王詩(shī)琪，黃曉蕓，易 陽(yáng),*，黃 菲，王麗梅，王宏勛

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510610；3.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

作為代表性的亞熱帶水果和藥食同源食品，龍眼（Dimocarpus longan Lour.）具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的風(fēng)味，尤其是含有豐富的活性多酚和多糖，深受消費(fèi)者喜愛(ài)[1-2]。龍眼鮮果采收上市時(shí)間集中且極易褐變腐爛，大部分通過(guò)干制以實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品保藏與轉(zhuǎn)化[3-4]，故干制加工技術(shù)研發(fā)對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要現(xiàn)實(shí)意義。近年來(lái)，龍眼干制技術(shù)研究的方向發(fā)生明顯轉(zhuǎn)變，即由“高效節(jié)能技術(shù)的設(shè)計(jì)與創(chuàng)新”[5-7]轉(zhuǎn)向“基于高品質(zhì)產(chǎn)品制備的技術(shù)評(píng)價(jià)與優(yōu)化”[8-9]。目前，對(duì)于龍眼干果肉的品質(zhì)控制研究主要側(cè)重于其食用特征（色澤、質(zhì)地、外形、風(fēng)味等）、基本營(yíng)養(yǎng)成分以及抗氧化活性多酚的工藝影響[3-4,8-10]，而對(duì)果肉營(yíng)養(yǎng)功能有重要貢獻(xiàn)的多糖則鮮有關(guān)注。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，龍眼果肉多糖具有良好的抗氧化、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性[2,11]。而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，具有免疫調(diào)節(jié)活性的龍眼多糖含有少量蛋白質(zhì)或氨基酸[12-13]，這部分氨基化合物可能是在果肉熱風(fēng)干制過(guò)程中與多糖通過(guò)美拉德反應(yīng)共價(jià)結(jié)合，并在一定程度上增強(qiáng)多糖的體外免疫刺激活性[14-17]。Huang Fei[18]和郭亞娟[19]等研究發(fā)現(xiàn)，不同方式干制荔枝果肉中多糖的理化特征、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性呈現(xiàn)顯著差異。直接的多糖提取液干制研究發(fā)現(xiàn)，因溫度、時(shí)間和脫水機(jī)理等的差異，不同方法干制所得多糖的結(jié)構(gòu)和活性有明顯區(qū)別[20-23]。龍眼干果肉中多糖的存在狀態(tài)對(duì)于其營(yíng)養(yǎng)功能品質(zhì)提升有重要意義，而不同干制方法對(duì)多糖理化特征和功能活性的影響鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，本實(shí)驗(yàn)采用熱風(fēng)、真空、紅外和冷凍方法分別干制龍眼果肉，提取分離其多糖組分，分析粗多糖的理化及生化特性，明確干制方式對(duì)龍眼果肉中多糖的影響，旨為龍眼果肉干制品質(zhì)“提質(zhì)增效”提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮龍眼（‘儲(chǔ)良’）購(gòu)于茂名市粵云山農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

鄰苯二甲醛 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1-苯基-3-甲基-5吡唑啉酮 北京化學(xué)試劑公司；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖（均為色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)試劑盒 南京建成生物工程研究所；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrythydrazyl，DPPH） 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

人源胃癌細(xì)胞SGC7901、人源肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7 湖北百奧斯生物科技有限公司；細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒CCK-8 南京恩晶生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）酶聯(lián)免疫試劑盒 武漢基因美科技有限公司；α-淀粉酶（酶活力50 U/g）、胃蛋白酶（1∶30 000）、胰酶（1∶4 000） 上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6050型真空干燥箱 上海精宏設(shè)備有限公司；12N冷凍干燥儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；WS70-1紅外快速干燥箱 杭州齊威儀器有限公司；SUNRISE酶標(biāo)定量測(cè)定儀 瑞士Tecan公司；NEXUS-670傅里葉變換紅外（Fourier transform infrared，F(xiàn)TIR）光譜儀 美國(guó)尼高力儀器有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；1260高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）系統(tǒng)、ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、PL aquagel-OH 40色譜柱（7.5 mm×300 mm，8 μm） 美國(guó)Agilent公司；DAWN HELEOS-II18多角度激光光散射（multi-angle laser light scattering，MALLS）檢測(cè)器和Optilab rEX示差折光率（refractive index，RI）檢測(cè)器 美國(guó)Wyatt公司。

