李 敏 董 虹 陳湘漪

(湖北省婦幼保健院婦科,武漢市 430070，電子郵箱： 423611361@qq.com)

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指在妊娠第24周之前重復(fù)發(fā)生2次或2次以上的流產(chǎn)，其在孕齡婦女中的發(fā)病率約為5%[1]。RSA的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，遺傳因素、子宮結(jié)構(gòu)異常、內(nèi)分泌和免疫功能紊亂等都是RSA的危險(xiǎn)因素[2]。其中遺傳因素的作用最為重要，有學(xué)者報(bào)告遺傳因素能解釋50%以上的RSA[3]。

雌激素是生殖過(guò)程中最為關(guān)鍵的類固醇激素之一，其作用主要由雌激素受體(estrogen receptor，ESR)介導(dǎo)。ESR分為ESRα和ESRβ兩種，分別由同名基因ESRα和ESRβ編碼[4]。其中，ESRβ基因位于染色體14q22-24，包含8個(gè)外顯子，其在受精卵著床和胚胎發(fā)育過(guò)程中十分重要。自從Aléssio等[5]率先報(bào)告了ESRβ基因多態(tài)性與RSA之間的關(guān)聯(lián)性，其他研究人員也開展了類似研究，但是得到的結(jié)果并不一致。本文將采用薈萃分析的方法，對(duì)已發(fā)表的研究結(jié)果進(jìn)行合并，以期得到更加可靠的結(jié)果。

1 資料與方法

1.1 檢索策略 計(jì)算機(jī)檢索PubMed、Web of Science、Embase、Cochrane Library、中國(guó)知網(wǎng)和萬(wàn)方6個(gè)電子數(shù)據(jù)庫(kù)。檢索策略為主題詞+自由詞。PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索式為：(“Polymorphism,Single Nucleotide”[Mesh] OR Single nucleotide polymorphism OR Variant OR SNP OR Polymorphism OR Variation OR Mutant OR Mutation)AND(Estrogen Receptor beta OR“Estrogen Receptor beta”[Mesh] OR Receptors,Estrogen,Type Ⅱ OR Estrogen Receptor Type Ⅱ OR Estrogen Nuclear Receptor OR “Receptors,Estrogen”[Mesh] OR Estrogen Receptor)AND(Abortions,Spontaneous OR Spontaneous Abortion OR Early Pregnancy Losses OR Loss,Early Pregnancy OR Pregnancy Loss,Early OR Miscarriage OR Tubal Abortion OR Habitual Abortion OR Recurrent Abortion OR Recurrent Miscarriage OR “Abortion,Spontaneous”[Mesh])。將以上檢索式按Web of Science、Embase和Cochrane Library的檢索要求變換格式后進(jìn)行檢索。中文數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索式為：“流產(chǎn)”AND“雌激素受體”AND“多態(tài)性”。語(yǔ)種不限，檢索時(shí)間為建庫(kù)至2019年5月10日。此步驟由本文前兩位作者分別獨(dú)立完成。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病例-對(duì)照研究或隊(duì)列研究；(2)病例組研究對(duì)象符合RSA的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即在妊娠第24周之前重復(fù)發(fā)生2次或2次以上的不明原因的自發(fā)性流產(chǎn)[1]；(3)涉及ESRβ基因多態(tài)性；(4)病例組和對(duì)照組的研究對(duì)象不少于50例；(5)能夠獲得文獻(xiàn)全文，并且提供病例組和對(duì)照組的基因型頻率，能夠計(jì)算比值比(odds ratio，OR)和95%CI；(6)納入的文獻(xiàn)必須是同行評(píng)審的學(xué)術(shù)論文。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)；(2)動(dòng)物研究；(3)會(huì)議摘要；(4)綜述及病例系列報(bào)道。

1.3 文獻(xiàn)篩選和信息提取 按照預(yù)先制定的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本文前兩位作者分別獨(dú)立完成文獻(xiàn)的篩選。確定文獻(xiàn)符合入選標(biāo)準(zhǔn)后，提取以下信息：第一作者的姓名、發(fā)表年份、開展研究的國(guó)家、種族、流產(chǎn)次數(shù)、樣本量及病例組和對(duì)照組的基因型頻率。此過(guò)程中如果遇到分歧，共同商討解決。

