賈智若，陳明偉，甄丹丹，李培源，李海媚

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200）

傳統(tǒng)湯劑集中體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的精髓，歷經(jīng)數(shù)千年的臨床實踐檢驗，療效確切，是中藥最常用的劑型，但是存在煎服麻煩、不易儲存、攜帶不便等不足。為適應(yīng)現(xiàn)代生活快節(jié)奏生活方式的變化和需求，中藥配方顆粒應(yīng)運而生，作為現(xiàn)代新劑型，它是由各單味中藥飲片提前分煎制成，在臨床上替代傳統(tǒng)中藥飲片組方應(yīng)用。傳統(tǒng)湯劑經(jīng)歷了各組方藥味共同煎煮的過程，各化學(xué)成分之間可能會因相互作用而產(chǎn)生協(xié)同或拮抗的藥效。而中藥配方顆粒是分煎后混合使用，忽視了合煎過程中的相互作用，因此目前對于配方顆粒劑在臨床上的應(yīng)用存在一定的爭議［1-2］。

佛手散出自宋·許叔微《普濟本事方》，由川芎和當(dāng)歸兩味中藥等比例配伍而成，既是古方，又是著名藥對，具有養(yǎng)血活血、祛風(fēng)止痛之功效，古時主治婦女月經(jīng)不調(diào)及胎前產(chǎn)后諸癥?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)該方具有改善血液循環(huán)、抗腦缺血及抗血栓等多種功效。川芎、當(dāng)歸同屬傘形科植物，含有許多相似的化學(xué)成分，均含有抗腦缺血藥效成分苯酞類和有機酚酸類。大量文獻(xiàn)報道顯示，綠原酸、咖啡酸、阿魏酸等酚酸類成分，具有抗自由基、抗氧化、保護心腦血管等作用；洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯等苯酞類成分具有擴張血管、改善微循環(huán)等作用，對心腦血管起保護作用［3-9］。

因此本文以復(fù)方佛手散為研究對象，選擇綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A及藁本內(nèi)酯5個代表性有效成分作為考察指標(biāo)，采用HPLC法同時測定佛手散組方藥味分煎與合煎情況下上述5種有效成分的含量，探討不同煎煮方式對有效成分溶出率的影響，為該方的質(zhì)量控制和臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agi?lent公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；LG16-W型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯）。

1.2 藥材、對照品及試劑 當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels、川芎Ligusticum chunxiongHort.飲片購自廣東紫云軒藥業(yè)有限公司，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室梁子寧教授鑒定符合藥典要求；阿魏酸對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110773-201313）；綠原酸（中國藥品生物制品檢定所，批號：110753-201413）；咖啡酸（中國藥品生物制品檢定所，批號：110885-200102）；藁本內(nèi)酯對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111737-201305）；洋川芎內(nèi)酯A（深圳伽馬科技有限公司，HPLC檢驗純度>98%，批號：20150301）；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯對照品，置于棕色容量瓶內(nèi)，加甲醇溶解分別配制成對照品貯備液。精密移取各對照品貯備液適量，放置棕色容量瓶中，加甲醇溶解定容配制成含綠原酸0.026 3 mg/ml、咖啡酸 0.031 9 mg/ml、阿魏酸 0.110 1 mg/ml、洋川芎內(nèi)酯A 0.060 1 mg/ml、藁本內(nèi)酯0.076 7 mg/ml的混合對照溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 合煎液的制備 按芎歸配伍比例（1∶1），精密稱取川芎、當(dāng)歸藥材粗粉各30 g，加10倍量水，煎煮2次，每次60 min，合并濾液，減壓濃縮，定容至500 ml量瓶中，搖勻，放置，備用。取上述水煎液適量，離心后取上清液過0.22 μm濾膜，即得合煎液。

2.2.2 分煎液的制備 精密稱定川芎、當(dāng)歸藥材粗粉各30 g，按2.2.1項下煎煮條件和方法，分別制備川芎單煎液和當(dāng)歸單煎液。再將川芎、當(dāng)歸兩味藥的單煎液等比配伍（1∶1）混合，得到分煎液樣品。

2.3 色譜條件 AtlantisT3柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：A為甲醇，B為0.2%醋酸水溶液，梯度洗脫條件見表1，分析時間為65 min；流速0.8 ml/min；柱溫 25 ℃；檢測波長280 nm；進樣量10 μl。

