郭佳，王娉，周繼福,3，趙曉美，劉繼鋒，陳穎*

1(中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，北京,100176) 2(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津,300457) 3(南京財經(jīng)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京,210046)

菌落總數(shù)是指食品樣品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得每克(或每毫升)樣品中形成的微生物菌落數(shù)[1]，是評價食品衛(wèi)生情況的重要性指標(biāo)。目前檢測食品中菌落總數(shù)的方法有顯色培養(yǎng)基法、測試紙片法、電阻抗技術(shù)法、ATP生物發(fā)光技術(shù)法、流式細(xì)胞術(shù)檢測法和自動化儀器分析方法等。其中，顯色培養(yǎng)基法實驗步驟較傳統(tǒng)方法簡單[2-3]，結(jié)果更易判讀[4]；測試紙片法方便快捷[4-5]，但成本較傳統(tǒng)培養(yǎng)法高[6]；電阻抗法目前已被美國分析化學(xué)家協(xié)會 (Association of Official Analytical Chemists，AOAC)認(rèn)證[6]，但電阻抗儀對溫度的穩(wěn)定性要求較高[7-8]，使用時需注意環(huán)境溫度；ATP生物發(fā)光技術(shù)法操作快速簡單、測定范圍廣[9]，但菌落濃度一般需≥104CFU/g[10]；流式細(xì)胞術(shù)檢測法大多應(yīng)用在液體樣品中，固體樣品的應(yīng)用還較少[11]；自動化儀器檢測法雖然儀器本身成本偏高，但操作簡單，可以大大降低人工成本，適合大批量檢測。

Microbio全自動菌落計數(shù)法是運用透鏡像差多重聚焦技術(shù)對菌落進行3D分析，能夠連續(xù)動態(tài)監(jiān)測并有效區(qū)分雜質(zhì)，快速完成菌落計數(shù)。為探究Microbio 全自動菌落計數(shù)法與平板菌落計數(shù)法在檢測結(jié)果上是否有顯著性差異，本文分別用上述2種方法檢測模擬染菌的食品樣品，從數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度、定量限和檢出時間等方面進行分析比較。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

微生物數(shù)碼顯微培養(yǎng)計數(shù)系統(tǒng)(MicroBio)，BD；麥?zhǔn)蠞岫葍x(M007230)，Biomerieux；培養(yǎng)箱(BD115)，Binder；培養(yǎng)箱(IC160)，Salvis。

1.2 菌種與樣品

大腸埃希菌(Escherichiacoli)ATCC11775，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)22018，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC27853，洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)CICC10857，蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)1410302，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)22730，白色念珠菌(Moniliaalbican)ATCC90029，黑曲霉菌(Aspergillusniger)ATCC16404，領(lǐng)地伯克霍爾德氏菌(Burkholderiaterritorii)IQCC33107，污染伯克霍爾德氏菌(Burkholderiacontaminans)CICC23882均為本實驗室保存。食品樣品(生雞肉)，購自北京超市，經(jīng)高溫滅菌后備用。

1.3 試劑與耗材

平板計數(shù)瓊脂(plate count agar, PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂，北京陸橋技術(shù)股份有限公司和BD公司；腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth，BHI)、腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar, BHIA)，Oxoid公司；NaCl，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂、比濁管，BD公司；2 mL離心管，AXYGEN公司；50 mL離心管，美國康寧公司。

1.4 方法

1.4.1 檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性及定量限比較

分別制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍爾德菌、銅綠假單胞菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念球菌、黑曲霉的菌液。

用生理鹽水將菌液調(diào)節(jié)到適當(dāng)?shù)臐岫群蠹尤氲绞称窐悠分?，制成菌落終濃度為100、50、25、10、5 CFU/mL的食品樣品模擬污染懸液，采用GB 4789.2—2016[1]、GB 4789.15—2016[12]中的方法進行檢測。隨后分別放入普通培養(yǎng)箱(PT組)和微生物數(shù)碼顯微培養(yǎng)計數(shù)系統(tǒng)(TD組)進行培養(yǎng)。每組5個重復(fù)?？瞻讓φ諡槲刺砑幽繕?biāo)菌的食品樣品。采用t檢驗進行統(tǒng)計，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

制備5份不同濃度:1、5、10、15、20、25 CFU/mL的食品樣品模擬污染懸液，培養(yǎng)和檢測方法同上。采用t檢驗進行統(tǒng)計，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4.2 檢出時間比較

分別制備領(lǐng)地伯克霍爾德氏菌、污染伯克霍爾德氏菌食品樣品模擬污染懸液，污染濃度≤100 CFU/mL。培養(yǎng)方式及空白對照同1.4.1。采用t檢驗進行統(tǒng)計，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4.3 不同操作人員比較