1.4 方法學(xué)質(zhì)量評(píng)價(jià) 本文前兩位作者分別利用紐卡斯?fàn)?渥太華量表(Newcastle-Ottawa Scale，NOS)[6]對(duì)納入文獻(xiàn)的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。NOS采用星級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，由研究對(duì)象的選擇、病例組和對(duì)照組的可比性、暴露因素的測(cè)量3個(gè)方面構(gòu)成，包括8個(gè)條目，共9顆星。當(dāng)納入文獻(xiàn)獲得≥5顆星時(shí)，可視為高質(zhì)量文獻(xiàn)。計(jì)算納入研究的對(duì)照組人群基因頻率是否符合哈迪-溫伯格遺傳平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)[7]；當(dāng)P>0.05時(shí)表明對(duì)照組基因頻率分布符合HWE，選擇人群代表性良好；反之則不符合HWE，選擇人群代表性欠佳。在質(zhì)量評(píng)估過(guò)程中如有分歧，通過(guò)商討解決。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用RevMan 5.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分別計(jì)算出等位基因模型(M/m)、純合子模型(MM/mm)、雜合子模型(MM/Mm)、顯性模型(MM+Mm/mm)及隱性模型(MM vs.Mm/mm)的OR值及其95%CI，其中M為頻率較大的等位基因，m為頻率較小的等位基因。用I2檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估納入研究之間的異質(zhì)性：當(dāng)P≥0.10或I2<50%時(shí)，表明異質(zhì)性較小，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析；當(dāng)P<0.10或I2≥50%時(shí)，表明異質(zhì)性較大，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。為了探索ESRβ基因多態(tài)性和RSA的發(fā)生是否存在種族特異性，根據(jù)種族進(jìn)行亞組分析。Meta分析結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)逐一排除單項(xiàng)研究的方式來(lái)檢測(cè)研究結(jié)果的敏感性。當(dāng)納入研究的數(shù)量不少于10篇時(shí)，利用漏斗圖法來(lái)評(píng)估研究的發(fā)表偏倚。

2 結(jié) 果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 通過(guò)初步檢索共獲得155篇相關(guān)文獻(xiàn)，去除50篇重復(fù)文獻(xiàn)后剩下105篇；通過(guò)閱讀題目和摘要，剔除了86篇明顯不相關(guān)的文獻(xiàn)；閱讀剩余的19篇文獻(xiàn)全文后，發(fā)現(xiàn)有13篇不符合納入標(biāo)準(zhǔn)，將其排除。最終獲得了6篇文獻(xiàn)[5,8-12]。

2.2 納入文獻(xiàn)的基本特征和NOS評(píng)估結(jié)果 納入的6篇文獻(xiàn)包括5篇英文文獻(xiàn)[5,9-12]和1篇中文文獻(xiàn)[8]。3項(xiàng)研究[5,9,12]對(duì)RSA的定義是自發(fā)流產(chǎn)次數(shù)不少于3次，另外3項(xiàng)研究[8,10- 11]對(duì)RSA的定義是自發(fā)流產(chǎn)次數(shù)不少于2次。除了Aléssio等[5]的研究包括高加索人和非洲人，其余研究均在單一種族中開展。6項(xiàng)研究共納入了1 125例RSA患者和870例健康對(duì)照個(gè)體，每項(xiàng)研究的病例組和對(duì)照組的樣本量均超過(guò)50個(gè)。納入的研究共涉及rs1256049、rs4986938和rs1256030這3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中涉及rs1256049多態(tài)性的6項(xiàng)研究[5,8-12]均符合HWE，涉及rs4986938多態(tài)性的5項(xiàng)研究[5,8-11]中有3項(xiàng)[8-10]不符合HWE，涉及rs1256030多態(tài)性的2項(xiàng)研究[8-9]均符合HWE。納入文獻(xiàn)的基本特征見表1。根據(jù)NOS評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，納入的每項(xiàng)研究至少得到了5顆星，均為高質(zhì)量研究，見表2。

表1 納入文獻(xiàn)基本特征

表2 紐卡斯?fàn)?渥太華量表的評(píng)估結(jié)果

2.3 薈萃分析和亞組分析結(jié)果

2.3.1 ESRβ基因rs1256049位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性的關(guān)系：6項(xiàng)研究[5,8-12]報(bào)告了rs1256049位點(diǎn)多態(tài)性與RSA的關(guān)系。在5種遺傳模型下，各研究之間無(wú)明顯的異質(zhì)性，因此均采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在5種遺傳模型下rs1256049位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性均無(wú)關(guān)(均P>0.05)。 見表3。

