耿春陽，林戀竹*，趙謀明，朱啟源

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510641）

當(dāng)今社會，隨著人口的增長和人均壽命的延長，老齡化已成為一個亟待解決的全球性問題。衰老是一種漸進(jìn)的生理功能障礙過程，涉及多個組織和器官[1]?；钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)的氧化損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老的主要原因之一[2]。研究表明，葉瓜參多肽可以延長果蠅壽命，提高衰老小鼠體內(nèi)抗氧化酶系活力、抑制脂質(zhì)過氧化[3]；姬松茸多肽組分能提高衰老小鼠血清過氧化氫酶活力，下調(diào)血清ROS含量及丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平[4]。從膳食中篩選富肽功能性因子用于抗衰老食品研制已經(jīng)成為研究趨勢。

辣木（Moringa oleifera）是辣木科、辣木屬的多年生木本植物，分布廣泛且資源量十分豐富[5]。辣木葉和辣木籽蛋白質(zhì)含量豐富（質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為25.0%～30.3%、29.4%～38.3%）[6-7]，研究發(fā)現(xiàn)，辣木葉蛋白和辣木籽蛋白中必需氨基酸間的比例與人體所需較為接近，必需氨基酸占氨基酸總量的比例高于世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織推薦值[8-9]，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源。但有報道指出，辣木葉中抗?fàn)I養(yǎng)因子會影響辣木葉蛋白質(zhì)的吸收和利用[10-11]，所以將辣木葉蛋白質(zhì)水解為利于人體消化吸收的多肽就顯得尤為必要。目前對辣木籽的研究主要集中在辣木籽油[12-13]、辣木籽多酚[14]的提取分離技術(shù)方面，但對辣木籽多肽的研究則相對較少。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，以抗氧化活性為導(dǎo)向定向制備的辣木葉、辣木籽多肽組分經(jīng)模擬胃腸道消化后，生成了抗氧化活性更強(qiáng)的小分子肽[15-16]，表明辣木源多肽組分可作為潛在的膳食干預(yù)劑用于功能性食品加工，但其在動物體內(nèi)拮抗氧化應(yīng)激作用還未得到證實。

本實驗采用酶法、乙醇分級沉淀法制備辣木葉多肽組分（MOL-P）、辣木籽多肽組分（MOS-P），構(gòu)建D-半乳糖致衰小鼠模型，考察MOL-P和MOS-P在高、低兩個劑量下連續(xù)灌胃小鼠8 周，對衰老小鼠體質(zhì)量，肝臟和腦的臟器系數(shù)，血清、肝臟和腦的抗氧化酶活力以及MDA水平的影響，并采用蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色觀察MOL-P和MOS-P對氧化損傷小鼠肝臟的保護(hù)作用。本研究對于以辣木源多肽為核心的功能性因子的抗衰老食品的研制具有理論和方法的參考意義，同時對促進(jìn)我國辣木精深加工產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有一定的科學(xué)價值和意義。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級雄性昆明小鼠，購于廣東省實驗動物中心，使用許可證號：SYXK（粵）2011-0112。

辣木葉、辣木籽 廣東華谷辣木生物科技有限公司；NS37071蛋白酶 丹麥諾維信公司；總蛋白定量測定試劑盒（二喹啉甲酸法）、MDA、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試盒 南京建成生物工程研究所。其他試劑均為分析純，購于富宇化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Sorvall ST16R高速冷凍離心機(jī)、Varioskan Flash全波長掃描多功能讀數(shù)儀 美國Thermo Scientific公司；Alpha 1-4 LD冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司；UV-754N紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；T10 Basic ULTRA TURRAX高速分散機(jī) 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木源多肽組分的制備

參考本團(tuán)隊前期采用酶法、乙醇分級沉淀法制備辣木葉多肽組分與辣木籽多肽組分的方法[15-16]。

1.3.2 動物分組及處理

將健康的昆明小鼠隨機(jī)分成6 組：正常組、模型組、MOL-P低劑量組、MOL-P高劑量組、MOS-P低劑量組和MOS-P高劑量組，每組12 只。于每日上午9點(diǎn)，除正常組外其余各組頸背部皮下注射D-半乳糖100 mg/（kgmb·d）；辣木源多肽劑低、高劑量組的灌胃量分別為200 mg/（kgmb·d）和500 mg/（kgmb·d），正常組頸背部皮下注射和灌胃給予等量的生理鹽水。每天進(jìn)行注射及灌胃樣品，持續(xù)8 周。