1.3 方法

1.3.1 龍眼果肉干制及其粗多糖制備

1.3.1.1 龍眼果肉干制

熱風(fēng)干制（hot-air drying，HD）：參考徐玉娟等[9]的方法，將龍眼果實(shí)采用60 ℃熱風(fēng)干制60 h，干制過(guò)程中間隔12 h靜置回軟12 h（回軟時(shí)間不計(jì)入干制時(shí)間），干制果實(shí)于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

真空干制（vacuum drying，VD）：參考肖維強(qiáng)等[24]的方法，將龍眼果實(shí)在80 ℃（真空度不高于0.07 MPa）下初焙12 h，在65 ℃（真空度不高于0.07 MPa）下復(fù)焙42 h，干制過(guò)程中間隔12 h靜置回軟處理12 h，干制果實(shí)于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

紅外干制（infrared drying，ID）：將龍眼果實(shí)在500 W功率下輻射干制6 h，干制過(guò)程中間隔1 h靜置回軟處理3 h，干制果實(shí)于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

冷凍干制（freeze drying，F(xiàn)D）：將龍眼果實(shí)置于-20 ℃預(yù)凍12 h，在真空度約51 Pa及冷阱溫度約-40 ℃的條件下干制39 h，干制果實(shí)于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 龍眼粗多糖制備

參考韓苗苗等[14]的方法提取制備龍眼多糖（longan polysaccharide，LP）。從新鮮（fresh，F(xiàn)）、熱風(fēng)干制、真空干制、紅外干制和冷凍干制的果肉中制備所得的粗多糖分別記為FLP、HDLP、VDLP、IDLP和FDLP。

1.3.2 龍眼粗多糖的理化分析

總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用苯酚-硫酸法測(cè)定[25]，以葡萄糖當(dāng)量計(jì)算；蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒測(cè)定；氨基酸組成參考GB 5009.124—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸的測(cè)定》[26]，采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定；單糖組成采用反相HPLC法測(cè)定[27]；在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)掃描多糖的FTIR光譜，并采用高效分子排阻色譜（high-pressure size exclusion chromatography，HPSEC）法結(jié)合MALLS和RI檢測(cè)器分析多糖的分子質(zhì)量[16]。

1.3.3 龍眼粗多糖的活性評(píng)價(jià)

多糖的DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力參考Yi Yang等[16]的方法。多糖的巨噬細(xì)胞免疫刺激活性參考韓苗苗等[14]的方法，將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、LPS刺激組、FLP組、HDLP組、VDLP組、IDLP組和FDLP組。采用一氧化氮（nitric oxide，NO）生成量和TNF-α表達(dá)量評(píng)價(jià)。

1.3.4 龍眼粗多糖的消化特性

參考Yi Yang等[28]的方法：制備模擬唾液、胃液和腸液；在各消化液中處理多糖，再進(jìn)行消化液的檢測(cè)前處理。消化液中的還原糖含量采用二硝基水楊酸法測(cè)定[29]，而游離單糖組成采用反相HPLC法測(cè)定[27]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，組間數(shù)據(jù)在0.05水平的顯著性差異通過(guò)SPSS 19.0軟件進(jìn)行S-N-K檢驗(yàn)分析。FTIR光譜圖通過(guò)ChemPattern 2017化學(xué)計(jì)量學(xué)分析軟件積分，統(tǒng)計(jì)相對(duì)峰高值大于0.5的特征譜帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的理化特征比較

表1 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的基本組成Table 1 Chemical composition of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

