陳 浩，敖日格樂，王純潔，斯木吉德，阿日查，張 劍，劉 波

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

牛肉具有低脂肪、低膽固醇、高蛋白及富含微量元素等優(yōu)點(diǎn)，在人們所食用的肉產(chǎn)品中所占份額越來越高[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年我國人均牛肉消費(fèi)量為5.8 kg/人，連續(xù)7年保持上升趨勢；牛肉市場供不應(yīng)求，2018年我國牛肉進(jìn)口量為106萬t，同比增長51.42%[2]。在這一形勢下，國家不斷加大標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖推進(jìn)力度[3]。但由于我國北方地區(qū)冬季低溫環(huán)境極易引起肉牛產(chǎn)生冷應(yīng)激，導(dǎo)致肉牛生產(chǎn)性能及繁殖性能下降，發(fā)病率及死亡率增高，給我國北方肉牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，這嚴(yán)重的限制了我國肉牛產(chǎn)業(yè)的健康迅速發(fā)展[4-6]。

在低溫環(huán)境刺激下，處于冷應(yīng)激狀態(tài)的動物機(jī)體啟動一系列非特異性的自身免疫反應(yīng)緩解應(yīng)激帶來的影響，這個(gè)過程會引起血液中一些生化指標(biāo)的變化，并造成動物機(jī)體免疫功能及抗氧化功能的損傷[7-8]。近年來，對肉雞冷應(yīng)激的研究表明，冷應(yīng)激12 h時(shí)肉雞血清中IgA、IgG極顯著上升，并在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(150 h)仍維持在較高水平[9]。楊莉等[10]通過比較冷應(yīng)激對羊免疫功能的影響，結(jié)果表明冷應(yīng)激后阿勒泰羊和湖羊血清IL-2和IL-4的濃度均呈下降趨勢。KAUSHIK等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激可使 腦、心臟、腎臟的SOD活性顯著下降。有研究報(bào)道冷應(yīng)激狀態(tài)蒙古牛血液中的T3、T4及ACTH濃度相較于非應(yīng)激狀態(tài)下顯著升高[12]。

西門塔爾牛是乳肉兼用品種，原產(chǎn)于瑞士的阿爾卑斯山區(qū)，現(xiàn)已分布許多國家，成為世界上數(shù)量最多，分布最廣的乳肉兼用品種之一[13]。錫林郭勒草原位于我國內(nèi)蒙古自治區(qū)北部高寒地區(qū)，寒冷期長達(dá)7個(gè)月，極端低溫可至―42.4℃，該地區(qū)西門塔爾牛飼喂方式以粗放的放牧為主，因此在冬春兩季長時(shí)間遭受冷應(yīng)激侵?jǐn)_[12]。

目前，關(guān)于動物冷應(yīng)激的研究較少，關(guān)于冷應(yīng)激對放牧牛血液生化指標(biāo)影響的研究報(bào)道更少。因此，本研究擬以放牧西門塔爾母牛為試驗(yàn)群體，檢測試驗(yàn)個(gè)體在冷應(yīng)激與非應(yīng)激狀態(tài)下的血液生化指標(biāo)，探討冷應(yīng)激對西門塔爾母牛免疫功能、抗氧化功能及血清激素分泌的影響，進(jìn)一步了解冷應(yīng)激對肉牛機(jī)體影響的生理機(jī)制，旨在為我國北方草原放牧肉牛冬季的保溫抗病及冷應(yīng)激相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物及飼養(yǎng)管理以內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗某天然草場提供的16 頭2～4歲，體質(zhì)量為(380±20)kg且健康狀況良好的放牧西門塔爾母牛作為試驗(yàn)動物。試驗(yàn)牛飼養(yǎng)管理方式為全年放牧，自由采食牧草和飲水。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蘇尼特左旗某天然草場進(jìn)行。試驗(yàn)分為2 個(gè)階段進(jìn)行：秋季(2017年9月28-30日)和冬季(2018年1月29-31日)。

1.3 環(huán)境溫濕度測定由于試驗(yàn)是以在天然草場進(jìn)行全年放牧的肉牛為研究對象，所以所測的環(huán)境指標(biāo)均為自然環(huán)境下的溫度和相對濕度。試驗(yàn)期間，測定每天8:00，14:00，20:00的天然放牧草場的溫度和相對濕度，并監(jiān)測記錄試驗(yàn)當(dāng)月的平均氣溫和相對濕度。

1.4 血樣采集在試驗(yàn)期最后1 d清晨對每頭試驗(yàn)牛進(jìn)行頸靜脈采血。用非抗凝采血管采集10 mL血液，靜置0.5 h后3 000 r/min離心10 min，分離制備血清，置于-20℃冰箱中保存供血液生化指標(biāo)的測定

