彭東，蔣雪薇,2*，陳幽，陳進(jìn)，張偉，周慧,2，吳燦，方勤軍

1(長(zhǎng)沙理工大學(xué) 化學(xué)與食品工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410114) 2(湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙，410600) 3(加加食品集團(tuán)股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙，410600)

醬油是經(jīng)微生物發(fā)酵而成的一種傳統(tǒng)調(diào)味品，因其獨(dú)特的風(fēng)味而廣受消費(fèi)者的喜愛[1]。醬油釀造工藝在我國(guó)主要有低鹽固態(tài)發(fā)酵、傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)發(fā)酵(曬露法)及現(xiàn)代高鹽稀態(tài)發(fā)酵3種方式[2]。近年來，國(guó)內(nèi)大型企業(yè)大多采用現(xiàn)代高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝，但該工藝采用的封閉式發(fā)酵在減少醬油污染菌的同時(shí)，也減少了一些有利于醬油的風(fēng)味菌，導(dǎo)致醬油風(fēng)味物質(zhì)不足。因此，要想在封閉發(fā)酵系統(tǒng)及較高鹽濃度下獲得風(fēng)味上乘的釀造醬油，加快選育高耐鹽的風(fēng)味菌是最主要的解決途徑。

生香酵母是一類以代謝合成酯類物質(zhì)為主，同時(shí)還能促進(jìn)醇、醛、酚等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的酵母菌[3-4]。國(guó)內(nèi)的生香酵母最早應(yīng)用于白酒以彌補(bǔ)酒香的不濃郁，隨后擴(kuò)展到醬油[5]、黃酒[6]、面包[7]及果醋[8]等發(fā)酵食品中應(yīng)用。目前應(yīng)用于醬油增香的酵母菌主要包括魯氏酵母(S酵母)、球擬酵母(T酵母)以及部分假絲酵母屬(C酵母)[5]，而對(duì)其他種屬酵母菌的研究還相對(duì)較少。因此，篩選醬油釀造生香酵母，研究其生香特性及應(yīng)用成為醬油釀造微生物的重要研究方向之一。本文從高鹽稀態(tài)醬醪中篩選出生香優(yōu)良的耐高鹽酵母，添加于高鹽稀態(tài)醬醪中，通過分析它們產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量來研究生香特性，有利于增加醬油釀造酵母的菌種資源，為高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝提供優(yōu)質(zhì)的發(fā)酵菌種，同時(shí)為解析高鹽環(huán)境中酵母的生香機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高鹽稀態(tài)醬醪，取自于湖南某醬油廠；黃豆芽，市售；三丁酸甘油酯(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；2-甲基-3-庚酮(內(nèi)標(biāo)物，99.5%，色譜純)，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；酵母基因組DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；TaqDNA聚合酶，上海生工生物工程有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

豆芽汁培養(yǎng)基[9]。

透明圈篩選培養(yǎng)基：酵母膏10 g，三丁酸甘油酯4 mL，NaCl 100 g，瓊脂粉2 g，加入1 000 mL蒸餾水，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.3 儀器與設(shè)備

ARZ-200游標(biāo)卡尺，青島美吉特精密儀器工具有限公司；UV1800紫外可見分光光度計(jì)，日本島津公司；ZWY-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；VERITIPCR擴(kuò)增儀，美國(guó)ABI公司；YRE2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；436 GC/EVOQ TQ/PAL氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)布魯克科技有限公司；Rxi-5Sil MS色譜柱，美國(guó)Restek公司；65 μm PDMS/DVB固相微萃取針，美國(guó)Supelco公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 耐鹽酵母的分離純化

將高鹽稀態(tài)醬醪樣品進(jìn)行梯度稀釋后，吸取0.1 mL(10-4、10-5、10-6樣品稀釋液)涂布于含100 g/L NaCl的豆芽汁培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度進(jìn)行3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，挑選疑似酵母菌的單菌落進(jìn)行鏡檢，將初步鏡檢結(jié)果為酵母菌的菌株在含100 g/L NaCl的豆芽汁平板上進(jìn)一步分離純化獲得純培養(yǎng)菌株。

