葉國裕 顧海潮

(云南省中醫(yī)醫(yī)院/云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨傷科一病區(qū)，昆明市 650021，電子郵箱：guoyuye@hotmail.com)

腸道微生物群失調(diào)和微生物感染已涉及多種免疫介導的疾病，如強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)和炎癥性腸病等[1]。AS是一種有較高致殘率的自身免疫性疾病，發(fā)病原因并未十分清楚，目前認為其可能與遺傳、生活環(huán)境、病毒、細菌感染等因素相關(guān)[2]。遺傳因素在AS的發(fā)病中具有重要作用，其中HLA-B27基因與發(fā)病明顯相關(guān)；與AS患病相關(guān)的遺傳因子可能會在共同的環(huán)境因素作用下觸發(fā)疾病[3]。有研究顯示，腸道微生物也參與了AS的發(fā)生與發(fā)展[4]。有學者通過全基因組掃描研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β1、白細胞介素1、殺傷細胞免疫球蛋白樣受體等基因與AS的發(fā)生與發(fā)展存在一定的相關(guān)性，而這些基因?qū)φ{(diào)節(jié)腸道免疫有重要作用[5]。還有研究表明，與健康人群相比，AS患者及其一級親屬患者的腸道通透性有一定程度增加[6]。然而，目前臨床上尚未涉及AS患者腸道微生物菌群特征的研究。鑒于此，本研究使用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)-變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)分析AS患者與健康人群腸道細菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性的差異。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 連續(xù)納入2014年7月至2017年7月期間在云南省中醫(yī)醫(yī)院接受腫瘤壞死因子抑制劑治療的7例AS患者(表1)。納入標準：診斷符合1973年修訂的紐約AS分類標準[7]。排除標準：(1)患者合并其他腸道疾??；(2)曾接受消化系統(tǒng)手術(shù)。1號AS患者入組時仍正在使用非甾體消炎藥(nonsteroidal antiinflammatory drug,NSAID)；3號和4號AS患者自述既往偶爾使用NSAID，并且因胃腸不適而中斷；其他AS患者自述未使用NSAID，但使用對乙酰氨基酚和/或曲馬朵。另納入6例健康對照受試者作為對照。所有研究對象均簽署知情同意書；研究獲得云南省中醫(yī)醫(yī)院倫理研究委員會的批準。所有研究對象的一般資料見表1。

表1 AS患者及健康對照者的一般資料

1.2 糞便收集和糞便干重測定 每例研究對象每月收集1次糞便樣本，每次收集糞便量不少于50 g，共收集4次糞便樣本。將糞便收集在密閉管中，稱重后得到糞便濕重；再將糞便敞開放置于65℃電熱恒溫干燥箱內(nèi)干燥24 h，再次稱重即為糞便干重。為確保樣品均勻性，測定干重后用無菌水(重量和體積比例按照1 g/2 mL計算)將糞便樣品稀釋，然后在無菌塑料袋中快速捏合約5 min；將每份樣品等分為兩份，一份用于DNA提取，其余-20℃下保存待用。

1.3 DNA提取和量化 將稀釋后的200 mg糞便樣品置于離心管中，加入1.4 mL ASL緩沖液(武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：120316)后在95℃下反應5 min，然后根據(jù)QIAamp DNA Stool Mini Kit糞便DNA基因組提取試劑盒(德國QIA GEN公司，批號：51504)的說明進行DNA提取。將提取的DNA溶解于50 μL緩釋液AE洗脫緩沖液(武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號：100523)。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA的質(zhì)量，在UV20紫外透照儀(美國Hoefer公司)上顯影并照相。