不同方式干制龍眼果肉制備所得粗多糖的基本組成存在明顯差異，如表1所示。前期研究發(fā)現(xiàn)，龍眼果肉經(jīng)連續(xù)熱風(fēng)干制60 h后粗多糖的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著下降（P＜0.05），而蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加（P＜0.05）[14]，可能與大分子發(fā)生美拉德反應(yīng)有關(guān)。然而，F(xiàn)LP與HDLP的總糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05），相比之下，VDLP和IDLP具有更高的總糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，F(xiàn)DLP的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低。不同粗多糖中蛋白質(zhì)的氨基酸組成也存在明顯區(qū)別，F(xiàn)DLP中疏水性氨基酸占總氨基酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（37.15%）明顯低于其他4 種粗多糖。HDLP果肉所得粗多糖中疏水性氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于FLP，可能與蛋白質(zhì)的糖基化有關(guān)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加。而對(duì)于不同方式干制荔枝果肉中粗多糖的組成差異，郭亞娟[19]認(rèn)為與干制條件對(duì)多糖結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響以及進(jìn)一步的大分子靜電相互作用改變有關(guān)。

采用柱前衍生化HPLC法測(cè)定8 種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰依次為：甘露糖（13.151 min）、核糖（17.357 min）、鼠李糖（18.760 min）、葡萄糖醛酸（19.999 min）、半乳糖醛酸（22.751 min）、葡萄糖（27.106 min）、半乳糖（30.458 min）、阿拉伯糖（32.508 min）（圖1）。同時(shí)，確定5 種龍眼粗多糖主要由葡萄糖組成，文獻(xiàn)[14,16]報(bào)道的其余7 種單糖可能因含量過(guò)低而未被檢出。

圖1 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的單糖組成HPLC分析圖譜Fig. 1 HPLC chromatograms of monosaccharide compositions of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

采用HPSEC-MALLS-RI法測(cè)定龍眼粗多糖的分子質(zhì)量分布，結(jié)果如表2所示。5 種粗多糖的分子質(zhì)量分布存在明顯差異，F(xiàn)LP、HDLP、VDLP、IDLP和FDLP的平均分子質(zhì)量之比為51.37∶28.33∶5.95∶7.86∶1.00；FLP以105～106Da組分為主（相對(duì)含量70.4%），且大于107Da組分相對(duì)含量達(dá)29.6%；干制龍眼果肉所得粗多糖中大于107Da組分明顯減少，105～106Da組分增加，106～107Da組分含量相對(duì)穩(wěn)定；FDLP的分子質(zhì)量分布明顯不同于其他多糖，其組分主要集中在小于105Da范圍，相對(duì)含量達(dá)72.8%。研究表明，冷凍、真空、微波、熱泵和熱風(fēng)干制均不同程度導(dǎo)致荔枝果肉中多糖分子質(zhì)量降低[19]。韓苗苗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，龍眼果肉經(jīng)熱風(fēng)干制60 h后，多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合形成大分子復(fù)合物，導(dǎo)致分子質(zhì)量增加。此外，Yan Jingkun等[30]研究發(fā)現(xiàn)，苦瓜片在熱風(fēng)干制和紅外輻射干制過(guò)程中，其多糖均發(fā)生一定程度熱降解。由此推測(cè)，龍眼果肉粗多糖分子質(zhì)量分布存在差異的主要原因可能涉及3 個(gè)方面：1）熱干制過(guò)程中多糖分子的降解使其分子質(zhì)量降低；2）熱干制過(guò)程中多糖和蛋白質(zhì)可能發(fā)生羰氨縮合、Amadori重排、分子裂解、Strecker降解等反應(yīng)，導(dǎo)致復(fù)合物的生成與分解，使分子質(zhì)量先升后降；3）干制過(guò)程導(dǎo)致多糖和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)改變，減弱了濃縮、醇沉及復(fù)溶冷凍干燥等制備過(guò)程中分子間的靜電、氫鍵或疏水相互作用，導(dǎo)致大分子纏結(jié)、聚集或結(jié)合減弱，使分子質(zhì)量降低。

表2 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的分子質(zhì)量分布Table 2 Molecular mass distribution of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

圖2 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的FTIR光譜特征Fig. 2 FTIR characteristics of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

