顯影儀 美國LI-COR Bioscience 公司；FLUOstar OPTIMA熒光酶標(biāo)儀 德國BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓花色苷制備及含量測定

藍(lán)莓果實暗條件下自然解凍后、勻漿，按照前期的方法進(jìn)行藍(lán)莓提取物的制備[18]。將藍(lán)莓果實與體積分?jǐn)?shù)0.1%鹽酸酸化甲醇按照料液比1∶10混合，40 ℃超聲波輔助浸提60 min；真空抽濾，并重復(fù)浸提至提取液無色；合并濾液，并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40 ℃條件下濃縮至無甲醇?xì)埩簟＜兓梢匀コ{(lán)莓提取物中除花色苷外的糖類、有機酸類、果膠及弱極性的黃酮類物質(zhì)[19]。本實驗將填裝有X-AD7大孔樹脂的400 mL玻璃柱置于層析柜中，溫度設(shè)定為4 ℃，蒸餾水沖洗樹脂中的雜質(zhì)，用恒流泵以2 BV/h的流速注入提取物，靜置，吸附過夜。用去離子水將水溶性物質(zhì)洗脫后，用無水乙醇洗脫，流速為2 BV/h。收集并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)乙醇洗脫液至無醇味，將濃縮液冷凍干燥。將藍(lán)莓提取物凍干粉至于-80 ℃超低溫冰箱，凍存?zhèn)溆?。參照前期研究，采用pH示差法測定藍(lán)莓提取物中花色苷含量[18]。

1.3.2 高效液相色譜-電噴霧二級質(zhì)譜聯(lián)用分析

樣品準(zhǔn)備：準(zhǔn)確稱量5 mg藍(lán)莓提取物凍干粉，并溶解于2 mL色譜純甲醇溶液，用0.22 μm濾膜過濾，待測。

高效液相色譜-電噴霧二級質(zhì)譜檢測條件：分離柱：Dikma Platisil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.7 mL/min；流動相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，B為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～10 min，85% A；10～55 min，85%～35% A；55～67 min，35%～85% A。在正離子模式下進(jìn)行全自動二級質(zhì)譜掃描，掃描范圍為m/z 150～1 500；毛細(xì)管電壓為3 500 V；霧化氣體為氮氣；霧化氣壓力為40 psi；干燥氣流速為12 L/min。使用矢車菊素-3-葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)二極管陣列檢測器檢測到的峰面積建立峰面積與物質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算藍(lán)莓花色苷中各單體的含量。

1.3.3 DPPH自由基清除能力測定

稱取2 mg的DPPH粉末溶于50 mL甲醇溶液中，得到DPPH工作液。取兩塊96 孔板A和B，將100 μL樣品和空白溶液分別加入兩塊96 孔板，在A板中加入100 μL DPPH工作液，在B板中加入100 μL甲醇溶液。避光反應(yīng)30 min后，在517 nm波長處用酶標(biāo)儀對板A和B進(jìn)行讀數(shù)，并按下式計算DPPH自由基清除率。

式中：A1為樣品與DPPH工作液反應(yīng)的吸光度；A1’為樣品與甲醇溶液反應(yīng)的吸光度；A0為空白溶液與DPPH工作液反應(yīng)的吸光度；A0’為空白溶液與甲醇溶液反應(yīng)的吸光度。

1.3.4 藍(lán)莓提取物對細(xì)胞炎癥的作用

1.3.4.1 RAW 264.7細(xì)胞系培養(yǎng)

將RAW 264.7細(xì)胞置于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、1%青霉素）中，于培養(yǎng)箱中37 ℃、飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng)。每2 d進(jìn)行換液、傳代，實驗用細(xì)胞為2～15 代。

1.3.4.2 RAW 264.7細(xì)胞存活率及NO釋放能力的測定

在96 孔板中加入200 μL混合均勻的細(xì)胞懸液，使細(xì)胞濃度達(dá)2×104個/孔，過夜培養(yǎng)后，移去培養(yǎng)基并加入200 μL LPS和藍(lán)莓提取物溶液。實驗分組包括：空白對照組、LPS（1 μg/mL）組、LPS（1 μg/mL）＋不同質(zhì)量濃度（50、100、200、400、600、800 μg/mL）藍(lán)莓提取物組，空白對照組只加入完全培養(yǎng)基。每組設(shè)置4 個復(fù)孔，重復(fù)3 次，在相同條件下培養(yǎng)24 h。收集培養(yǎng)液用于NO測定，再在每孔中加入100 μL MTT儲存液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使用酶標(biāo)儀在490 nm波長處讀數(shù)。計算對照組細(xì)胞的存活率。