亞組分析中，除在高加索和非洲人群中，等位基因模型下各研究間存在異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析外，其他均采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在亞洲人群中，隱性模型下rs1256049位點(diǎn)多態(tài)性和RSA有關(guān)(P<0.05)，GG攜帶者患RSA的風(fēng)險(xiǎn)較低；而其他遺傳模型下，rs1256049位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性無(wú)關(guān)(P>0.05)。在高加索和非洲人群中，5種遺傳模型下rs1256049位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性均無(wú)關(guān)(均P>0.05)。見表3。

表3 ESRβ基因rs1256049位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性關(guān)系的Meta分析結(jié)果

2.3.2 ESRβ基因rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性的關(guān)系：5項(xiàng)研究[5,8-11]報(bào)道了rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與RSA的關(guān)系。在5種遺傳模型下，各研究間均無(wú)顯著的異質(zhì)性，故采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示在純合子模型、雜合子模型和顯性模型下，rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性有關(guān)(均P<0.05)，GG和GA攜帶者患RSA的風(fēng)險(xiǎn)較高，但是在等位基因模型和隱性模型下，rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。見表4。

亞組分析中，在亞洲人群中，5種遺傳模型下各研究間均無(wú)顯著的異質(zhì)性，故均采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在亞洲人群中，純合子模型、雜合子模型和顯性模型下，rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性有關(guān)(均P<0.05)，GG和GA攜帶者患RSA的風(fēng)險(xiǎn)較高；但是在等位基因模型和隱性模型狀態(tài)下，rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。在高加索和非洲人群中，5種遺傳模型下rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性和RSA易感性均無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。見表4。

表4 ESRβ基因rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性關(guān)系的Meta分析結(jié)果

2.3.3 ESRβ基因 rs1256030位點(diǎn)多態(tài)性與RSA的關(guān)系：兩項(xiàng)研究[8-9]評(píng)估了rs1256030位點(diǎn)多態(tài)性與RSA的關(guān)系。在5種遺傳模型下各研究間無(wú)異質(zhì)性，故均采用固定效應(yīng)模型分析。結(jié)果顯示，在5種遺傳模型下，rs1256030位點(diǎn)多態(tài)性與RSA的發(fā)生均無(wú)關(guān)(均P>0.05)。見表5。

表5 ESRβ基因 rs1256030位點(diǎn)多態(tài)性與RSA易感性關(guān)系的Meta分析結(jié)果

2.4 敏感性分析及發(fā)表偏倚評(píng)估 在剔除不符合HWE的研究[8-10]后，效應(yīng)值并沒(méi)有發(fā)生翻轉(zhuǎn)，所以本研究并未將其排除。在逐一排除其余各項(xiàng)研究后，研究整體的效應(yīng)值無(wú)顯著改變，表明研究結(jié)果具有良好的穩(wěn)定性。由于納入的原始研究數(shù)量不足10項(xiàng)，利用漏斗圖法檢測(cè)發(fā)表偏倚的誤差較大，所以本研究沒(méi)有利用漏斗圖法對(duì)發(fā)表偏倚進(jìn)行評(píng)估。

3 討 論

RSA是導(dǎo)致妊娠失敗的常見原因之一，且病因十分復(fù)雜。明確其發(fā)病機(jī)制能夠更好地指導(dǎo)疾病的預(yù)防和臨床治療，但是截至目前，RSA的發(fā)病機(jī)制仍不清楚。在過(guò)去的十幾年里，包括ESRβ基因在內(nèi)的很多基因被證實(shí)和RSA的發(fā)生相關(guān)。在亞洲人群、高加索人群和非洲人群中，均有研究報(bào)告ESRβ基因多態(tài)性和RSA易感性的關(guān)聯(lián)性，但是得到的結(jié)果存在很大差異[5，9-12]。

