李琳，喻超，潘耀振，陳玲，鄧路，雷林翰，孫誠誼*

(貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州醫(yī)科大學(xué) 肝膽胰脾重點實驗室，貴州省肝膽胰脾疾病研究所，貴州 貴陽 550004)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是世界上最常見的癌癥之一，中位生存期僅3～6個月，5年生存率不到5%[1]。盡管手術(shù)技術(shù)方法和輔助藥物治療取得了長足的進(jìn)步，但過去40年中關(guān)于PC的預(yù)后沒有明顯改變，死亡率接近發(fā)病率[2]。PC的高致死率主要源于其生物學(xué)行為，早期轉(zhuǎn)移且缺乏早期發(fā)現(xiàn)的標(biāo)志物等特性都導(dǎo)致PC在發(fā)生早期很難被發(fā)現(xiàn)[3]，因此發(fā)掘早期診斷的標(biāo)志物對于PC的診斷和治療至關(guān)重要[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是能夠降解幾乎所有類型細(xì)胞外基質(zhì)的酶，它們在生理過程中發(fā)揮著廣泛的作用，例如癌癥進(jìn)展等[5]。已有研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶28(matrix metalloproteinase 28，MMP28)可能參與癌癥的發(fā)生發(fā)展，并且與癌癥的轉(zhuǎn)移機(jī)制相關(guān)[6-7]。磷酸肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是人類癌癥中最常改變的途徑之一，在驅(qū)動腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[8-10]。PI3K信號級聯(lián)反應(yīng)的過度激活是人類癌癥中最常見的反應(yīng)之一，在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對細(xì)胞外刺激物的響應(yīng)起關(guān)鍵協(xié)調(diào)作用[11]，但目前有關(guān)MMP28在PC中的作用和機(jī)制研究還比較缺乏。本文通過對MMP28進(jìn)行生物信息學(xué)分析，觀察可能生物學(xué)過程及其通路，并通過實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)(real-time quantitative PCR detecting system，qPCR)和免疫印跡實驗(Western blot)實驗驗證MMP28在PC細(xì)胞中的作用與機(jī)制，報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株與主要試劑 人PC細(xì)胞株P(guān)ANC-1細(xì)胞為中山大學(xué)腫瘤防治中心惠贈，胎牛血清(fatal bovine serun，F(xiàn)BS)、胰蛋白酶及培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium, DMEM)購自美國Gibco公司，RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司，B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，BCL2)、叉頭框轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead box O1，F(xiàn)OXO1)和細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)引物購自上海生工生物工程公司，相應(yīng)WB一抗購自美國proteintech公司，MMP28轉(zhuǎn)染試劑(包括MMP28對照試劑、MMP28下調(diào)試劑及MMP28上調(diào)試劑)購自廣州銳博生物公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix ExTaq試劑盒均購自日本TaKaRa公司。

1.1.2主要儀器 CFX96 Bio-Rad熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司，ChemiDocTMTouch bio-rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 利用cBioPortal網(wǎng)站在線分析TCGA數(shù)據(jù)庫(http://www.cbioportal.org/)，選擇胰腺導(dǎo)管腺癌數(shù)據(jù)庫PAAD，數(shù)據(jù)類型選擇mRNA表達(dá)譜，根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果，選取與MMP28相關(guān)的基因中相關(guān)系數(shù)較大(Person系數(shù)>0.5)的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析。GO富集分析包括與MMP28相關(guān)的細(xì)胞組成(cellular component，CC)分析、生物過程(biological process，BP)分析及分子功能(molecular function，MF)分析，KEGG富集分析與MMP28相關(guān)的通路分析，并通過GEPIA網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析MMP28與其互作基因之間的關(guān)系。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)于10%FBS的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃的5%CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱，將PANC-1細(xì)胞消化鋪于培養(yǎng)瓶中、105個細(xì)胞/瓶；鋪板6 h后，將細(xì)胞分為MMP28對照組(NC組，給與MMP28對照試劑)、MMP28下調(diào)組(si-MMP28組，給與MMP28下調(diào)試劑)及MMP28上調(diào)組(U-MMP28組，給與MMP28上調(diào)試劑)，待48 h后取細(xì)胞進(jìn)行其他實驗。

1.2.3qPCR檢測BCL2、FOXO1及PDCD4 mRNA的表達(dá) 選擇各組處于對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞，提取總RNA，依照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明分別將樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再選擇GAPDH作為內(nèi)參，使用SYBR Premix ExTaq試劑盒進(jìn)行qPCR實驗以檢測BCL2、FOXO1及PDCD4 mRNA的表達(dá)。

1.2.4Western blot檢測Akt和磷酸化蛋白激酶B(phosphorylase protein kinase B，p-Akt)的蛋白表達(dá) 選擇各組處于對數(shù)生長期的PANC-1細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，根據(jù)蛋白定量結(jié)果進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵一抗、洗膜、孵二抗、洗膜及曝光，用Image Lab軟件分析所得條帶的灰度值，檢測Akt和p-Akt的蛋白表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1MMP28的生物學(xué)功能