為探究人員操作對于計數(shù)結(jié)果的影響，以不同人員為單一變量，在其他條件不變的情況下，分別制備5、10、25、50、100 CFU/mL的食品樣品模擬污染懸液(大腸埃希菌)，實驗由2人進行操作，各做5組，平行5次實驗，具體操作及空白對照同1.4.1。

1.4.4 不同品牌培養(yǎng)基比較

用BD公司和北京陸橋公司的培養(yǎng)基進行金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)操作，各做5組實驗，前期處理和后續(xù)檢測培養(yǎng)操作及空白對照同1.4.1。對計數(shù)結(jié)果進行單因素方差分析(α=0.05)。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel及Minitab 17進行數(shù)據(jù)處理，對數(shù)據(jù)進行雙樣本t檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性及定量限比較

根據(jù)1.4.1步驟對8個菌種(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、洋蔥伯克霍爾德菌、銅綠假單胞菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、白色念球菌、黑曲霉)進行數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性比較實驗，空白對照無目標(biāo)菌檢出，回收率70%～105%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD) 0.04～0.35，說明數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較好[13-14](表1)。5 CFU/mL時，RSD均≤0.35；10、25 CFU/mL時，RSD≤0.25；50、100 CFU/mL時，2個方法的RSD≤0.15。其中PT組RSD高于TD組RSD的比例為50%，這說明在數(shù)據(jù)穩(wěn)定性上，TD組較PT組有微小的優(yōu)勢。在相對標(biāo)準(zhǔn)偏差方面，5、10 CFU/mL的RSD大多在0.20～0.35之間，這在一定程度上說明低濃度(5、10 CFU/mL)的平板計數(shù)誤差較大。運用Minitab軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析(α=0.05)，得到的P>0.05，說明2者在統(tǒng)計學(xué)上差異不顯著，Microbio全自動菌落計數(shù)法可以替代平板計數(shù)法。

表1 兩種培養(yǎng)方法下8株菌菌落計數(shù)的數(shù)據(jù) 準(zhǔn)確性結(jié)果比較

續(xù)表1

為確定TD組的檢測結(jié)果是否可靠，對PT組和TD組的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析。以PT組數(shù)值為橫坐標(biāo)，TD組數(shù)值為縱坐標(biāo)，對數(shù)據(jù)進行線性回歸，得到的相關(guān)系數(shù)在0.969 6～0.997 4之間，且都大于0.95，具有良好的相關(guān)性，表明Microbio 全自動菌落計數(shù)法的測定結(jié)果可靠。

為確定Microbio全自動菌落計數(shù)法和平板計數(shù)的定量限是否存在差異，選擇6個較低檢測濃度進行檢測。空白對照無目標(biāo)菌檢出。當(dāng)菌體濃度在1 CFU/mL時，2種方法的回收率都較低。5～25 CFU/mL時，回收較高，在72%～101%之間。對數(shù)據(jù)進行方差分析(α=0.05)，P值在0.107～1.000之間(≥0.05)，表明2種方法差異不顯著。定量限均可以達到 5 CFU/mL。

表2 兩種培養(yǎng)方法下8株菌菌落計數(shù)的定量限結(jié)果比較

續(xù)表2

續(xù)表2

2.2 檢出時間分析

污染伯克霍爾德氏菌[15]和領(lǐng)地伯克霍爾德氏菌生長緩慢[16]，檢測一般需要1～2 d。因此選用上述2株菌評價2種方法的最快檢出時間。TD組的檢出時間可以精確計時到0.5 h?？瞻讓φ諢o目標(biāo)菌檢出。污染伯克霍爾德菌16.0 h左右即可被 Microbio全自動菌落計數(shù)系統(tǒng)檢出，20.0 h左右計數(shù)穩(wěn)定(圖1-a)；領(lǐng)地伯克霍爾德菌15.5 h左右可被檢出，19.0 h左右計數(shù)穩(wěn)定(結(jié)果未顯示)；而平板計數(shù)法24 h左右才能檢測到領(lǐng)地伯克霍爾德氏菌(結(jié)果未顯示)和污染伯克霍爾德氏菌穩(wěn)定計數(shù)結(jié)果(圖1-b)。因此，從檢測時間看，Microbio 全自動菌落計數(shù)法短于傳統(tǒng)的平板計數(shù)法。

A-TD組；B-PT組

2.3 人員操作對于計數(shù)結(jié)果的影響

選用大腸埃希菌作為實驗菌種，以操作人員(A、B)為單一變量，設(shè)計10組實驗研究人員操作對于計數(shù)結(jié)果的影響。空白對照無目標(biāo)菌檢出，實驗組10組數(shù)據(jù)的P值均>0.05(0.160～0.921之間)(表4)，說明不同人員操作對計數(shù)結(jié)果影響不顯著。