采用Griess方法測定收集的培養(yǎng)基上清液中NO含量[20]。即將培養(yǎng)基上清液與Griess試劑等體積混合，反應(yīng)5 min后，于550 nm波長處測OD值。根據(jù)NaNO2標(biāo)準(zhǔn)曲線計算培養(yǎng)基上清液中NO含量。

1.3.4.3 細(xì)胞因子IL-6、TNF-α分泌水平測定

在6 孔板中加入2 mL混合均勻的細(xì)胞懸液，接種密度為2×105細(xì)胞/孔，并分組處理培養(yǎng)24 h。分為空白對照組（細(xì)胞生長培養(yǎng)基）、LPS組（1 μg/mL）、LPS（1 μg/mL）＋400 μg/mL花色苷提取物組和LPS（1 μg/mL）＋600 μg/mL花色苷提取物組。于冰上收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，按照酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒說明書的步驟測定細(xì)胞因子IL-6、TNF-α的含量。

1.3.4.4 RAW264.7細(xì)胞中iNOS、COX-2表達(dá)測定

將1.3.4.3節(jié)中所述細(xì)胞于冰上收集上清液后，加入100 μL RIPA裂解液提取細(xì)胞核蛋白。用Bradford法測定蛋白含量，計算上樣體積。每孔上樣15 μg蛋白，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳以200 V恒壓、400 mA恒定電流分離樣品，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST清洗后，加入一抗iNOS（1∶1 000）、COX-2（1∶2 000），4 ℃封閉過夜，TBST清洗后，加入稀釋5 000 倍的二抗室溫孵育1.5 h，TBST再次清洗，曝光顯影后拍照。

1.3.5 藍(lán)莓提取物對結(jié)腸癌的作用

1.3.5.1 HCT-116細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116細(xì)胞用含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS、1%青霉素的MEM培養(yǎng)基在37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗用細(xì)胞為2～15 代。

1.3.5.2 MTT法檢測細(xì)胞生存能力

在96 孔板中加入200 μL混合均勻的HCT-116細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞濃度為5×103個/孔，過夜培養(yǎng)，移去培養(yǎng)基后加入不同質(zhì)量濃度（0、50、100、200 μg/mL）的藍(lán)莓花色苷提取物分組培養(yǎng)24、48、72 h。按照1.3.4.2節(jié)中的方法檢測并計算細(xì)胞存活率。

1.3.5.3 HCT-116細(xì)胞中CDK2、p53蛋白表達(dá)測定

在6 孔板中加入2 mL混合均勻的HCT-116細(xì)胞懸液，接種密度為2×104個細(xì)胞/孔，過夜培養(yǎng)后，分別加入50、100、200 μg/mL藍(lán)莓提取物以及添加細(xì)胞生長培養(yǎng)基作空白對照組，培養(yǎng)48 h后，參照1.3.4.3節(jié)的方法收集蛋白并測定含量，Western blot檢測HCT-116細(xì)胞中CDK2、p53的表達(dá)水平。其中，CDK2一抗、p53一抗均按1∶1 000稀釋。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓提取物花色苷含量及組成鑒定結(jié)果

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品（a）和藍(lán)莓提取物（b）中花色苷高效液相色譜圖Fig. 1 HPLC profiles of standards (a) and anthocyanins (b) from BE