表1 梯度洗脫條件

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取混和對照品溶液和2.2項下各供試品溶液各10 μl，按2.3項下HPLC色譜條件進樣分析，結(jié)果表明綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的保留時間依次為25.667 min、29.395 min、39.861 min、59.54 min、61.893 min；各相鄰色譜峰之間分離度均>1.5，拖尾因子均在0.90～1.05之間；滿足定量要求，結(jié)果見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.4.2 精密度試驗 取上述混合對照品溶液10 μl，連續(xù)進樣6次，在2.3項色譜條件下測定，記錄280 nm吸收波長下的色譜圖和各有效成分的峰面積，計算RSD值，結(jié)果顯示，綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD值分別為1.23%、1.17%、1.58%、1.87%、1.69%（均n=6）。

2.4.3 線性關(guān)系考察 分別準(zhǔn)確吸取混合對照品溶液 2 μl、5 μl、10 μl、15 μl、20 μl注入高效液相色譜儀，按2.3項下色譜條件進行樣品測定，根據(jù)不同梯度水平的對照品溶液進樣分析結(jié)果，以各自峰面積（Y）為縱坐標(biāo)和進樣量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各自的回歸方程和線性范圍，結(jié)果見表2。5個化合物在各自線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及線性范圍

2.4.4 重復(fù)性試驗 稱取同一批川芎、當(dāng)歸飲片，按2.2.1項下方法制備6份供試品溶液，在2.3項色譜條件分別測定5種有效成分的含量，進樣量為10 μl。佛手散合煎樣品中綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯含量的RSD分別為1.89%、2.10%、1.86%、2.16%、2.52%（均n=6）。結(jié)果表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，在相同色譜條件下分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h依次進樣分析，結(jié)果表明，在24 h內(nèi)樣品中綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯峰面積的RSD分別為0.84%、1.14%、1.68%、1.55%、1.32%（均n=6），表明樣品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 精密量取已知含量的同一批佛手散樣品6份，分別精密加入與取樣含量相等的綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯，按2.2.1項下方法制備合煎供試品溶液，按以上色譜條件分別進樣測定，計算樣品的加樣回收率。實驗結(jié)果表明：佛手散合煎樣品中綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的平均回收率分別是98.48%、97.17%、99.20%、100.79%、96.53%，RSD分別為1.76%、1.41%、1.08%、1.93%、2.48%（均n=6）。表明該實驗方法回收率良好。

2.5 樣品含量測定 分別按2.2項下方法制備佛手散分煎和合煎供試品溶液各3份，精密吸取10 μl，分別注入液相色譜儀，在選定色譜條件下進行測定，計算5種有效成分的溶出率（單一成分溶出率=該成分在水煎劑中的含有量/水煎劑中相當(dāng)于生藥材的取樣量×100%），結(jié)果見表3。

表3 佛手散分煎液與合煎液中5種有效成分的溶出量比較 （n=3）

結(jié)果表明，佛手散合煎液中有效成分綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、蒿本內(nèi)酯化學(xué)成分的含量均高于分煎液。

3 討論

本課題組前期研究已證實佛手散水煎劑具有一定的抗腦缺血作用，同時大量文獻(xiàn)報道顯示，綠原酸、咖啡酸、阿魏酸具有抗自由基、抗氧化、保護心腦血管等作用，洋川芎內(nèi)酯A和藁本內(nèi)酯具有擴張血管和改善微循環(huán)的作用［3-9］。因此，本實驗以上述5種物質(zhì)為指標(biāo)成分，研究分煎與合煎條件下佛手散有效成分的變化。研究結(jié)果顯示，佛手散合煎液中有效成分綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、蒿本內(nèi)酯化學(xué)成分的含量均高于分煎液。表明佛手散分煎與合煎對有效成分的溶出有一定的影響，合煎可能由于協(xié)同效應(yīng)等影響，更利于其有效成分綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯的溶出，可能使藥效得以更好的發(fā)揮。分煎與合煎對中藥湯劑化學(xué)組分的影響是今后值得進一步研究的方向，本研究結(jié)果可從物質(zhì)基礎(chǔ)層面為闡明佛手散配伍規(guī)律提供實驗基礎(chǔ)，為后續(xù)開展化學(xué)成分與藥效學(xué)相關(guān)性研究提供一定的參考依據(jù)。