1.3.3 檢測樣品的采集

最后一次灌胃后，小鼠禁食12 h，自由飲水。第二天摘眼球取血（血液取出后室溫靜置2 h使其凝固，然后在4 ℃、2 000×g條件下離心10 min，取上清液，即為血清），斷頸處死后，于冰上摘取小鼠肝臟和腦組織，并剔去周圍結(jié)締組織。

1.3.4 臟器系數(shù)的測定

肝臟和腦組織于4 ℃生理鹽水中洗去附著血液，用濾紙吸干水分，稱質(zhì)量，按下式計算臟器系數(shù)。

1.3.5 生化指標(biāo)的測定

按照試劑盒說明書的要求制備肝臟和腦組織勻漿液，測定血清、肝臟和腦組織的SOD、GSH-Px活力及MDA水平。

1.3.6 肝臟組織切片HE染色

取小鼠肝臟組織，于組織固定液中固定，制片過程由南京建成生物工程研究所完成。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示，由Microsoft Excel 2016軟件處理完成；使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性分析，P＜0.05為組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木源多肽組分對D-半乳糖致衰小鼠體質(zhì)量的影響

通過連續(xù)注射一定劑量的D-半乳糖來模擬自然衰老過程是目前研究氧化應(yīng)激所致衰老最常用的方法[17]。在眾多關(guān)于衰老機(jī)制的學(xué)說中，自由基學(xué)說是被接受度最高的一種，其認(rèn)為氧化應(yīng)激會導(dǎo)致ROS水平增加，而后者在機(jī)體衰老的過程中起重要作用[18]。持續(xù)注射D-半乳糖后，其在細(xì)胞內(nèi)被催化成不可降解的半乳糖醇，后者在細(xì)胞中累積并誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS[19]。

如圖1所示，相比于正常組，小鼠在注射D-半乳糖后出現(xiàn)體質(zhì)量減輕的情況，尤其以模型組小鼠體質(zhì)量最低；研究表明，在D-半乳糖致衰小鼠模型中，模型組小鼠的體質(zhì)量明顯低于正常組[20-22]，這與本實驗結(jié)果相符。與模型組相比，高、低劑量辣木源多肽組分均能在一定程度上改善小鼠體質(zhì)量下降的情況，其中效果最顯著的是高劑量MOL-P，從第6周開始，該組小鼠體質(zhì)量已恢復(fù)至正常組水平。辣木源多肽組分沒有毒副作用，且可作為改善D-半乳糖致衰小鼠氧化損傷潛在的膳食干預(yù)劑。

圖1 辣木源多肽組分對D-半乳糖致衰小鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 Effects of MOL-P and MOS-P on body mass of D-galactose-induced aging mice

2.2 辣木源多肽組分對D-半乳糖致衰小鼠臟器系數(shù)的影響

臟器系數(shù)能夠反映器官或組織結(jié)構(gòu)的變化，從而可以間接地反映器官或組織功能的變化[20]。研究表明，線粒體通過電子傳遞鏈產(chǎn)生ATP，這個過程是ROS的重要來源，而肝臟是新陳代謝的重要場所，線粒體含量豐富，是最易受ROS攻擊的器官[23]；腦組織氧消耗最高，富含多聚不飽和脂肪酸而抗氧化酶活性較低，易受氧自由基的攻擊[24]。

表1 辣木源多肽組分對D-半乳糖致衰小鼠臟器系數(shù)的影響Table 1 Effects of MOL-P and MOS-P on organ indices of D-galactose-induced aging mice

如表1所示，模型組的肝臟系數(shù)和腦系數(shù)均顯著低于正常組（P＜0.05），可以推斷模型組在注射D-半乳糖后，其肝臟和腦組織已受到一定程度的氧化損傷。與模型組相比，高、低劑量辣木源多肽組分對小鼠肝臟系數(shù)的提升作用均不顯著（P＞0.05）；而高、低劑量辣木源多肽組分均能顯著提高小鼠腦系數(shù)（P＜0.05）；辣木源多肽組分各劑量組小鼠腦系數(shù)與正常組無顯著性差異（P＞0.05），表明辣木源多肽組分可顯著改善小鼠腦組織氧化損傷，起到延緩衰老的作用。

2.3 辣木源多肽組分對D-半乳糖致衰小鼠血清、肝臟GSH-Px活力的影響

GSH-Px是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中的一種重要的酶[25]，其主要生物學(xué)作用是保護(hù)細(xì)胞免受超氧化物毒害，在機(jī)體內(nèi)H2O2的分解和內(nèi)源性過氧化物的代謝中起關(guān)鍵作用[26]。