藍(lán)莓提取物總花色苷含量為312.75 mg/g（以矢車菊素3-葡萄糖苷質(zhì)量計，下同），高于文獻(xiàn)中報道的黑米、葡萄、紫薯等其他富含花色苷的植物提取物中花色苷含量[21]。Hwang等[22]使用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液提取制備的藍(lán)莓提取物花色苷含量僅為11.8 mg/g。藍(lán)莓提取物總花色苷含量測定結(jié)果說明本實驗的提取、純化方法能夠有效地提取、富集花色苷。圖1為藍(lán)莓提取物花色苷組成色譜圖，共有12 個峰。參考文獻(xiàn)和MS數(shù)據(jù)（表1）可知：色譜峰1與色譜峰2有相同的分子離子峰（m/z465）和碎片峰（m/z303），Primetta等[23]報道了飛燕草素-3-半乳糖苷優(yōu)先于飛燕草素-3-葡萄糖苷洗脫，因此判斷色譜峰1為飛燕草素-3-半乳糖苷，色譜峰2為飛燕草素-3-葡萄糖苷；同理，判斷色譜峰3和色譜峰5分別為矢車菊素3-半乳糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷，判斷色譜峰8和色譜峰10分別為芍藥色素-3-半乳糖苷和芍藥色素3-葡萄糖苷；色譜峰4和色譜峰7有離子峰（m/z435）、（m/z419）和分子離子峰（m/z303）、（m/z287），而碎片峰（M＋-132）代表分子離子峰缺少一個阿拉伯糖，因此色譜峰4為飛燕草素-3-阿拉伯糖苷，同理，判斷色譜峰7、9、12分別為矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、牽?；ㄉ?3-阿拉伯糖苷和錦葵色素-3-阿拉伯糖苷；另外，質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，在28.6 min，除了芍藥色素-3-半乳糖苷，還有錦葵色素-3-半乳糖苷出現(xiàn)，而在液相色譜圖中只有色譜峰10出現(xiàn)，因此推測二者為共同洗脫，同理推測色譜峰11為芍藥色素-3-葡萄糖苷和錦葵色素-3-葡萄糖苷的共同洗脫峰。這與文獻(xiàn)報道的在藍(lán)莓、藍(lán)靛果等漿果的花色苷組成分析中出現(xiàn)共同洗脫現(xiàn)象相似[24]。根據(jù)表1對液相色譜圖的峰面積統(tǒng)計可得：該藍(lán)莓提取物中質(zhì)量濃度最高的4 種花色苷為：飛燕草素-3-半乳糖苷（51.66 μg/mL）、飛燕草素-3-阿拉伯糖苷（34.33 μg/mL）、飛燕草素-3-葡萄糖苷（27.21 μg/mL）、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷（28.08 μg/mL）。飛燕草素家族花色苷廣泛存在于果蔬中，已經(jīng)被證明能夠通過抗氧化作用抑制腫瘤的發(fā)生、遷移[25]，藍(lán)莓提取物中飛燕草素家族花色苷在總花色苷組成中占很大比例，因此推測藍(lán)莓提取物具有抑制炎癥、抗癌的作用。

表1 藍(lán)莓花色苷提取物中花色苷組成鑒定Table 1 Identification of anthocyanins in BE

2.2 藍(lán)莓提取物DPPH自由基清除能力

人體內(nèi)代謝產(chǎn)生的自由基和活性氧可以引起細(xì)胞膜脂質(zhì)、細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA和酶的損傷，而具有抗氧化能力的活性物質(zhì)能夠有效清除這些自由基和活性氧[26]。本實驗通過對DPPH自由基清除能力的測定來分析藍(lán)莓提取物的抗氧化能力。

圖2 不同質(zhì)量濃度藍(lán)莓提取物對DPPH自由基清除率Fig. 2 DPPH radical scavenging capacity of BE at different concentrations

由圖2可知，藍(lán)莓提取物有很好的DPPH自由基清除能力，且隨著質(zhì)量濃度增加而顯著升高（P＜0.05），在質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，藍(lán)莓提取物的DPPH自由基清除率高達(dá)（93.38±3.84）%。藍(lán)莓提取物DPPH自由基清除率的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為42.00 μg/mL，比多種黑醋栗（56.19～61.17 μg/mL）[27]和枸杞（784～1 254 μg/mL）[28]DPPH自由基清除率的IC50低，說明其抗氧化性更高。

2.3 藍(lán)莓提取物對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞炎癥的作用

2.3.1 藍(lán)莓提取物對RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的影響

腸道發(fā)生炎癥時，LPS的生成量會隨革蘭氏陰性菌數(shù)量而增加，影響炎癥性腸病的發(fā)生發(fā)展，炎癥和腫瘤有著十分緊密的聯(lián)系，長期的炎癥是腫瘤發(fā)展的主要誘因，通過LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥也是常見的炎癥研究模型[29]。NO與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，是炎癥發(fā)病機制中的重要信使[30]。

圖3 藍(lán)莓提取物對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的影響Fig. 3 Effect of BE on LPS-induced NO production in RAW 264.7 cells