薈萃分析可以克服單一研究樣本量有限和研究對(duì)象代表性差的缺陷。本研究通過(guò)收集并整合現(xiàn)有文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在亞洲人群中ESRβ基因的rs1256049、rs4986938位點(diǎn)多態(tài)性和RSA的發(fā)生有關(guān)(均P<0.05)，其中rs1256049位點(diǎn)的GG攜帶者發(fā)生RSA的風(fēng)險(xiǎn)較低，rs4986938位點(diǎn)的GG和GA攜帶者發(fā)生RSA的風(fēng)險(xiǎn)較高；但是rs1256030位點(diǎn)多態(tài)性與RSA的發(fā)生并無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。此外，在高加索和非洲人群中，ESRβ基因各位點(diǎn)多態(tài)性和RSA的發(fā)生均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)，分析可能有如下原因：(1)納入的高加索和非洲研究對(duì)象和數(shù)量較少，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)效能有限，不足以檢測(cè)到兩者的關(guān)聯(lián)性；(2)亞洲人群和非洲人群、高加索人群的遺傳背景不同，這也可能導(dǎo)致ESRβ基因多態(tài)性和RSA發(fā)生具有一定的種族特異性[13]。具體是哪種原因?qū)е赂呒铀骱头侵奕巳旱年幮越Y(jié)果，仍需要進(jìn)一步研究。

女性生殖系統(tǒng)的正常生理功能主要由下丘腦-垂體-卵巢軸調(diào)控，ESRβ廣泛參與下丘腦-垂體-卵巢軸的生理活動(dòng)[12]。Couse等[14]發(fā)現(xiàn)ESRβ能夠增加子宮頸對(duì)雌二醇的敏感性，后者會(huì)促進(jìn)子宮頸的發(fā)育和成熟，這對(duì)分娩和蛻膜至關(guān)重要。敲除ESRβ基因的雌性小鼠會(huì)出現(xiàn)子宮發(fā)育異常、卵泡生成和排卵功能障礙等嚴(yán)重的生殖功能缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致生育能力顯著降低[15]。Zulli等[16]的研究表明，ESRβ基因多態(tài)性和女性不孕癥有關(guān)。Aléssio等[17]也發(fā)現(xiàn)，ESRβ基因多態(tài)性與血流動(dòng)力學(xué)改變、血栓的形成有顯著關(guān)聯(lián)，而后兩者也是導(dǎo)致妊娠終止的危險(xiǎn)因素之一。Rs1256049、rs4986938和rs1256030是ESRβ基因最為常見和廣泛研究的多態(tài)性位點(diǎn)。這3個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性雖然不會(huì)引起其編碼的氨基酸序列的改變，但是這些多態(tài)性可能是連鎖不平衡的，會(huì)影響基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，從而在RSA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。

盡管本文對(duì)現(xiàn)有的研究結(jié)果進(jìn)行了合并和分析，擴(kuò)大了總體的樣本量，但是仍存在一些局限性需要克服：(1)本研究納入的原始研究主要在亞洲人群中開展，關(guān)于高加索和非洲人群的研究數(shù)量較少，因此，本研究的結(jié)果不一定能反映高加索和非洲人群的真實(shí)情況；(2)同其他復(fù)雜疾病類似，RSA的發(fā)生是由一系列的位點(diǎn)-位點(diǎn)、基因-基因、基因-環(huán)境之間的相互作用共同決定的，本研究只對(duì)ESRβ基因3個(gè)常見的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行了單獨(dú)分析，這可能會(huì)放大或掩蓋單一位點(diǎn)的作用；(3)納入研究對(duì)RSA的定義并不一致，這就可能導(dǎo)致選擇偏倚的發(fā)生；(4)本研究只對(duì)4個(gè)英文數(shù)據(jù)庫(kù)和兩個(gè)中文數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了系統(tǒng)檢索，收錄在其他數(shù)據(jù)庫(kù)的文獻(xiàn)可能會(huì)被遺漏。

綜上所述，在亞洲人群中ESRβ基因的rs1256049、rs4986938位點(diǎn)和RSA的發(fā)生有關(guān)，其中rs1256049位點(diǎn)的GG攜帶者發(fā)生RSA的風(fēng)險(xiǎn)較低，rs4986938位點(diǎn)的GG和GA攜帶者發(fā)生RSA的風(fēng)險(xiǎn)較高。考慮到本研究存在的缺陷，還需要在更大規(guī)模的人群，特別是高加索和非洲人群中開展大樣本的研究，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的結(jié)果。