郭子璇，蘇瑞景，肖傳斌，仝宗喜，楊玉榮

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 鄭州 450002)

弓形蟲(Toxoplasmagondii)是一種細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，可以侵染幾乎所有溫血?jiǎng)游锏挠泻思?xì)胞，誘發(fā)弓形蟲病，免疫功能受抑制的動(dòng)物和患者表現(xiàn)為急性弓形蟲病，健康動(dòng)物和人感染弓形蟲常表現(xiàn)為無(wú)明顯癥狀的慢性感染。進(jìn)入弓形蟲慢性感染階段，弓形蟲形成包囊，可寄生于多個(gè)器官，但分布于橫紋肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的包囊最多[1]。研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)人和肉用動(dòng)物弓形蟲的感染率約為8.2%和23.7%，其主要流行的蟲株為Chinese1型弓形蟲[2]，但同為基因型Chinese1型弓形蟲的不同分離株，其致病性還存在很大差異[3-4]。目前，Chinese1型弓形蟲慢性感染對(duì)大腦的致病性方面研究，還不豐富。張義華等[5]發(fā)現(xiàn)，Chinese1(TgCtwh6)慢性弓形蟲感染小鼠腦部的損傷與小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)。本試驗(yàn)研究虎源Chinese1(TgTigerCHn1)弓形蟲對(duì)BALB/c小鼠大腦的致病性和包囊分布，旨在為慢性弓形蟲病致人和動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面研究提供參考數(shù)據(jù)，增進(jìn)對(duì)我國(guó)人和動(dòng)物慢性弓形蟲病危害的認(rèn)識(shí)和了解。

1 材料與方法

1.1 弓形蟲蟲株與抗體TgTigerCHn1(Chinese1)弓形蟲蟲株分離于河南省動(dòng)物園老虎[6]。兔抗弓形蟲多克隆抗體和弓形蟲抗原由美國(guó)農(nóng)業(yè)部Dubey試驗(yàn)室饋贈(zèng)，小鼠/兔HRP/DAB(ABC)IHC檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Abcam公司(貨號(hào)：ab64264)。

1.2 試驗(yàn)分組健康BALB/c小鼠10只，弓形蟲檢測(cè)陰性，購(gòu)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理遵守動(dòng)物倫理與福利相關(guān)規(guī)定)。小鼠隨機(jī)分為2組，每組5只，試驗(yàn)組小鼠腹腔注射無(wú)菌生理鹽水稀釋的弓形蟲速殖子1個(gè)/只(速殖子濃度采用<100，101，102，103，104，105梯度稀釋后，經(jīng)小鼠生物學(xué)測(cè)定確定[6])，每只小鼠接種量為1 mL，對(duì)照組小鼠腹腔注射無(wú)菌生理鹽水1 mL/只。自由采食飼料和飲水，每日觀察小鼠臨床情況并記錄。接種后60 d(60DPI)，采集小鼠血清，乙醚麻醉后處死，10%的中性福爾馬林溶液固定小鼠中樞神經(jīng)組織。

1.3 弓形蟲檢測(cè)方法采用改良凝集實(shí)驗(yàn)(Modified Agglutination Test，MAT)方法檢測(cè)小鼠血清中弓形蟲IgG[7]，確定小鼠是否感染弓形蟲。組織壓片方法檢查大腦皮質(zhì)中是否含有弓形蟲包囊，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4 小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)連續(xù)切片制作及染色運(yùn)用常規(guī)病理學(xué)技術(shù)制作腦組織連續(xù)石蠟切片，切片厚度7 μm。全腦的矢狀面，1/2大腦全部制做連續(xù)切片，約110張/只小鼠。中樞神經(jīng)系統(tǒng)全長(zhǎng)(1.43±0.20)cm，采用石蠟切片技術(shù)制片后，觀察到的中樞神經(jīng)系統(tǒng)體積略小于真實(shí)體積。顯微鏡下觀察可見(jiàn)，含大腦的切片110張，厚度(0.43±0.05)cm；含腦干的切片90張，腦干厚度(0.42±0.02)cm；含小腦的切片73張，厚度(0.39±0.14)cm。

采用蘇木素與伊紅對(duì)比染色法 (Hematoxylin-Eosin staining，H&E)觀察大腦皮質(zhì)、基底核、間腦、中腦、后腦、小腦蚓部和半球部位的病理?yè)p傷，統(tǒng)計(jì)全部腦組織內(nèi)的弓形蟲的包囊數(shù)量、血管周圍炎癥反應(yīng)數(shù)量和包囊周圍炎癥程度。正常腦組織評(píng)為0分，包囊周圍單核細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量為10個(gè)到30個(gè)評(píng)為1分；30個(gè)到50個(gè)評(píng)為2分；50個(gè)以上評(píng)為3分[8-9]。采用免疫組織化學(xué)染色方法(immunohistochemical staining，IHC)觀察弓形蟲抗原分布。

1.5 數(shù)據(jù)處理采用軟件GraphPad prims 5.0(Graphpad Software Inc.，San Diego，CA，USA)對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并制圖。