由圖3可知，與空白對照組相比，LPS組RAW 264.7細(xì)胞NO釋放水平顯著升高（P＜0.05）。藍(lán)莓提取物質(zhì)量濃度不高于100 μg/mL的處理對LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞NO釋放水平無顯著影響（P＞0.05），而質(zhì)量濃度范圍為200～800 μg/mL的藍(lán)莓提取物顯著降低了LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放水平（P＜0.05），且藍(lán)莓提取物對LPS誘導(dǎo)264.7細(xì)胞NO釋放水平隨質(zhì)量濃度增加而增加，說明藍(lán)莓提取物具有抗炎作用。

2.3.2 藍(lán)莓提取物對RAW 264.7細(xì)胞增殖的影響

圖4 藍(lán)莓提取物抑制RAW 264.7細(xì)胞增殖的作用Fig. 4 Effect of BE on the proliferation of RAW 264.7 cells

腸道慢性炎癥是結(jié)直腸癌發(fā)病的一個主要誘因[31]。如圖4所示，與空白對照組相比，經(jīng)過1 μg/mL LPS處理24 h后，RAW 264.7細(xì)胞增殖率顯著升高（P＜0.05），說明建模成功，LPS成功誘導(dǎo)了RAW 264.7細(xì)胞炎癥。與LPS組相比，50、100、200、400 μg/mL藍(lán)莓果實提取物處理組RAW 264.7細(xì)胞增殖率無顯著差異；而經(jīng)過24 h處理后，600、800 μg/mL藍(lán)莓提取物對RAW 264.7的抑制率分別增加至4.32%和41.94%，均顯著低于空白對照組和LPS組，因此選擇質(zhì)量濃度為400 μg/mL和600 μg/mL的藍(lán)莓提取物溶液處理RAW 264.7細(xì)胞以進(jìn)行炎癥因子調(diào)節(jié)作用的研究。

2.3.3 藍(lán)莓提取物對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞中IL-6和TNF-α分泌的影響

圖5 藍(lán)莓提取物對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-6（A）、TNF-α（B）的影響Fig. 5 Effect of BE on LPS-induced secretion of IL-6 (A) and TNF-α (B)in RAW 264.7 cells

細(xì)胞中促炎因子分泌的增加可加速炎癥的發(fā)展[32]。由圖5可知，LPS組中IL-6、TNF-α的水平顯著高于空白對照組（P＜0.05），而400、600 μg/mL的藍(lán)莓花色苷提取物顯著降低了LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中IL-6、TNF-α的分泌水平（P＜0.05）。與LPS組比，600 μg/mL藍(lán)莓提取物處理使得LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞中IL-6、TNF-α分泌分別下降了80.0%和66.21%。實驗結(jié)果表明，藍(lán)莓提取物能夠通過下調(diào)RAW 264.7細(xì)胞炎癥因子的分泌從而抑制炎癥。

2.3.4 藍(lán)莓提取物對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞iNOS和COX-2表達(dá)的影響

如圖6所示，藍(lán)莓提取物能夠有效抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞模型中COX-2的表達(dá)，且抑制效果隨質(zhì)量濃度增加而增加。在空白對照組中未檢測到COX-2蛋白的表達(dá)，與LPS組相比，400、600 μg/mL藍(lán)莓提取物處理后，COX-2的蛋白表達(dá)量下降至LPS組的89.7%和39.74%。研究表明，非甾體類抗炎藥可以有效地抑制COX-2蛋白表達(dá)[33]，并且通過抗IL-6抗體阻斷IL-6的分泌可以減緩潰瘍性結(jié)腸炎患者的炎癥[34]。相似的，本實驗發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花色苷對COX-2蛋白的表達(dá)具有抑制作用。

圖6 藍(lán)莓提取物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞COX-2蛋白表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of BE on LPS-induced expression of COX-2 in RAW 264.7 cells

圖7 藍(lán)莓提取物對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞iNOS蛋白表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of BE on LPS-induced expression of iNOS in RAW 264.7 cells

如圖7所示，LPS組中iNOS表達(dá)量高于空白對照組，藍(lán)莓提取物有效地降低了iNOS蛋白表達(dá)量，且600 μg/mL藍(lán)莓提取物處理后，iNOS的表達(dá)量顯著低于空白對照組。Serra等[35]發(fā)現(xiàn)矢車菊素-3-葡萄糖苷通過抑制NO、PGE2、IL-8的產(chǎn)生及iNOS、COX-2的表達(dá)降低HT-29細(xì)胞中促炎因子的水平。本實驗結(jié)果進(jìn)一步證實了藍(lán)莓提取物可以調(diào)控NO的釋放以及炎癥因子IL-6、TNF-α和iNOS、COX-2的表達(dá)，對炎癥產(chǎn)生具有抑制作用。