1.4.2 產(chǎn)酯酵母的篩選

1.4.2.1 透明圈法初篩

將初篩得到的酵母菌采用點(diǎn)種的方式接種于透明圈篩選培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)2～3 d觀察產(chǎn)生的變色圈現(xiàn)象，使用游標(biāo)卡尺精確測(cè)量透明圈直徑D及菌落直徑d，并計(jì)算D/d，每個(gè)菌進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.4.2.2 產(chǎn)酯能力復(fù)篩

將初篩得到的酵母菌取1 mL 108CFU/mL接種于100 mL含100 g/L NaCl的豆芽汁液體培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7 d，再將培養(yǎng)的菌體培養(yǎng)液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 ℃下蒸餾30 min得到菌體培養(yǎng)液餾分，用回流皂化法[10]測(cè)其中的總酯含量，每個(gè)菌進(jìn)行3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，篩選出總酯積累量高的菌株。

1.4.3 耐鹽產(chǎn)酯酵母的鑒定

1.4.3.1 耐鹽產(chǎn)酯酵母的生理生化特性

將復(fù)篩得到的酵母菌進(jìn)行糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、碳/氮源同化實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)類淀粉實(shí)驗(yàn)及產(chǎn)脲酶實(shí)驗(yàn)，具體參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[11]。

1.4.3.2 耐鹽產(chǎn)酯酵母的26S rDNA序列分析

采用酵母基因組DNA提取試劑盒提取酵母菌模板DNA，進(jìn)行PCR。PCR擴(kuò)增：使用酵母菌的通用引物(NL1：5’-GCATATCAATAAGCGGAAAAG-3’；NL4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)；采用50 μL的PCR反應(yīng)體系：2 μL模板DNA，2 μL NL1，2 μL NL4，5 μL 10×PCR Buffer，3 μL Mg2+(25 mol/L)，1 μL dNTP(10 mol/L)，1 μLTaqDNA聚合酶(5 U/μL)，ddH2O補(bǔ)齊至50 μL；PCR反應(yīng)條件基于高潔等[12]的方法并進(jìn)行了優(yōu)化。具體為：95 ℃預(yù)熱1 min，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃末端延伸7 min，4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)。

測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司武漢分公司完成。測(cè)序結(jié)果在NCBI庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，并通過MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.4 菌種性能測(cè)試

將鑒定的酵母菌分別接種于含100、160 g/L NaCl的豆芽汁液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min下培養(yǎng)48 h，在0～48 h內(nèi)每隔4 h取樣測(cè)OD570值，繪制生長(zhǎng)曲線，并在48 h時(shí)取樣倒平板計(jì)算活菌數(shù)。在28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)7 d，使用回流皂化法測(cè)定總酯含量。

1.4.5 生香特性分析

1.4.5.1 感官分析

將所分離鑒定的酵母菌接種于160 g/L NaCl豆芽汁液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7 d，感官評(píng)定實(shí)驗(yàn)嗅聞其香氣[13]。

1.4.5.2 高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵工藝

將500 g成品曲與1 L鹽水(230 g/L NaCl)混合，置于28 ℃下恒溫發(fā)酵。將3種酵母制備成107CFU/mL的菌懸液，采用高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵，第30天分別加入5 mL 3株酵母的菌懸液，繼續(xù)發(fā)酵30 d，總發(fā)酵周期為60 d，對(duì)照組為未添加酵母發(fā)酵的醬醪。在發(fā)酵結(jié)束后通過壓榨醬醪獲得醬油。

1.4.5.3 SPME-GC-MS分析

固相微萃取(solid-phase micro extraction, SPME)：取壓榨醬油，添加5 μL質(zhì)量濃度為0.816 μg/μL的2-甲基-3-庚酮甲醇溶液作為內(nèi)標(biāo)物[14]，總體積為2 mL，在50 ℃下加熱振蕩25 min，吸附20 min后進(jìn)樣；GC條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，程序升溫，40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min，載氣為高純He，流速為1.0 mL/min，分流比為10∶1；MS條件：EI離子源。電子能量70 eV，發(fā)射電流200 μA，離子源和傳輸線溫度為250 ℃，質(zhì)量掃描范圍m/z30～500。揮發(fā)性化合物定性分析[15]：采用NIST14譜庫(kù)進(jìn)行檢索比對(duì)樣品中所含化合物，再與保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜比對(duì)來確定化合物結(jié)構(gòu)。