表2 辣木源多肽組分對D-半乳糖致衰小鼠血清、肝臟GSH-Px活力的影響Table 2 Effects of MOL-P and MOS-P on GSH-Px activities in serum and liver of D-galactose-induced aging mice

由表2可知，模型組血清和肝臟GSH-Px活力顯著低于正常組（P＜0.05），研究表明，持續(xù)注射D-半乳糖會誘發(fā)一系列氧化還原變化，包括GSH-Px活力的降低[27]，這與本實驗結(jié)果相符。對于小鼠血清GSH-Px活力：與模型組相比，辣木源多肽組分各劑量組均能顯著提高衰老小鼠血清GSH-Px活力（P＜0.05），其中MOL-P低劑量組和MOS-P高劑量組的血清GSH-Px活力較模型組分別提高了35.80%和36.97%；值得注意的是，MOL-P低劑量組和MOS-P高劑量組的血清GSH-Px活力均顯著高于正常組（P＜0.05），MOL-P高劑量組的血清GSH-Px活力也達(dá)到了正常組水平（P＞0.05），這表明辣木源多肽組分能有效提高衰老小鼠血清GSH-Px活力，提高血清抗氧化水平。研究表明，葉瓜參多肽能顯著提升小鼠血清GSH-Px活力，較模型組提高了32.32%[3]；Sun Yangying等[28]研究發(fā)現(xiàn)，雞胸肉蛋白水解物能夠提高衰老大鼠血清GSH-Px活力，較模型組提高了30.89%，這表明低劑量MOL-P和高劑量MOS-P在提高小鼠血清抗氧化性方面優(yōu)勢明顯，即辣木源多肽組分能有效維護(hù)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，是良好的膳食干預(yù)劑，可用于抗衰老食品的研制。對于小鼠肝臟GSH-Px活力：MOL-P低劑量組、MOS-P低劑量組和MOS-P高劑量組肝臟GSH-Px活力高于模型組，但無顯著性差異（P＞0.05），表明辣木源多肽組分在提高衰老小鼠肝臟GSH-Px活力方面效果不明顯。此外，依據(jù)試劑盒說明書要求，本研究未能檢出小鼠腦組織GSH-Px活力。

2.4 辣木源多肽組分對D-半乳糖致衰小鼠血清、肝臟和腦組織SOD活力的影響

在機(jī)體內(nèi)，SOD能夠清除超氧陰離子自由基，避免其對細(xì)胞造成損傷，在拮抗氧化應(yīng)激中起著十分重要的作用[29]。根據(jù)表3可知，模型組血清、腦SOD活力雖低于正常組，但是差異不顯著（P＞0.05），同時辣木源多肽組分各劑量組與模型組相比，血清、腦SOD活力差異同樣不顯著（P＞0.05），故推測，辣木源多肽組分對小鼠血清和腦組織SOD活力的調(diào)控作用效果不明顯。對于肝臟SOD活力：與模型組相比，辣木源多肽組分能顯著提高衰老小鼠肝臟SOD活力（P＜0.05），其中MOL-P高、低劑量組肝臟SOD活力較模型組分別提高了12.53%和21.47%，而MOS-P高、低劑量組則較模型組分別提高了26.08%和34.20%；此外MOL-P低劑量組、MOS-P低劑量組和MOS-P高劑量組肝臟SOD活力顯著高于正常組（P＜0.05），MOL-P高劑量組肝臟SOD活力達(dá)到正常組水平（P＞0.05）。Sun Yangying等[28]研究了雞胸肉蛋白水解物在D-半乳糖致衰小鼠體內(nèi)的抗氧化功效，該樣品組肝臟SOD活力較模型組提高了12.88%；此外還有研究表明，葉瓜參多肽高劑量組能顯著提高衰老小鼠肝臟SOD活力，較模型組提高了26.80%[3]。研究結(jié)果再次驗證了辣木源多肽組分對機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的維護(hù)作用，尤其是MOS-P。

表3 辣木源多肽組分對D-半乳糖致衰小鼠血清、肝臟和腦SOD活力的影響Table 3 Effects of MOL-P and MOS-P on SOD activity in serum, liver and brain of D-galactose-induced aging mice

2.5 辣木源多肽組分對D-半乳糖致衰小鼠血清、肝臟和腦組織MDA水平的影響

MDA是由自由基誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用生成的內(nèi)源性基因毒性產(chǎn)物，被認(rèn)為是衡量體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)[15]。在氧化應(yīng)激的眾多生物學(xué)靶標(biāo)中，脂質(zhì)是占比最大的一類，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生許多醛類物質(zhì)，其中MDA是最重要的一類醛類衍生物，被廣泛用作氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志[27]。