2.4 藍(lán)莓提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞的作用

2.4.1 藍(lán)莓提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

如圖8所示，藍(lán)莓提取物明顯抑制了HCT-116細(xì)胞的增殖，不同質(zhì)量濃度藍(lán)莓提取物處理相同時間后HCT-116細(xì)胞增殖率顯著減?。≒＜0.05），說明藍(lán)莓提取物對HCT-116細(xì)胞的增殖作用具有劑量依賴性。藍(lán)莓提取物處理24、48 h和72 h后，HCT-116結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50分別為196.86、191.52 μg/mL和153.36 μg/mL，其IC50隨時間延長而減小，具有時間依賴性。藍(lán)莓提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用歸因于其中的花色苷、黃酮、多酚類化合物，這些化合物已經(jīng)被證實對結(jié)腸癌有很強的抗增殖效果[10]。

圖8 藍(lán)莓提取物對HCT-116細(xì)胞增殖的影響Fig. 8 Effect of BE on the proliferation of HCT-116 cells

2.4.2 藍(lán)莓提取物對結(jié)腸癌細(xì)胞CDK2和p53蛋白表達(dá)的影響

誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯是控制癌癥發(fā)展的有效策略[36]，細(xì)胞周期激酶（cyclin dependent kinases，CDKs）的表達(dá)水平可以很大程度影響細(xì)胞周期。作為細(xì)胞G1期的重要調(diào)節(jié)因子，CDK2被認(rèn)為是化學(xué)手段預(yù)防治療癌癥的重要靶點[37]。

圖9 藍(lán)莓提取物對HCT-116細(xì)胞中CDK2蛋白表達(dá)的影響Fig. 9 Effect of BE on the expression of CDK2 in HCT-116 cells

如圖9所示，藍(lán)莓提取物可以顯著降低HCT-116細(xì)胞中CDK2蛋白的表達(dá)量（P＜0.05），50、100 μg/mL和200 μg/mL的藍(lán)莓花色苷提取物處理48 h后，CDK2蛋白的表達(dá)水平分別下降至對照組的58.55%、52.83%和40.66%。研究表明，CDK2參與多個通路的調(diào)控，在腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[38-39]。

誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是預(yù)防與治療癌癥的另一有效手段[40]。腫瘤抑制因子p53能夠抑制異常細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)其凋亡[41]。實驗結(jié)果如圖10所示，與空白對照組相比，藍(lán)莓提取物處理顯著上調(diào)了細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p53的表達(dá)水平（P＜0.05）。隨著藍(lán)莓提取物質(zhì)量濃度的增加，p53蛋白的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）。使用200 μg/mL藍(lán)莓提取物處理后，p53蛋白的表達(dá)水平是空白對照組的2.69 倍。結(jié)果表明藍(lán)莓提取物對p53蛋白的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用。這與León-González等[25]的研究結(jié)果相似，黑醋栗花色苷提取物處理急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞，能夠抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)p53蛋白的激活并下調(diào)細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。Srivastava等[42]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花色苷提取物能夠通過增加DNA的片段化及Caspase-3的活性誘導(dǎo)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡；體內(nèi)、體外研究說明幾種花色苷單體對HCT-116和HT-29細(xì)胞無抑制作用，全食品具有協(xié)同作用，其對癌細(xì)胞的效果優(yōu)于幾種花色苷或酚類化合物單體的效果[21]。

圖10 藍(lán)莓提取物對HCT-116細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)的影響Fig. 10 Effect of BE on the expression of p53 in HCT-116 cells

3 結(jié) 論

本實驗通過高效液相色譜-電噴霧二級質(zhì)譜技術(shù)測定了藍(lán)莓提取物的花色苷組成，并通過測定DPPH自由基清除能力發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓提取物有很強的抗氧化能力；同時，構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)RAW.264.7細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓提取物可以通過抑制NO釋放，下調(diào)炎癥因子IL-6、TNF-α的水平，降低iNOS、COX-2蛋白表達(dá)來抑制炎癥；通過結(jié)腸癌細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花色苷提取物能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，調(diào)控CDK2和p53蛋白的表達(dá)。因此，藍(lán)莓提取物能夠顯著地抑制炎癥及結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，并且對與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，這為藍(lán)莓提取物在炎癥性腸病及相關(guān)結(jié)直腸癌的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。