揮發(fā)性化合物半定量按公式(1)計(jì)算[16]：

(1)

式中：C1，揮發(fā)性化合物濃度；C2，內(nèi)標(biāo)物濃度；A1，揮發(fā)性化合物峰面積；A2，內(nèi)標(biāo)物峰面積。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22軟件進(jìn)行方差分析，并通過多重字母標(biāo)記法(Duncan’s)進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05)[17]、Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽酵母的分離純化

高鹽稀態(tài)醬醪中存在一些天然接種的酵母，因長(zhǎng)期在高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)，具有了較好的耐鹽能力，選擇高鹽稀態(tài)醬醪，采樣分離耐鹽酵母，在豆芽汁平板上挑選典型酵母菌單菌落進(jìn)行分離純化，得到3種形態(tài)的酵母菌34株，將其命名為CS2.20～CS2.53，其菌落及菌體形態(tài)見圖1。

圖1 三種酵母菌的菌落及菌體形態(tài)(40×16)

圖1-a中的酵母菌菌落為乳白色、邊緣整齊、呈圓形、較厚、不透明，表面較濕潤(rùn)，菌體形態(tài)為橢圓形，芽殖，無假菌絲；圖1-b中的酵母菌落為乳白色、邊緣整齊、呈圓形、較厚、不透明，表面較粗糙，橢圓形菌體，芽殖，無假菌絲；圖1-c中的酵母菌落為乳白色、邊緣整齊、呈圓形、較厚、不透明，表面較濕潤(rùn)，橢圓形菌體，芽殖，有假菌絲。

2.2 耐鹽產(chǎn)酯酵母的篩選

酯類物質(zhì)在微生物細(xì)胞中主要由酯化反應(yīng)產(chǎn)生，其關(guān)鍵酶為酯化酶，酯化酶活力大小能反映其合成酯類物質(zhì)能力[18]。酯化酶是一種同工酶，既能催化酸和醇合成酯，也能水解酯形成酸和醇[19]，因此，可以利用酵母菌產(chǎn)生的酯酶水解三丁酸甘油酯形成的透明圈[20]與菌落直徑比(D/d)值大小來判斷其酯酶活力。在圖2-a中，D/d>2.0的酵母菌有5株，為CS2.23、CS2.30、CS2.31、CS2.42及CS2.53，D/d分別為2.1、2.5、2.5、3.0及2.6。總酯是耐鹽酵母在生長(zhǎng)代謝中產(chǎn)生酯類物質(zhì)的總量，是判斷生香酵母產(chǎn)香能力的重要指標(biāo)[21]。在圖2-b中，總酯含量>1.00 g/L的酵母菌一共有4株，包括CS2.23、CS2.24、CS.2.42及CS2.53，酯含量分別為1.18、1.16、1.51及1.46 g/L。

a-耐鹽產(chǎn)酯酵母的D/d值;b-耐鹽產(chǎn)酯酵母的總酯含量

透明圈菌落直徑比(D/d)值的大小能較好地反映菌株的酯化酶活力，通過透明圈法初篩的5株菌中的3株菌，液體發(fā)酵條件下總酯積累量高，因此，在篩選量較大的情況下，透明圈法能比較準(zhǔn)確地初篩獲得產(chǎn)酯良好的菌株。酯化酶催化的酯化反應(yīng)是酵母菌中合成酯類物質(zhì)的重要途徑，但這條途徑合成速率較慢，故透明圈法初篩的菌株需進(jìn)一步驗(yàn)證其產(chǎn)酯能力?？傰t能直觀反映酵母菌利用所有途徑獲得的產(chǎn)酯量，但培養(yǎng)體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)產(chǎn)酯有較大的影響。醬油發(fā)酵體系中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較豆芽汁培養(yǎng)基豐富，且發(fā)酵時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)，故選擇酯化酶活力和總酯測(cè)量值均較高的酵母菌CS2.23、CS2.42、CS2.53進(jìn)行生香特性研究。