1.4 PCR-DGGE分析 使用PCR-DGGE技術(shù)來評估各個糞便標本中的微生物群落分布。(1)PCR擴增：為了提高PCR產(chǎn)物的特異性，本研究使用巢式PCR進行擴增。第一步擴增采用的引物為16s1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和16s2：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′，再使用第二套引物PRBA338f：5′-CGC CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3′對第一輪PCR擴增的產(chǎn)物進行第二輪PCR擴增[8-9]。通過PCR擴增細菌16S rRNA基因V3區(qū)(5′-ATTA CCG CGG CTG CTGG-3′)[10]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。采用GC夾技術(shù)(序列為：CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGC)夾在正向或反向引物的5′-末端，以防止DNA完全變性為單鏈，可改善變性凝膠中的帶分辨率。最終的PCR反應混合物包含緩沖液5 μL、 25 mmol/L MgCl24 μL、20 mg/mL牛血清白蛋白2.5 μL，每個引物(母液濃度為25 μM)各0.75 μL， 5 U/μL Taq聚合酶1 μL和DNA模板1 μL 。采用兩步法進行PCR擴增，第一輪與第二輪的擴增條件均為94℃ 5 min，然后進行30個循環(huán)的92℃變性30 s，55℃退火30 s和72℃延伸30 s；最后在72℃進行15 min延伸。選擇Hind Ⅲ Digest DNA Marker(上海超研生物科技有限公司，批號：IP67Q)平行電泳作為分子量標準來證實PCR擴增產(chǎn)物。在紫外透照儀上觀察凝膠并照相。(2)灌制變性梯度膠：參照DGGE的最佳適用范圍，本實驗中使用8%的丙烯酰胺凝膠，并按照標準流程進行灌膠。(3)電泳：DGGE切膠后做PCR擴增[11]。在變性梯度范圍為25%～50%、45%～60%、35%～65%的8%聚丙烯酰胺凝膠上分離相等質(zhì)量的PCR產(chǎn)物。電泳條件為50 V 10 min，然后切換至200 V 5.5 h，溫度保持在60℃。(4)染色及拍照：使用SYBR GreenⅠ核酸染色劑2 μL(上海超研生物科技有限公司，批號：201405)對丙烯酰胺凝膠進行凝膠染色，在紫外透照儀上觀察并拍照。(5)細菌DGGE帶形譜和序列分析：根據(jù)條帶的存在與否計算DGGE譜中條帶模式之間的相似性并以相似系數(shù)表示。DGGE膠通過掃描儀輸入計算機，用Molecular Analysis軟件進行相似性聚類分析，通過序列相似性水平劃分得到各樣品間可操作分類單元，對每個群落的簇進行分類鑒定；在經(jīng)DGGE分析后得到的指紋圖譜中，每個條帶代表某個微生物優(yōu)勢菌群，經(jīng)測序和序列比對，得出優(yōu)勢菌群的種類，最終獲得AS患者和健康對照受試者中糞便微生物群多樣性的樹狀圖。應用R語言擴展包vegan軟件分析糞便微生物群落主坐標(principal coordinate analysis,PCoA)，導入原始的OTU豐度表格文件，加載vegan包，計算樣本間距離，對樣本進行PCoA排序分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析 本實驗每個時期的處理均進行3個重復，以考慮分析變異性，最終取平均值進行統(tǒng)計。使用SAS(版本9.1)軟件分析DNA含量；采用SPSSAU軟件進行置換多元方差分析檢驗糞便微生物群落與AS之間的關(guān)系。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 糞便微生物群的PCR-DGGE分析結(jié)果 圖1顯示了25%～65% DGGE糞便樣品的微生物指紋圖譜。在聚丙烯酰胺凝膠上分離出的186條DNA帶中，大部分在35%～55%變性梯度之內(nèi)。分別在每例AS患者和健康對照受試者的樣品中發(fā)現(xiàn)10～16個和13～19個條帶的DNA片段。所有條帶均被切割和識別，基于超過97%的同一性，僅成功鑒定出37個條帶。圖1所示的PCR-DGGE圖譜的樹狀圖根據(jù)未識別和已鑒定的條帶的位置而建立，并被分為A和B兩個簇，其中簇A由所有健康對照者(HC1至HC6)組成，簇B由所有AS患者(AS1至AS7)組成。

圖1 糞便微生物群的PCR-DGGE分析圖譜

2.2 經(jīng)PCR-DGGE測定獲得的細菌 共檢測到11種菌屬。擬桿菌屬和普拉梭菌是簇A中檢測到的主要細菌，其含有受試者HC1、HC2、HC3、HC4、HC5和HC6，而僅在健康對照受試者HC2中檢測到羅斯拜瑞氏菌和普氏菌。普拉梭菌和普氏菌是簇B中檢測到的主要細菌，在所有AS患者中均檢測到，但僅在AS1中檢測到羅斯拜瑞氏菌和AS5中檢測到大腸梭菌。見表2。

表2 PCR-DGGE測定獲得細菌

2.3 糞便微生物群落與AS之間的關(guān)系 在R語言擴展包vegan軟件中利用箱形圖可視化兩組微生物群的Alpha多樣性指數(shù)，Alpha多樣性盒圖(圖2)顯示，AS樣品中微生物多樣性(即觀察到的物種)為(664±132)個種類，而健康對照者為(483±246)個種類；置換多元方差分析結(jié)果顯示，AS患者與健康對照者之間的糞便微生物群落多樣性差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

圖2 健康對照者與AS患者的糞便微生物構(gòu)成數(shù)量

糞便微生物群落 PCoA分析顯示，在分析圖中AS樣本的分布較分散，樣品間距離較遠，糞便微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大；而健康對照者樣本分布較聚集，糞便微生物群落結(jié)構(gòu)相似性高，見圖3；UniFrac距離分析顯示，生物學重復和技術(shù)重復之間的差異小于個體和疾病狀態(tài)之間的差異(P<0.001)，表明疾病是影響糞便微生物群落差異的主要因素，見圖4。