2 結(jié)果

2.1 BALB/c小鼠弓形蟲的感染情況試驗(yàn)組、對(duì)照組小鼠存活期均達(dá)60 d，未見(jiàn)明顯臨床異常表現(xiàn)。60 d后，試驗(yàn)組小鼠(n=5)腹腔注射TgTigerCHn1弓形蟲速殖子后，其MAT滴度均1∶200，且大腦皮質(zhì)壓片均可觀察到弓形蟲包囊，顯示100%小鼠成功感染弓形蟲。對(duì)照組小鼠，其MAT滴度均<1∶25，且大腦皮質(zhì)壓片未檢查到弓形蟲包囊，顯示未感染弓形蟲(表1)。

表1 BALB/c小鼠感染TgTigerCHn1弓形蟲的發(fā)病情況(感染后60 d，1個(gè)速殖子/只，腹腔注射)

2.2 慢性弓形蟲病小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理組織學(xué)變化小鼠感染TgTigerCHn1弓形蟲速殖子60DPI，眼觀，其大腦輕微腫大，蛛網(wǎng)膜充血。顯微鏡下，小鼠腦組織呈非化膿性腦炎特征。弓形蟲生長(zhǎng)于神經(jīng)元內(nèi)，并形成包囊，其周圍可見(jiàn)嗜神經(jīng)元現(xiàn)象和神經(jīng)細(xì)胞壞死，小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞增生形成膠質(zhì)結(jié)節(jié)(圖1 A)；弓形蟲包囊周圍的血管周圍浸潤(rùn)單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，形成袖套現(xiàn)象(圖1 B)；有的多個(gè)弓形蟲包囊呈衛(wèi)星樣分布(海馬較明顯)，周圍可見(jiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞壞死和炎癥反應(yīng)(圖1 C)；此外，蛛網(wǎng)膜下腔可見(jiàn)多量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥附近可見(jiàn)弓形蟲包囊(圖1 D)；多數(shù)弓形蟲包囊分布于神經(jīng)元，也可見(jiàn)生長(zhǎng)于小腦浦肯野細(xì)胞中的包囊(圖1 E)；免疫組織化學(xué)方法驗(yàn)證這些包囊呈弓形蟲抗原陽(yáng)性(圖1 F)。

2.3 慢性弓形蟲病小鼠中樞神經(jīng)組織弓形蟲包囊的分布弓形蟲包囊在慢性弓形蟲病小鼠中樞神經(jīng)組織切片中呈近圓形，且不均勻分布(圖1;圖2A，B)。小鼠感染TgTigerCHn1弓形蟲，從顱側(cè)到尾側(cè)的大腦皮質(zhì)、基底核、腦干、中腦、后腦、小腦蚓部和半球部位，其弓形蟲包囊數(shù)量、血管周圍炎癥反應(yīng)數(shù)量和包囊周圍炎癥程度均有顯著性差異。弓形蟲包囊數(shù)量從高到低依次為，大腦皮質(zhì)>中腦>基底核>間腦>后腦>小腦蚓部>小腦半球。其中，大腦皮質(zhì)的弓形蟲包囊數(shù)量最多，為(16.06±1.01)個(gè)/cm2腦組織(圖2 B)，包囊周圍的炎癥程度也最重，弓形蟲包囊數(shù)量與炎癥程度呈正相關(guān)(圖2 A，C)。基底核的血管周圍炎反應(yīng)最為劇烈(圖2 D)。小腦蚓部和半球的弓形蟲包囊數(shù)量最少，為(1.44±0.15)個(gè)/cm2小腦蚓部，包囊周圍的炎癥反應(yīng)程度也較輕(圖2 B，C)。腦干中，中腦的弓形蟲包囊數(shù)量最多，為(12.51±1.05)個(gè)/cm2腦組織(圖2 B)。其大腦包囊總數(shù)量可達(dá)約10 700個(gè)。

圖1 BALB/c小鼠感染TgTigerCHn1弓形蟲慢性期中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理變化 A.大腦中神經(jīng)元內(nèi)弓形蟲包囊(箭頭)和周圍的膠質(zhì)結(jié)節(jié)現(xiàn)象(三角形)，H&E染色；B.血管袖套(三角形)和附近的弓形蟲包囊(箭頭)，H&E染色；C.海馬多個(gè)弓形蟲包囊(箭頭)，H&E染色；D.大腦中蛛網(wǎng)膜下腔炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(三角形)和附近的弓形蟲包囊(箭頭)，H&E染色；E.小腦浦肯野細(xì)胞中的包囊(箭頭)，H&E染色;F.大腦弓形蟲包囊(箭頭)和神經(jīng)元細(xì)胞核(三角形)，IHC染色

圖2 BALB/c小鼠感染TgTigerCHn1弓形蟲后中樞神經(jīng)系統(tǒng)弓形蟲包囊分布、數(shù)量和損傷 A.弓形蟲包囊總數(shù)量；B.弓形蟲包囊平均數(shù)量；C.弓形蟲包囊周圍炎癥評(píng)分；D.發(fā)生血管周圍炎癥的平均數(shù)量