2.3 耐鹽產(chǎn)酯酵母的鑒定

如圖3-a所示，3株菌的擴(kuò)增條帶分離明顯無拖尾，長(zhǎng)度在600 bp左右。將篩選得到的3株菌的PCR產(chǎn)物進(jìn)行26S rDNA序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3-b。

a-26S rDNA 凝膠電泳圖;b-系統(tǒng)發(fā)育樹

為了更加準(zhǔn)確地判斷3株酵母菌的種屬，對(duì)3株菌的生理生化特性進(jìn)行研究，結(jié)果如表1所示。從表1可以看出，CS2.23、CS2.53只能利用葡萄糖，CS2.42能利用葡萄糖、麥芽糖；CS2.23不能同化山梨糖、海藻糖、乳糖及可溶性淀粉，CS2.42不能同化乳糖、可溶性淀粉及檸檬酸，CS2.53不能同化乳糖；CS2.23、CS2.53均能利用KNO3和NH4NO3兩種氮源，CS2.42只能利用KNO3；3株菌均不能產(chǎn)生類淀粉及脲酶。參考《酵母菌的特征及鑒定手冊(cè)》分析生理生化特性，根據(jù)NCBI比對(duì)的結(jié)果最終判斷CS2.23為粉狀畢赤酵母(Millerozymafarinosa)、CS2.42為魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、CS2.53為近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)。

表1 三株酵母菌的生理生化特性

2.4 耐鹽產(chǎn)酯酵母的菌種性能研究

耐鹽產(chǎn)酯酵母在高鹽下能正常生長(zhǎng)是其能在高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵中應(yīng)用的基本前提。高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵中，NaCl質(zhì)量濃度一般在160 g/L左右，隨著人們對(duì)健康越來越重視，100～120 g/L NaCl的減鹽發(fā)酵成為當(dāng)前的關(guān)注熱點(diǎn)。對(duì)3株菌在高鹽(160 g/L NaCl)和低鹽(100 g/L NaCl)環(huán)境下的菌種性能進(jìn)行考察，結(jié)果見圖4。在圖4-a中隨著NaCl濃度的提高，3株菌的生長(zhǎng)能力有所下降，菌株CS2.23的OD570下降6.4%，CS2.42下降9.05%，CS2.53下降14.47%，但仍然保持較好的生長(zhǎng)特性；不同鹽濃度下3株菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)比較接近，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的起始時(shí)間由低鹽培養(yǎng)的4 h推遲到高鹽培養(yǎng)的12 h，醬油的高鹽稀態(tài)發(fā)酵周期一般為6個(gè)月，3株菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期延緩的8 h對(duì)于長(zhǎng)周期的醬油發(fā)酵不會(huì)產(chǎn)生影響。在圖4-b中隨著NaCl濃度提高，3株菌的活菌數(shù)有所下降，在高鹽環(huán)境下3株菌的活菌數(shù)均維持在106CFU/mL左右，說明其在高鹽環(huán)境均具有較好的繁殖能力，能獲得≥106CFU/mL的活菌進(jìn)行醬醪發(fā)酵。在圖4-c中隨著NaCl濃度提高，3株菌的總酯好了呈下降趨勢(shì)，總酯含量與活菌數(shù)量呈正相關(guān)，說明菌株的生長(zhǎng)能力影響了菌株的代謝產(chǎn)酯能力；在高鹽環(huán)境下3株菌的總酯含量下降了0.5 g/L左右，但均在0.7 g/L以上，仍具有較好的產(chǎn)酯能力，適合進(jìn)一步應(yīng)用于高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵。

a-不同NaCl質(zhì)量濃度下的酵母菌生長(zhǎng)曲線;b-不同NaCl質(zhì)量濃度下的活菌數(shù);c-不同NaCl質(zhì)量濃度下的總酯含量

2.5 耐鹽產(chǎn)酯酵母生香特性研究

菌種產(chǎn)酯能力強(qiáng)并不能說明其在發(fā)酵過程中能增香，因此，在進(jìn)行高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵前，有必要對(duì)菌種發(fā)酵液的香氣進(jìn)行初步的嗅聞分析。為縮短發(fā)酵時(shí)間，采用160 g/L NaCl豆芽汁液體培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)所篩選的3株菌，經(jīng)嗅聞測(cè)試發(fā)現(xiàn)3株菌均無不良?xì)馕叮褻S.23具有水果香、麥芽香，CS2.42具有濃郁的水果香、玫瑰花香，CS2.53具有水果香，適合進(jìn)一步用于醬油釀造分析。為了進(jìn)一步探明3株菌的香氣成分及濃度，將這3株菌添加至高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵，共檢測(cè)出46種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)(表2)。添加CS2.23、CS2.42及CS2.53發(fā)酵的醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量較對(duì)照組分別提高了81.30%、140.00%及87.87%，均有較大提升，說明3株酵母可作為醬油釀造生香酵母使用。但3株菌產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量還存在較大的差異，故而出現(xiàn)了香氣嗅聞結(jié)果不同的現(xiàn)象。