圖3 健康對照者與AS患者糞便微生物群落PCoA的二維排序

圖4 UniFrac距離分析(*P<0.001)

3 討 論

越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群失調(diào)在一些脊椎病的發(fā)病中扮演著重要角色，包括脊柱關(guān)節(jié)炎和AS。最新研究顯示，與健康對照組相比，AS患者的回腸末端有離散的微生物特征[12]。本研究利用16S rRNA圖譜對AS患者腸道菌群的表征進行了分析和鑒定，結(jié)果顯示，AS患者和健康受試者的腸道菌群多樣性存在明顯差異(P<0.05)；PCoA分析提示與健康受試者相比，AS患者糞便中存在離散的微生物特征，這證實了上述報道結(jié)果，表明不同疾病患者的菌群分布差異并不是因為總體菌群數(shù)量差異引起的，而是與腸道菌群的多樣性有關(guān)。而PCoA分析僅能顯示AS患者與健康對照者的糞便微生物群落結(jié)構(gòu)差異，后期將需要更大規(guī)模的研究來確定涉及的單個細菌種類。此外，平均UniFrac距離顯示，生物學重復和技術(shù)重復之間的差異小于個體和疾病狀態(tài)之間的差異(P<0.05)，進一步證實疾病狀態(tài)與微生物群落組成之間的關(guān)系，表明微生物群落組成的差異不是由于標本中的異質(zhì)性或缺乏技術(shù)可重復性導致的，而主要是由疾病導致的。 研究表明，隨著群落多樣性的增加，微生物的總體數(shù)量沒有變化，這表明某種特定微生物的過度生長或優(yōu)勢地位并不能驅(qū)動特征改變[13]。然而，有小鼠實驗表明，腸道菌群的整體組成以及特定微生物的存在和/或缺失都可能對宿主的反應、炎癥的調(diào)節(jié)和腸道細胞的發(fā)育產(chǎn)生重大影響[14]。有學者在K/BxN小鼠關(guān)節(jié)炎模型中發(fā)現(xiàn)，將寄生于腸道的分枝絲狀細菌引入無細菌的小鼠中，就足以恢復Th17細胞至正常表達水平，導致自身抗體和關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生；而當白細胞介素17加入特定的無致病K/BxN小鼠中進行中和時，可防止關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[15]。因此，單個共生微生物通過其促進特定T輔助細胞亞群的能力，可以驅(qū)動免疫介導的疾病。

本研究發(fā)現(xiàn)不同AS患者的糞便樣品微生物群落組成存在很大差異。目前已發(fā)現(xiàn)毛螺菌屬、瘤胃菌科和普氏菌與結(jié)腸炎和克羅恩氏病有很強的相關(guān)性，特別是普氏菌可在胃腸道中引發(fā)強烈的炎癥反應[16]。本研究中，普氏菌是在AS患者中檢測到的主要細菌，且在所有AS患者均檢測到。普氏菌(DSM 18305)的基因組分析表明，該物種含有炎癥基因，這些基因可能分別編碼炎癥因子釋放所必需的調(diào)控激素[17]，而這可能解釋了為什么大多數(shù)普氏菌是在AS患者中發(fā)現(xiàn)的。

目前認為HLA-B27與AS強烈關(guān)聯(lián)，已有學者在HLA-B27轉(zhuǎn)基因的脊柱關(guān)節(jié)炎大鼠模型中觀察到腸道微生物組中普雷沃氏菌科增加和理研菌科減少，表明潛在的宿主遺傳學功能可能在改變腸道微生物群中發(fā)揮作用[18]；并推測HLA-B27通過影響腸道微生物群而誘導AS，反過來驅(qū)動誘發(fā)脊椎關(guān)節(jié)炎的免疫過程(如IL-23的產(chǎn)生)[19-20]。因此，將來我們還需要進一步研究腸道微生物組成的變化是否與宿主遺傳學有關(guān)，區(qū)分宿主基因組和免疫系統(tǒng)與腸道菌群之間的因果關(guān)系，以及宿主遺傳學如何影響患者的腸道微生物群落的整體功能，包括微生物群落如何形成免疫應答并影響炎癥，以更好地解釋AS的發(fā)病機制。

總之，AS患者和健康人群腸道細菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性存在差異，健康人群往往具有較高的擬桿菌屬豐度，而AS患者具有較高的普氏菌豐度；腸道微生物組成可能與AS有關(guān)。這或可為AS的診療提供有用的數(shù)據(jù)。