表4 辣木源多肽組分對D-半乳糖致衰小鼠血清、肝臟和腦MDA水平的影響Table 4 Effects of MOL-P and MOS-P on MDA levels in serum, liver and brain of D-galactose-induced aging mice

由表4可知，模型組血清、肝臟和腦組織MDA水平均顯著高于正常組（P＜0.05），表明在持續(xù)注射D-半乳糖后，小鼠機(jī)體抗氧化能力下降。對于小鼠血清MDA水平：高、低劑量MOL-P和低劑量MOS-P均能顯著降低衰老小鼠血清MDA水平（P＜0.05），較模型組分別降低了17.53%、14.49%和18.30%；高劑量MOS-P雖能在一定程度上降低衰老小鼠血清MDA水平，但和模型組相比差異不顯著（P＞0.05）。對于小鼠肝臟MDA水平：高、低劑量MOL-P和高劑量MOS-P均能顯著降低肝臟MDA水平（P＜0.05），低劑量MOS-P雖然能在一定程度上降低肝臟MDA水平，但和模型組相比差異不顯著（P＞0.05）。對于小鼠腦組織MDA水平：辣木源多肽組分均能顯著降低衰老小鼠腦組織MDA水平（P＜0.05），其中效果最好的是高劑量MOL-P和高劑量MOS-P，較模型組分別降低了41.28%和44.95%；值得一提的是，辣木源多肽組分各劑量組腦組織MDA水平也顯著低于正常組水平，表明辣木源多肽組分是卓越的體內(nèi)抗氧化劑，能保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激所致?lián)p傷，具有潛在的開發(fā)利用前景。

2.6 辣木源多肽對D-半乳糖致衰老小鼠肝臟組織的影響

圖2 小鼠肝臟組織切片（100×）Fig. 2 Effects of MOL-P and MOS-P on histopathological changes of liver tissues in D-galactose-induced aging mice (100 ×)

如圖2所示，正常組肝臟細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形態(tài)正常，肝細(xì)胞核清晰突出，以中央靜脈為中心，肝索呈放射狀排列；模型組肝細(xì)胞擴(kuò)張，肝竇擴(kuò)大且肝索排列紊亂，中央靜脈附近有炎癥細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象亦很明顯，說明肝臟組織已被損傷；辣木源多肽各劑量組肝細(xì)胞形態(tài)和肝索排列趨于正常，細(xì)胞凋亡明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤的情況減少。再次說明辣木源多肽組分能保護(hù)肝臟免受氧化應(yīng)激所致?lián)p傷。

本團(tuán)隊前期以抗氧化活性為導(dǎo)向，定向制備得到辣木源多肽組分，并基于生物可接受度來評價其抗氧化性，通過模擬胃、腸道消化，研究辣木源多肽組分胃、腸道消化物對氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)作用，結(jié)果表明，辣木源多肽組分經(jīng)胃、腸道消化后，抗氧化活性增強(qiáng)，釋放出更多短肽段，清除胞內(nèi)ROS，下調(diào)MDA水平來保護(hù)氧化損傷紅細(xì)胞[15-16]。在對氧化損傷紅細(xì)胞的保護(hù)活性方面，辣木葉多肽組分胃、腸道消化物強(qiáng)于GSH，其中的一條二肽Leu-His的抗氧化活性與GSH相當(dāng)；辣木籽多肽組分胃、腸道消化物中的一條二肽Gln-Met的抗氧化活性也能與GSH相媲美[15-16]。這些小分子抗氧化肽是辣木葉、辣木籽多肽組分發(fā)揮良好抗衰老活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本研究在動物實驗水平上證實辣木源多肽組分通過提高衰老小鼠血清GSH-Px活力和肝臟SOD活力，有效維護(hù)機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)，一定程度上降低血清、肝臟、腦組織MDA水平，抑制脂質(zhì)過氧化，上調(diào)腦系數(shù)，改善小鼠肝臟、腦組織氧化損傷，起到延緩衰老的作用。結(jié)合本團(tuán)隊前期研究成果，辣木源多肽良好的體內(nèi)抗氧化作用與其中所含抗氧化肽片段密切相關(guān)。本研究結(jié)果對于具有抗衰老活性膳食干預(yù)劑的篩選、以辣木源多肽為核心功能性因子的健康食品的研制以及辣木精深加工產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展方面具有理論和方法的指導(dǎo)意義。