表2 三株酵母菌發(fā)酵醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

續(xù)表2

酯類物質(zhì)是醬油中關(guān)鍵的一類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要由生香酵母產(chǎn)生的酶催化前體物質(zhì)合成[29]。從表2可知，添加3株菌的發(fā)酵醬油中一共定量檢出17種酯類物質(zhì)，在添加菌株CS2.23、CS2.42及CS2.53的發(fā)酵醬油中數(shù)量分別為12、15及16種，較對(duì)照組分別增加了3、6及7種，而相應(yīng)的含量也比對(duì)照組提高了188.60%、296.13%及226.87%。揮發(fā)性酯類物質(zhì)總含量排序?yàn)镃S2.42>CS2.53>CS2.23，這與總酯測(cè)量值排序結(jié)果一致，說明3株菌所積累的揮發(fā)性酯類物質(zhì)含量與總酯含量呈正相關(guān)的關(guān)系。因此，添加生香酵母發(fā)酵可以通過增加酯類物質(zhì)的數(shù)量及含量提升醬油香氣成分的豐富度。在添加3株菌發(fā)酵醬油檢出的酯類物質(zhì)中，最多的是乙酯類(13種)，這可能是由于3株菌具備較好產(chǎn)乙醇能力，在發(fā)酵后期，乙醇進(jìn)一步與有機(jī)酸經(jīng)酯酶催化合成乙酯所致。所檢出的乙酯類物質(zhì)主要是具有水果香的乙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯，具有甜奶油香的乳酸乙酯，花果香的月桂酸乙酯及蠟香的棕櫚酸乙酯等，它們給醬油提供了前香、主體香及尾香的物質(zhì)構(gòu)成。乙酯類物質(zhì)中含量增加最明顯的是乙酸乙酯，在添加生香酵母CS2.23、CS2.42及CS2.53的發(fā)酵醬油中含量分別比對(duì)照組提高了387.60%、533.84%及465.01%，這為其發(fā)酵醬油前香及主體香的構(gòu)成奠定了重要的物質(zhì)基礎(chǔ)，乙酸乙酯也成為添加3株菌在酯類物質(zhì)風(fēng)味特征上的重要成分。除此以外，3株菌發(fā)酵醬油中還檢測(cè)到2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、苯甲酸乙酯及14-甲基十五烷酸甲酯，這些物質(zhì)在對(duì)照組中未檢出，為3株菌形成特色的酯類香氣提供了基礎(chǔ)。