3 討論

弓形蟲急性感染期的速殖子，受到宿主免疫反應(yīng)抑制后轉(zhuǎn)化為緩殖子，并形成包囊，轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿腥酒?；而慢性感染期的緩殖子，在宿主免疫功能低下時(shí)又可以活化成為速殖子，重新轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙愿腥?，造成?yán)重的臨床癥狀和后果。關(guān)于急性和慢性感染階段沒(méi)有嚴(yán)格的界定，一般，弓形蟲急性感染期可在感染后持續(xù)3周，超過(guò)3周，動(dòng)物未表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，則進(jìn)入慢性感染期。本研究結(jié)果顯示，虎源Chinese1型弓形蟲(TgTigerCHn1株，1個(gè))感染小鼠60 d后，全部存活，且無(wú)明顯臨床癥狀，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)多量的弓形蟲包囊，未見(jiàn)弓形蟲速殖子，說(shuō)明這些小鼠已進(jìn)入慢性感染階段。

一般認(rèn)為，弓形蟲感染宿主后，弓形蟲包囊可長(zhǎng)時(shí)間存在于腦組織或橫紋肌中(大約一生)，免疫能力正常的宿主可建立有效的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)抑制包囊激活，并抵抗弓形蟲所引發(fā)的腦炎[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染虎源弓形蟲慢性期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布大量的弓形蟲包囊，且存在與弓形蟲包囊相關(guān)的病理組織損傷，并引發(fā)了弓形蟲性非化膿性腦炎。關(guān)于Chinese1型弓形蟲對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和分布，尚未見(jiàn)報(bào)道。Prugniuad(Pru)株弓形蟲感染小鼠70 d后，大腦也可見(jiàn)明顯的病理?yè)p傷(炎性細(xì)胞浸潤(rùn))[11]。弓形蟲慢性感染階段，可改變或顛覆宿主神經(jīng)元的活性，從而永久性的影響宿主行為[12]。這些結(jié)果說(shuō)明，弓形蟲慢性感染期對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)有損傷，并推測(cè)影響其神經(jīng)功能。本課題組在日常管理弓形蟲慢性感染的小鼠過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)其存活期明顯低于健康小鼠(P<0.05)。因人類抵抗弓形蟲免疫反應(yīng)與小鼠完全不同，因此弓形蟲慢性感染期是否引起人和其他動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理?yè)p傷，還不確定。但對(duì)自然感染弓形蟲的黑猩猩研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲可改變其行為[13]。而且，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，弓形蟲血清陽(yáng)性患者與患精神分裂癥和躁郁癥存在相關(guān)性[14]。Chinese1型弓形蟲是我國(guó)人和動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)蟲株，其慢性感染期潛在的危害尚需更多的客觀評(píng)價(jià)。

根據(jù)對(duì)照組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)未見(jiàn)明顯損傷，以及試驗(yàn)組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷周圍可見(jiàn)弓形蟲包囊分布這一特點(diǎn)，說(shuō)明這些損傷和炎癥反應(yīng)是弓形蟲感染引起的。大腦皮質(zhì)的弓形蟲包囊數(shù)量和損傷程度均處于較高水平，而小腦半球的弓形蟲包囊分布最少(P<0.05)。這一結(jié)果提示，臨床病理診斷弓形蟲腦炎時(shí)，大腦皮質(zhì)是理想的檢查部位。綿羊弓形病急性感染時(shí)，也發(fā)現(xiàn)大腦皮質(zhì)和視交叉的損傷程度最重，弓形蟲蟲體分布最多[15]。弓形蟲感染后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病原分布和損傷特點(diǎn)推測(cè)弓形蟲可影響宿主的認(rèn)知功能和視野缺損，表現(xiàn)在不能集中注意力進(jìn)行觀察和思考問(wèn)題、健忘、情緒波動(dòng)和視力障礙。

弓形蟲速殖子腹腔注射感染小鼠，弓形蟲可經(jīng)淋巴和血液循環(huán)擴(kuò)散至腦部中樞神經(jīng)。弓形蟲速殖子進(jìn)入大腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，并在大量復(fù)制后裂解內(nèi)皮細(xì)胞，從而攻破血腦屏障，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[16]。速殖子主要進(jìn)入神經(jīng)元和神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制，活化小膠質(zhì)細(xì)胞，并導(dǎo)致腦組織的損傷[17]。但弓形蟲嗜中樞神經(jīng)系統(tǒng)的機(jī)制，還不清晰。

該研究豐富了我國(guó)Chinese1型弓形蟲蟲株對(duì)宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷特征研究，展示了小鼠感染Chinese1型弓形蟲慢性感染期中樞神經(jīng)系統(tǒng)包囊的分布和炎癥反應(yīng)程度，為探討人和動(dòng)物的慢性弓形蟲病的神經(jīng)系統(tǒng)致病機(jī)理提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。