1.5 血液指標(biāo)測定血清中IgA、IgG、IgM、IL-2、IL-4、SOD、MDA、T-AOC、T3、T4、ACTH、GH、GC和TSH含量測定采用酶聯(lián)免疫分析法，試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。血清GLU和BUN使用日立7600生化儀檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析采用Excel 2003對所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理后，使用SPSS 17.0中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差方式表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 肉牛放牧草場試驗(yàn)期溫濕度結(jié)果見表1，2和3。在各試驗(yàn)階段中，秋季放牧草場的最低溫度為12.5℃，最低濕度為41%(表1)。冬季放牧草場的最低溫度為-23.5℃，最低濕度為35%(表2)。根據(jù)監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，秋季放牧草場的月平均氣溫為13℃，濕度為42%，冬季放牧草場的月平均氣溫為17.5℃，平均相對濕度為34%(表3)。

表1 秋季自然放牧環(huán)境的溫濕度

表2 冬季自然放牧環(huán)境的溫濕度

表3 不同季節(jié)平均氣溫和濕度

2.2 不同季節(jié)西門塔爾母牛血清免疫指標(biāo)變化結(jié)果見表4。西門塔爾母牛遭受慢性冷應(yīng)激后，血清中IgA、IgG、IL-2和IL-4的濃度顯著下降(P<0.05)，與非應(yīng)激狀態(tài)相比，IgM的濃度有下降的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同季節(jié)西門塔爾母牛血清免疫指標(biāo)測定結(jié)果

2.3 不同季節(jié)西門塔爾母牛的抗氧化指標(biāo)變化結(jié)果見表5。慢性冷應(yīng)激對西門塔爾母牛SOD活性無顯著影響(P>0.05)，但由于低溫環(huán)境的刺激，冷應(yīng)激狀態(tài)下西門塔爾母牛血清MDA濃度顯著升高(P<0.05)，T-AOC濃度顯著降低(P<0.05)。

表5 不同季節(jié)西門塔爾母牛的抗氧化指標(biāo)測定結(jié)果

2.4 不同季節(jié)西門塔爾母牛血清激素分泌變化西門塔爾母牛在秋季和冬季血清激素分泌測定結(jié)果見表6。冷應(yīng)激使西門塔爾母牛血清中T3、T4和GLU的濃度顯著升高(P<0.05)，GH、GC和ACTH的濃度顯著降低(P<0.05)，兩種應(yīng)激狀態(tài)下TSH和BUN的濃度無明顯變化(P>0.05)。

表6 不同季節(jié)西門塔爾母牛血清激素分泌測定結(jié)果

3 討 論

3.1 慢性冷應(yīng)激對西門塔爾母牛免疫功能的影響細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和一些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)，除了參與免疫調(diào)節(jié)外，細(xì)胞因子在腫瘤、免疫缺陷、自身免疫性疾病及組織代謝等方面也起到一定作用[14]。血清中免疫球蛋白和免疫細(xì)胞因子的濃度可以反映機(jī)體的免疫功能，它們在防止動物機(jī)體遭受病毒感染方面也發(fā)揮著重要作用[15]。IgA、IgM和IgG主要由動物脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成分泌，在機(jī)體特異性免疫中發(fā)揮重要作用[16]。IgG約占血清中總免疫球蛋白的75%，其在體液免疫中起到主要作用，可作為血清學(xué)診斷的抗體[17]。IgM在抗原刺激誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答中最先產(chǎn)生。在機(jī)體早期防御中起著重要作用。血液中的免疫細(xì)胞因子濃度可以反映機(jī)體細(xì)胞免疫的狀態(tài)[18]。IL-2是一種細(xì)胞生長因子，可以調(diào)控動物免疫系統(tǒng)中白血球的細(xì)胞活性，同時(shí)參與抗體反應(yīng)，其主要作用是增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞活性[19]。IL-4主要功能是誘導(dǎo)B細(xì)胞成熟并刺激其產(chǎn)生免疫球蛋白，對于體液免疫具有重要調(diào)節(jié)作用[20]。井霞[21]研究發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激狀態(tài)下奶牛的免疫功能下降或遭到抑制；RYBAKINA等[22]報(bào)道冷暴露可使小鼠機(jī)體的體液免疫受到明顯的抑制。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激狀態(tài)下西門塔爾牛血清中IgA、IgG、IL-2和IL-4含量顯著低于非應(yīng)激狀態(tài)，表明冷應(yīng)激抑制了免疫球蛋白的合成，導(dǎo)致西門塔爾母牛體液免疫功能受損。這可能是由于本試驗(yàn)冬季試驗(yàn)期間在1月份，試驗(yàn)牛在草原上常年放牧，已遭受較長時(shí)間冷應(yīng)激侵襲，長期冷應(yīng)激刺激西門塔爾母牛機(jī)體生成多種血清免疫抑制因子，抑制了白細(xì)胞介素的產(chǎn)生，進(jìn)而影響機(jī)體免疫球蛋白的合成，導(dǎo)致西門塔爾母牛免疫功能嚴(yán)重受損，IL-2的分泌水平對動物機(jī)體免疫球蛋白合成的抑制作用機(jī)制有待進(jìn)行深入研究。