醇、醛、酚是除酯類物質(zhì)之外比較重要的幾類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。醇類物質(zhì)主要由酵母菌經(jīng)糖酵解或Enrlich途徑產(chǎn)生[30]，是醬油中醇香風(fēng)味的來源、同時(shí)為酯類物質(zhì)的形成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。添加菌株CS2.23、CS2.42及CS2.53的發(fā)酵醬油中分別定量檢出醇類物質(zhì)7、8及7種，與對(duì)照組(7種)在數(shù)量上無明顯差異，但含量有較大的提升，分別較對(duì)照組提升了91.55%、163.04%及87.19%。添加3株菌的發(fā)酵醬油中，乙醇均比對(duì)照組有明顯提升，乙醇是醬油醇香的主要來源，也是形成乙酯的重要物質(zhì)，其構(gòu)成了醬油的基礎(chǔ)香氣。添加CS2.23的發(fā)酵醬油中3-甲基-1-丁醇及2,3-丁二醇含量是3株菌中最高的，且較對(duì)照組提升明顯；3-甲基-1-丁醇具有麥芽香，能賦予醬油香氣的濃郁感；2,3-丁二醇具有水果香，能氧化生成乙偶姻，進(jìn)一步生成吡嗪類物質(zhì)，形成醬油的焦香。添加CS2.42的發(fā)酵醬油中除乙醇外，1-辛烯-3-醇及苯乙醇含量是3株菌中最高的，且較對(duì)照組提升明顯；1-辛烯-3-醇具有蘑菇香，除增加醬油香氣的濃郁感外還賦予醬油鮮香醇厚感；苯乙醇具有玫瑰花香，是中國(guó)醬油典型的香氣成分。添加CS2.53的發(fā)酵醬油中除乙醇外，比較典型的香氣物質(zhì)是1-辛烯-3-醇，其含量較對(duì)照組也有比較明顯地提升。醛類物質(zhì)主要來源于氨基酸的降解和微生物的發(fā)酵轉(zhuǎn)化，具有調(diào)和香氣的作用[31]。表2顯示，一共檢測(cè)出5種醛類物質(zhì)，添加3株菌的發(fā)酵醬油中醛類物質(zhì)含量較對(duì)照組有一定的提升，其中添加CS2.42的發(fā)酵醬油中具有水果香的苯乙醛含量在3株菌種最高，較對(duì)照組提升了44.21%；另外，添加CS2.53的發(fā)酵醬油中檢出了少量具有玫瑰香的壬醛。酚類物質(zhì)一共檢測(cè)出4種，添加CS2.53的發(fā)酵醬油中酚類物質(zhì)數(shù)量及含量均為3株菌中最高，其特征香氣物質(zhì)為4-乙基愈創(chuàng)木酚及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，其中4-乙基愈創(chuàng)木酚在其他組中未檢出，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚含量較對(duì)照組提升了136.56%。酮類、酸類、含硫化合物和其他類物質(zhì)在3株菌及對(duì)照組發(fā)酵醬油中的種類和含量變化不大，表明篩選得到的3株菌對(duì)這幾類揮發(fā)性物質(zhì)的影響較小。

從3株菌液體發(fā)酵后的嗅聞試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合SPME-GC-MS分析可知，CS2.23發(fā)酵具有水果香及麥芽香，是由于CS2.23在發(fā)酵中產(chǎn)生了水果香的乙酸乙酯及麥芽香的3-甲基-1-丁醇為主的特征香氣物質(zhì)；CS2.42發(fā)酵具有濃郁的水果香、玫瑰花香則是由于其發(fā)酵產(chǎn)生了乙酸乙酯、苯乙醇、1-辛烯-3-醇及苯乙醛為主的特征香氣物質(zhì)，其中乙酸乙酯及苯乙醛貢獻(xiàn)了水果香，苯乙醇貢獻(xiàn)了玫瑰花香，而1-辛烯-3-醇則形成了濃郁感；CS2.53發(fā)酵的特征香氣物質(zhì)為乙酸乙酯、4-乙基愈創(chuàng)木酚及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，形成的風(fēng)味也是水果香為主風(fēng)味。3株菌的主要特征香氣物質(zhì)均有乙酸乙酯，因其風(fēng)味閾值較低(5.00 μg/L)，故其發(fā)酵的嗅聞特征表現(xiàn)出水果香為基礎(chǔ)香氣，其他特征香氣物質(zhì)的存在形成了3株菌在香氣總體特征上的差異，而揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量及含量較對(duì)照組的明顯增加則構(gòu)成了醬油香氣的豐富度及醇厚感。

3 結(jié)論

本研究從高鹽稀態(tài)醬醪中篩選獲得3株生香優(yōu)良的酵母菌CS2.23(M.farinosa)、CS2.42(Z.rouxii)、CS2.53(C.parapsilosis)。研究菌種性能發(fā)現(xiàn)，3株菌在160 g/L NaCl質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)良好，具有較好的繁殖能力及產(chǎn)總酯能力；3株菌具有不同的生香物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)而形成了不同的香氣特性，酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量較對(duì)照組有明顯的提高，且醇類、醛類及酚類等其他類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)也有一定的提升。研究顯示，分離自高鹽稀態(tài)醬醪的3株耐鹽生香酵母有不同的產(chǎn)酯生香特性，具備醬油釀造生香酵母的開發(fā)潛力。