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果選取與MMP28相關(guān)的基因中相關(guān)系數(shù)較大(P>0.5)的基因進(jìn)行GO富集分析，CC結(jié)果顯示MMP28與細(xì)胞外泌體、膜轉(zhuǎn)運及細(xì)胞黏附功能相關(guān)(圖1A)；BP結(jié)果顯示MMP28可能與細(xì)胞黏附、細(xì)胞與細(xì)胞間黏附及表皮發(fā)生發(fā)展相關(guān)(圖1B)；MF結(jié)果顯示MMP28可能與Ca2+結(jié)合及結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)(圖1C)。

2.2MMP28的信號通路

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果，選取與MMP28相關(guān)的信號通路中相關(guān)性前10的信號通路進(jìn)行分析，結(jié)果顯示MMP28可能參與多種和癌癥發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路，包括黏著斑信號通路和PI3K-Akt信號通路。見圖2。

注：A為與MMP28相關(guān)的細(xì)胞組分圖，B為與MMP28相關(guān)的分子功能圖，C為與MMP28相關(guān)的生物學(xué)過程圖。

圖2 生物信息學(xué)分析MMP28的信號通路

2.3MMP28對PI3K-Akt信號通路的影響

通過GEPIA網(wǎng)站分析結(jié)果顯示，MMP28與BCL2、FOXO1及PDCD4等信號分子呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(圖3A、3B及3C)；qPCR結(jié)果表明，與NC組相比，si-MMP28組PANC-1細(xì)胞的BCL2、FOXO1及PDCD4 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，U-MMP28組PANC-1細(xì)胞BCL2、FOXO1及PDCD4表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖3D)。

注：A、B、C分別為MMP28與BCL2、FOXO1、PDCD4表達(dá)的關(guān)系，D為3種基因表達(dá)的直條圖；(1)與NC組比較，P<0.05。

2.4MMP28對PI3K-Akt信號通路活性的影響

與NC組比較，si-MMP28組PANC-1細(xì)胞的p-Akt蛋白表達(dá)水平上調(diào)，U-MMP28組PANC-1細(xì)胞的p-Akt蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：(1)與NC組比較，P<0.05。

3 討論

PC因其極高的病死率一直是醫(yī)學(xué)研究攻克的一個難點，無論是早期診斷、治療，提高患者的生存時間和生存質(zhì)量都是學(xué)者們持續(xù)研究的目標(biāo)[12-14]。目前已有大量研究探索PC的發(fā)生機(jī)制并力圖找到可應(yīng)用的靶點[15-16]。本研究為了探索MMP28在PC中的作用機(jī)制，首先通過富集分析MMP28在PC中可能有關(guān)的細(xì)胞成分、生物學(xué)過程和分子功能，分析結(jié)果可以看出MMP28與膜轉(zhuǎn)運相關(guān)；與細(xì)胞黏附功能也相關(guān)；與結(jié)構(gòu)分子活性相關(guān)，經(jīng)過系統(tǒng)分析表明MMP28應(yīng)參與PC的侵襲轉(zhuǎn)移過程。通過對MMP28的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)已有研究表明MMP28可作為胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的獨立預(yù)后標(biāo)志物[6]。進(jìn)一步富集分析發(fā)現(xiàn)MMP28可能參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)現(xiàn)MMP28可能參與與PI3K-Akt轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。PI3K-Akt轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是在癌癥發(fā)生發(fā)展過程中極其重要的一個通路[17-19]。Wei等[20]通過研究表明可以部分通過PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/GSK-3β信號通路調(diào)節(jié)PI3K的活性以促進(jìn)自噬并抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Yang等[21]研究發(fā)現(xiàn)用4-甲基亞磺酰基-3-丁烯基異硫氰酸酯處理的肺癌細(xì)胞表現(xiàn)出對PI3K-Akt信號通路的顯著抑制；Wang等[22]發(fā)現(xiàn)SOX9/miR-203a軸對PI3K/Akt途徑的激活作用及其在癌癥中的作用。這些都表明PI3K-Akt信號通路是癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中及其重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

為探索MMP28是否參與PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，首先在GEPIA網(wǎng)站中搜索MMP28與之相關(guān)的PI3K信號通路上的信號分子，結(jié)果顯示MMP28與BCL2、FOXO1及PDCD4等信號分子呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而BCL2、FOXO1及PDCD4都參與PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[23-26]。進(jìn)而通過檢測3組PANC-1細(xì)胞中的BCL2、FOXO1及PDCD4表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與前面分析的結(jié)果相同，MMP28與BCL2、FOXO1及PDCD4等信號分子呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。為進(jìn)一步驗證MMP28參與PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過WB來驗證Akt和p-Akt在不同分組中的表達(dá)情況，結(jié)果表明3組PANC-1細(xì)胞Akt的蛋白表達(dá)基本相同，p-Akt的蛋白表達(dá)則不同。與NC組相比，U-MMP28組PANC-1細(xì)胞p-Akt的表達(dá)減少，si-MMP28組PANC-1細(xì)胞p-Akt的表達(dá)增加，這表明MMP28與Akt的激活相關(guān)，參與PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，也表明了MMP28可能與癌癥的增殖、分化及凋亡等相關(guān)。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)分析并結(jié)合相關(guān)實驗表明MMP28在PC細(xì)胞相關(guān)腫瘤信號通路PI3K-Akt信號通路的激活過程中發(fā)揮重要作用，MMP28通過調(diào)控該通路中Akt的磷酸化水平，進(jìn)而調(diào)控下游靶基因的表達(dá)，但是相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。