5 種龍眼多糖的紅外光譜圖都具有多糖和蛋白質(zhì)的特征吸收（圖2A）。糖類特征峰包括[14]：羥基O—H在3 422 cm-1附近產(chǎn)生的特征吸收峰屬于分子間或分子內(nèi)的伸縮、彎曲振動(dòng)吸收峰；烷基C—H在2 926 cm-1附近產(chǎn)生的伸縮振動(dòng)吸收峰；在1 180～953 cm-1范圍由C—C和C—O伸縮振動(dòng)以及C—H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生“糖帶”吸收峰。蛋白質(zhì)特征吸收峰包括：在1 616 cm-1附近產(chǎn)生的酰胺I區(qū)C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰；在1 480 cm-1附近產(chǎn)生的酰胺II區(qū)N—H彎曲振動(dòng)和C—N伸縮振動(dòng)吸收峰；在1 330～1 260 cm-1范圍的酰胺III區(qū)O—H彎曲振動(dòng)吸收峰[14]。對(duì)FTIR光譜圖進(jìn)行積分，統(tǒng)計(jì)相對(duì)峰高值大于0.5的共有特征峰（圖2B）。相比FLP，HDLP、VDLP、IDLP的烷基C—H特征吸收強(qiáng)度與酰胺區(qū)特征吸收強(qiáng)度均略有減弱，而FDLP的相關(guān)特征吸收均明顯增強(qiáng)，說(shuō)明熱法干制（熱風(fēng)、真空、紅外干制）和冷法干制（冷凍干制）對(duì)多糖和蛋白官能團(tuán)產(chǎn)生不同的影響。

2.2 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的活性評(píng)價(jià)

抗氧化和免疫調(diào)節(jié)是龍眼多糖的重要生物功效[2,11]，故對(duì)不同龍眼多糖的自由基清除能力和巨噬細(xì)胞刺激活性進(jìn)行比較，結(jié)果如圖3所示。5 種龍眼多糖對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除率隨其質(zhì)量濃度的增大而增加，但當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)4 mg/mL后FDLP和FLP的DPPH清除率明顯下降。相比熱法干制果肉所得多糖，F(xiàn)DLP和FLD可能引入的取代基少，高濃度下反應(yīng)體系中多糖的分子內(nèi)或分子間氫鍵作用較強(qiáng)，活性羥基含量減少導(dǎo)致多糖作為氫供體的自由基清除能力減弱[31]。對(duì)于DPPH自由基清除能力和羥自由基清除能力，5 種多糖的強(qiáng)弱表現(xiàn)有所不同，可能與不同的反應(yīng)機(jī)理有關(guān)（多糖的金屬離子螯合能力直接影響羥自由基的產(chǎn)生）。HDLP的DPPH自由基清除能力最弱，F(xiàn)DLP的羥自由基清除能力最強(qiáng)。FDLP的自由基能力綜合較強(qiáng)，可能因其分子質(zhì)量較低，暴露的活性羥基較多。而果肉長(zhǎng)時(shí)間熱風(fēng)干制過(guò)程中，HDLP的活性羥基可能被部分取代，導(dǎo)致其自由基清除能力減弱。

空白對(duì)照組和LPS刺激組的巨噬細(xì)胞NO生成量分別為55.60 μmol/L和71.62 μmol/L。由圖3C可見(jiàn)，除FLP外，其他4 種粗多糖均能顯著刺激巨噬細(xì)胞NO生成（P＜0.05），且呈現(xiàn)量效正相關(guān)性。在相同質(zhì)量濃度（100～400 μg/mL）下，VDLP與IDLP和FDLP刺激巨噬細(xì)胞NO生成量無(wú)顯著差異（P＞0.05），而HDLP在質(zhì)量濃度400 μg/mL下NO生成量最高（P＜0.05）?？瞻讓?duì)照組和LPS刺激組的巨噬細(xì)胞TNF-α分泌量分別為63.45 pg/mL和183.14 pg/mL。由圖3D可見(jiàn)，5 種多糖均能有效刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α（P＜0.05）。在100 μg/mL下，F(xiàn)LP刺激TNF-α分泌量與HDLP、VDLP和IDLP均無(wú)顯著差異（P＞0.05），但顯著高于FDLP（P＜0.05）。在400 μg/mL下，VDLP、IDLP和FDLP的TNF-α分泌量無(wú)顯著差異（P＞0.05），且顯著低于HDLP（P＜0.05），而FLP的TNF-α分泌量最高（P＜0.05）。與羥自由基清除能力相反，龍眼多糖刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α與分子質(zhì)量呈正相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)，龍眼多糖主要通過(guò)Toll樣受體4引發(fā)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]，而Toll樣受體4更易與高分子質(zhì)量多糖親合[32]。