3.2 慢性冷應(yīng)激對西門塔爾母?？寡趸δ艿挠绊懤鋺?yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體的抗氧化平衡遭受破壞導(dǎo)致自由基大量產(chǎn)生，過量的氧自由基可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)生進(jìn)而產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，加劇機(jī)體遭受的氧化應(yīng)激損傷[23]?？寡趸冈谇宄龣C(jī)體內(nèi)自由基及保護(hù)機(jī)體免受過氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮重要作用[24]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量的高低可反映機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化的程度，是代表細(xì)胞損傷的指標(biāo)之一[25]；SOD是酶促反應(yīng)體系中重要的酶，在機(jī)體內(nèi)的主要作用是清除超氧陰離子自由基進(jìn)而防止細(xì)胞損傷，其活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，T-AOC是衡量機(jī)體總抗氧化能力高低的重要指標(biāo)[26-27]。有研究報(bào)道，慢性冷應(yīng)激顯著提高了蒙古牛血清中MDA含量[12]。孟祥坤等[28]通過研究慢性冷應(yīng)激對西門塔爾犢牛的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)在-4.0℃日平均氣溫下，犢牛血清中MDA水平顯著升高，SOD活性顯著下降。有研究指出，大鼠在遭受冷應(yīng)激初期，血清SOD活性升高，但持續(xù)遭受冷應(yīng)激后，SOD活性下降[29]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，冷應(yīng)激導(dǎo)致西門塔爾母牛血清中MDA含量顯著下降，T-AOC水平顯著提高，而SOD活性無顯著變化，表明冷應(yīng)激對西門塔爾母?？寡趸δ茉斐闪擞绊?，SOD活性無顯著變化可能是由于試驗(yàn)牛在初冬遭受冷應(yīng)激時(shí)，由于機(jī)體的代償保護(hù)作用而升高，隨著冷應(yīng)激持續(xù)時(shí)間的延長，SOD活性下降，恰好在本試驗(yàn)冬季采樣期間SOD活性下降到非應(yīng)激狀態(tài)水平，本試驗(yàn)組將在今年冬季進(jìn)行長期監(jiān)測冷應(yīng)激狀態(tài)下肉?？寡趸芰Φ淖兓M(jìn)而對本試驗(yàn)中SOD活性結(jié)果的猜測進(jìn)行驗(yàn)證。