表4 不同人員對于計數(shù)影響的單因素方差分析(大腸埃希菌)

2.4 不同培養(yǎng)基對于計數(shù)結(jié)果的影響

圖2是使用不同廠家培養(yǎng)基所得的計數(shù)結(jié)果圖，a為TD組結(jié)果，b為PT組結(jié)果。1號為X廠家培養(yǎng)基，2號為Y廠家培養(yǎng)基，右下角為菌落計數(shù)結(jié)果，分別為73、98、95、115 CFU(空白對照無目標(biāo)菌檢出)。PT組和TD組分別有5個水平，每個水平的平行數(shù)為5，計數(shù)結(jié)果方差分析(α=0.05)顯示，2種培養(yǎng)基在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著性差異。說明不同培養(yǎng)基對計數(shù)結(jié)果影響不大。

a-Microbio方法；b-平板計數(shù)法;1-X廠家培養(yǎng)基；2-Y廠家培養(yǎng)基

3 討論與結(jié)論

本研究共選用10種代表菌株，分別從計數(shù)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、定量限檢測、檢出時間、人員操作、不同培養(yǎng)基方面對Microbio全自動菌落計數(shù)法和平板計數(shù)法進行比較。實驗結(jié)果表明，全自動菌落計數(shù)法在計數(shù)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性、定量限檢測、人員操作、不同培養(yǎng)基方面和平板計數(shù)法無統(tǒng)計學(xué)差異(α=0.05)，最低檢出限可達5 CFU/mL；檢出時間方面，全自動菌落計數(shù)方法相較于平板計數(shù)法有一定的優(yōu)勢，節(jié)約4 h左右。

在菌種選擇方面充分考慮了代表性，金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌分別作為革蘭氏陽性菌[17]和革蘭氏陰性菌代表[17]，蠟樣芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是污染食品中常被檢測到的芽孢桿菌[18]，選取銅綠假單胞菌和洋蔥伯克霍爾德菌來檢測色素是否會影響機器的計數(shù)，選取黑曲霉和白色念球菌來評價機器真菌計數(shù)[19]的效果。

食品加工過程復(fù)雜多樣，冷凍、鹽漬、高溫等加工方法可使部分菌株因細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損而死亡，但也存在一部分菌株能夠抵御這些不良環(huán)境因素，而處于受損傷或亞致死狀態(tài)，在這種情況下進行檢測時，應(yīng)合理地考慮培養(yǎng)基的使用效果。本研究發(fā)現(xiàn)，進口培養(yǎng)基和國產(chǎn)培養(yǎng)基在數(shù)量上沒有顯著性差異。從菌落的形態(tài)來看，X廠家培養(yǎng)基上生長的菌落較Y廠家培養(yǎng)基的稍大。因此在檢測敏感性較高的菌種時，應(yīng)根據(jù)菌種的長勢選擇合適的培養(yǎng)基[20]。

在檢出時間方面，自動化的儀器設(shè)備要優(yōu)于傳統(tǒng)的檢測方法。傳統(tǒng)的檢測方法，需要每間隔一定的時間就對菌落進行計數(shù)，并且受菌落大小及透明度的限制，十分耗費人力。而Microbio全自動菌落計數(shù)法可以實現(xiàn)實時檢測，實時計數(shù)，操作更智能，還能將數(shù)據(jù)實時傳輸至工作者的郵箱，因此全自動菌落計數(shù)法在檢出時間方面有一定的優(yōu)勢。

自動化檢測是微生物快速檢測的一個趨勢，隨著勞動力成本的上升和儀器成本的降低，越來越多的自動化檢測技術(shù)應(yīng)用于菌落計數(shù)中，如TSUTA等[21]和RAYMOND等[11]分別用流式細(xì)胞術(shù)法來提高好氧平板計數(shù)法的預(yù)測精度及檢測巧克力中乳酸菌的總數(shù)，LUCAS等[22]結(jié)合3D打印技術(shù)檢測液滴中大腸桿菌的數(shù)量，JIANG等[23]采用電化學(xué)傳感器的方法檢測水中的菌落總數(shù)。利用全自動菌落計數(shù)法不僅可以節(jié)省勞動力，還可以降低實驗員主觀上對于菌落計數(shù)結(jié)果的影響，使結(jié)果更客觀。目前關(guān)于Microbio 微生物數(shù)碼顯微培養(yǎng)計數(shù)系統(tǒng)的相關(guān)文獻研究較少，但國內(nèi)已有一些原理相似的儀器出現(xiàn)，如QXC-30(上海海恒機電)及訊數(shù)公司的一系列儀器，說明該方法在菌落計數(shù)方面有較大的潛能。