圖3 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的抗氧化活性和巨噬細(xì)胞刺激活性Fig. 3 Antioxidant and macrophage-stimulating activities of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

2.3 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的消化特性比較

多糖在消化過(guò)程可能因pH值、消化酶等作用發(fā)生降解，釋放出還原糖，而結(jié)構(gòu)上的變化可能改變其活性[28,33]。由圖4可見(jiàn)，模擬唾液、胃液和腸液對(duì)5 種龍眼多糖有不同程度的消解作用，釋放的還原糖質(zhì)量濃度存在一定差異。模擬唾液消化2 h后，還原糖質(zhì)量濃度均顯著增加（P＜0.05），但進(jìn)一步延長(zhǎng)消化時(shí)間其質(zhì)量濃度未顯著改變（P＞0.05），而IDLP的消解程度明顯低于其他多糖。相反，IDLP在模擬胃液中消解的還原糖質(zhì)量濃度最高（P＜0.05）。相比之下，龍眼多糖在模擬腸液中的消解程度微乎其微。采用HPLC法檢測(cè)龍眼多糖經(jīng)模擬消化6 h后的游離葡萄糖（圖5），通過(guò)峰面積比較發(fā)現(xiàn)，胃液中游離葡萄糖含量最高，唾液次之，而腸液中的含量極低。唾液和胃液中還原糖和葡萄糖的含量高低不一致，說(shuō)明龍眼多糖在不同消化體系中的消解機(jī)理存在差異。蓮藕多糖為分子質(zhì)量1.33～5.30 kDa的α-(1→6)-D-葡聚糖（或雜葡聚糖）[28]，與龍眼多糖的組成相近[13,34]，兩者的消化特性存在異同：均在胃液中的葡萄糖消解量較高；蓮藕多糖在腸液和胃液中的消解程度相近，且經(jīng)腸液消解后分子質(zhì)量降低。相對(duì)較高的分子質(zhì)量可能是龍眼多糖消化特性有別于蓮藕多糖的關(guān)鍵。

圖4 不同方式干制龍眼果肉中粗多糖的消化特性Fig. 4 Digestive characteristics of crude polysaccharides from longan pulp dried by different methods

圖5 龍眼粗多糖模擬消化6 h后消解單糖的HPLC分析圖譜Fig. 5 HPLC chromatograms of monosaccharides released from crude longan polysaccharides after simulated digestion for 6 hours

3 結(jié) 論

從新鮮和干制龍眼果肉中分別提取分離粗多糖，即FLP、HDLP、VDLP、IDLP、FDLP，通過(guò)分析其基本組成、FTIR光譜特征和分子質(zhì)量分布發(fā)現(xiàn)，不同干制方式對(duì)粗多糖組成及結(jié)構(gòu)的影響有所差異，尤其是冷凍干制果肉所得多糖的分子質(zhì)量明顯低于其他多糖。同時(shí)，5 種粗多糖的抗氧化活性和免疫刺激活性也存在明顯差異，綜合比較，F(xiàn)DLP具有較強(qiáng)的自由基清除能力，而HDLP刺激巨噬細(xì)胞NO和TNF-α生成的能力更強(qiáng)。龍眼多糖在模擬唾液和胃液消化過(guò)程中發(fā)生不同程度消解，釋放出以葡萄糖為主的少量還原糖。而不同方式干制可能導(dǎo)致其消化特性的改變，模擬唾液和胃液消化對(duì)IDLP的影響明顯不同于其他多糖。干制工藝對(duì)龍眼果肉中活性多糖的理化和生化特性有一定影響，而多糖結(jié)構(gòu)變化機(jī)制及相關(guān)構(gòu)效關(guān)系有待于進(jìn)一步探析。