3.3 慢性冷應(yīng)激對西門塔爾母牛血清激素分泌的影響當(dāng)動物遭受冷應(yīng)激侵?jǐn)_時(shí)，其主要的生理反應(yīng)是通過增加產(chǎn)熱以維持恒定的體溫[30]。甲狀腺激素是甲狀腺分泌的激素，主要包括T3和T4。T4是甲狀腺的主要分泌物，全部由甲狀腺細(xì)胞產(chǎn)生；大部分T3由T4脫碘轉(zhuǎn)變而成，其具有加強(qiáng)組織代謝，提高組織產(chǎn)熱量及促進(jìn)糖類吸收等作用[31]。甲狀腺激素的合成和分泌受TSH的控制，其分泌過程與大腦皮層接受的外界刺激相關(guān)[32]。吳永魁[33]通過對仔豬進(jìn)行冷應(yīng)激處理后，發(fā)現(xiàn)血液中T3和T4含量均顯著升高[12-13]。白丹丹等[34]通過比較不同季節(jié)對三河牛血液生化指標(biāo)的影響，研究發(fā)現(xiàn)冬季冷應(yīng)激狀態(tài)下三河牛血清中T3和T4含量均顯著高于春季非應(yīng)激狀態(tài)。另有研究報(bào)道，三河牛在遭受急性冷應(yīng)激后，血清中T3和T4含量均顯著升高[35]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，冷應(yīng)激狀態(tài)下西門塔爾母牛血液中T3和T4含量相對于非應(yīng)激期均顯著升高，這與已有的研究報(bào)道一致，表明慢性冷應(yīng)激通過激活HPT軸，提高了TSH分泌水平，進(jìn)而導(dǎo)致T3和T4含量顯著升高，從而增加產(chǎn)熱以提高西門塔爾母牛對冬季草原低溫環(huán)境的抵抗力。但在本試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激狀態(tài)下西門塔爾母牛血清中TSH含量與非應(yīng)激狀態(tài)下并無顯著性差異，這可能是由于試驗(yàn)牛血液中T3和T4含量升高到一定水平后，通過負(fù)反饋?zhàn)饔靡种屏薚SH的合成與分泌，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。ACTH是腦垂體前葉分泌的激素，其主要作用是增強(qiáng)腎上腺皮質(zhì)合成并釋放GC，GC普遍存在于動物的大腦和垂體內(nèi)，通過調(diào)節(jié)機(jī)體各種代謝以維持內(nèi)環(huán)境的恒定[36-37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，冷應(yīng)激狀態(tài)下西門塔爾母牛血清中ACTH和GC的分泌水平顯著高于非應(yīng)激狀態(tài)，說明西門塔爾母牛在遭受慢性冷應(yīng)激侵襲時(shí)，HPA軸被激活，促進(jìn)ACTH和GC的分泌，增強(qiáng)肝糖原異生為機(jī)體提供能量，進(jìn)而提高機(jī)體對寒冷環(huán)境的適應(yīng)。由于動物機(jī)體各組織器官活動所需能量大部分來自葡萄糖，因此血液中葡萄糖需要保持一定濃度以維持機(jī)體需要[38]。王金濤等[39]研究發(fā)現(xiàn)，冷應(yīng)激狀態(tài)下雛雞血漿葡萄糖含量顯著升高。孟祥坤等[28]報(bào)道冷應(yīng)激狀態(tài)下西門塔爾犢牛血糖水平顯著升高。梁鴻雁等[40]通過研究冷應(yīng)激對荷斯坦奶牛的影響，得出了相同的結(jié)果。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在冬季低溫刺激下，西門塔爾母牛血清中葡萄糖含量顯著升高，這可能是西門塔爾母牛遭受冷應(yīng)激后，皮質(zhì)酮水平升高進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)分解，糖異生作用加強(qiáng)引起的結(jié)果，為機(jī)體增加產(chǎn)熱以對抗低溫環(huán)境。GH是腺垂體細(xì)胞分泌的一類肽類激素，其主要生理作用是促進(jìn)機(jī)體生長發(fā)育，并能夠促進(jìn)分化大多數(shù)免疫細(xì)胞[41]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，冷應(yīng)激期西門塔爾母牛血清中GH水平顯著下降，GH的分泌受垂體的調(diào)節(jié)，可能是由于冷應(yīng)激激活西門塔爾母牛機(jī)體HPT軸，導(dǎo)致其主要生理反應(yīng)為增加機(jī)體產(chǎn)熱而非生長，因此GH的合成和釋放發(fā)生障礙。血清BUN水平可反映動物蛋白質(zhì)代謝狀況，蛋白代謝良好時(shí)其含量較低[42]。有研究報(bào)道冷應(yīng)激導(dǎo)致肉牛糖代謝下降，進(jìn)而促進(jìn)氨基酸分解代謝產(chǎn)生大量尿素，從而血清中BUN含量增加[43]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，冷應(yīng)激對西門塔爾母牛血清中尿素氮含量無顯著影響，可能是由于本試驗(yàn)的冬季試驗(yàn)期是在放牧肉牛遭受兩個(gè)月的冷應(yīng)激后進(jìn)行的，機(jī)體逐漸適應(yīng)了低溫環(huán)境，蛋白的合成及分解都逐漸達(dá)到平衡，因此變化不顯著。冷應(yīng)激對肉牛血清BUN含量的影響機(jī)理，還有待進(jìn)行深入研究。冷應(yīng)激對西門塔爾母牛能力代謝也造成了一定的影響。

內(nèi)蒙古草原冬季低溫刺激使西門塔爾母牛遭受了較大的應(yīng)激損傷，冷應(yīng)激狀態(tài)下的西門塔爾母牛血清中IgA、IgG、IL-2、IL-4、MDA及T-AOC濃度較非應(yīng)激狀態(tài)均產(chǎn)生了顯著變化，表明冷應(yīng)激顯著降低了西門塔爾母牛的免疫功能和抗氧化功能。冷應(yīng)激激活了草原放牧西門塔爾母牛HPA系統(tǒng)，使機(jī)體T3及T4均分泌增多以增加產(chǎn)熱，從而提高西門塔爾母牛對寒冷環(huán)境的抵抗力和適應(yīng)力。