張 齊，高 月，劉 顯，李熠毅

（廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200）

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal?stem cells,BMSCs）是一種具有易于體外分離、擴增，多向分化等潛能的非造血干細胞［1-2］。近年，BMSCs已然成為現(xiàn)代眾學者熱門研究的課題之一，但BMSCs亦可在腫瘤微環(huán)境中出現(xiàn)形態(tài)及染色體等異常改變，進而發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［3］。因此，如何安全、有效地將BMSCs應用于臨床治療與研究（特別是腫瘤）已成為當務之急。扶芳藤Euonymus fortunei（Turcz.）Hand.-Mazz為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物，具有抗氧化、提高免疫力及改善血流變等功效［4-5］，筆者欲通過體外模擬小鼠肝癌微環(huán)境，并加以扶芳藤提取液進行干預，檢測小鼠肝癌微環(huán)境中BMSCs Yap蛋白的表達情況，以期觀察扶芳藤提取液對小鼠肝癌微環(huán)境中BMSCs是否具有保護作用，并探討腫瘤微環(huán)境中BMSCs發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的可能機制。

1 實驗材料

1.1 細胞 小鼠BMSCs細胞株（廣州賽業(yè)生物科技有限公司，Catalog Number：MUBMX-01001）；小鼠Hepa1-6肝癌細胞株（中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，Catalog Number：TCM39）。

1.2 試藥 參考文獻［6］方法制備扶芳藤提取液：取1 kg扶芳藤，加入10倍量水，置于不銹鋼鍋內(nèi)蒸煮1 h后過濾，留取過濾液；藥渣加入8倍量水，煮開后文火煎30 min，過濾除渣，合并2次過濾液，濃縮至1 000 ml時，冷卻；加入95%食用乙醇，混勻至乙醇濃度為80%，室溫靜置48 h（前24 h內(nèi)需攪拌3～5次），過濾除渣，濾液于旋轉(zhuǎn)回收器中回收乙醇至無醇味，將無醇液體加熱，濃縮為2.0 g/ml的濃度，4℃保存?zhèn)溆?，使用時雙蒸水稀釋即可。

1.3 主要試劑與儀器 胎牛血清（Wisent公司，086-150）；DMEM/F12培 養(yǎng) 基（Hyclone公 司 ，SH30023）；CCK-8試劑盒（上海碧云天公司，C0038）；ECL超敏發(fā)光液（Solarbio,PE0010）；研究級顯微鏡（日本奧林巴斯，IX81）；酶標儀（美國BIORAD，IMARK）；蛋白核酸凝膠電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（BIORAD，Mini Protean Tetra Cell Mini Trans-blot cell）；凝膠成像分析系統(tǒng)（BIO-RAD，ChemiDoc）等。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng) 小鼠BMSCs、小鼠Hepa1-6細胞培養(yǎng)及共培養(yǎng)體系均使用DMEM/F12完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素+100 U/ml鏈霉素雙抗），置于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度約達75%～80%時，以0.25%胰蛋白酶消化，傳代或凍存，本實驗細胞分別選取第三代細胞作為共培養(yǎng)細胞。

2.2 CCK-8法篩選最適藥物濃度［7］按照CCK-8試劑盒說明書，鋪板，調(diào)整細胞至500個/孔。扶芳藤提取液的實驗濃度設置為 100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml、800 μg/ml，每濃度預設 9 個復孔，分別于24 h、48 h、72 h終止培養(yǎng)，并于450 nm波長下分別測各組細胞OD值。

2.3 共培養(yǎng)法模型建立 采用懸掛式非接觸共培養(yǎng)小室-Transwell-3450，取對數(shù)生長期的BMSCs細胞，消化、調(diào)整濃度為2.5×103個/孔種植于Transwell下室內(nèi)；同樣取對數(shù)生長期的Hepa1-6細胞，消化、調(diào)整濃度為2.5×104個/孔種植于Transwell上室內(nèi)，置于5%CO2、37℃飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，3天換液1次，共培養(yǎng)7 d。

2.4 實驗分組 實驗分為對照組（單獨培養(yǎng)BMSCs細胞，細胞密度與模型組相同）、模型組（采用Tran?swell小室將BMSCs與Hepa1-6細胞共培養(yǎng)）、干預組（以最佳濃度扶芳藤提取液干預共培養(yǎng)模型）。共培養(yǎng)7 d后，收集各組細胞，繼續(xù)培養(yǎng)、擴增，指標檢測。

2.5 Western Bolt檢測各組BMSCs Yap蛋白表達變化［8］收集各組BMSCs，提取并檢測各組BMSCs細胞總蛋白濃度，經(jīng)制膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育抗體等步驟，于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集凝膠圖像，后期使用Quantity One軟件計算各條帶的光密度值，以β-actin作為內(nèi)參照，將目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶的比值作為參照結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度扶芳藤提取液對BMSCs、Hepa1-6細胞增殖的影響 見表1、表2。

表1 不同濃度扶芳藤提取液對BMSCs細胞增殖的影響（±s，n=9）

表1 不同濃度扶芳藤提取液對BMSCs細胞增殖的影響（±s，n=9）

注：與模型組比較，①P<0.05

組 別 吸光值48 h 0.293±0.006 0.315±0.006①0.322±0.008①0.296±0.004 0.212±0.009①24 h 0.175±0.017 0.176±0.005 0.174±0.005 0.175±0.008 0.172±0.007 72 h 0.411±0.007 0.453±0.005①0.505±0.003①0.317±0.004①0.251±0.006①模型組100 μg/ml組200 μg/ml組400 μg/ml組800 μg/ml組

表2 不同濃度扶芳藤提取液對Hepa1-6細胞增殖的影響（x±s，n=9）

由表1和表2可知，200 μg/ml扶芳藤提取液對BMSCs增殖有促進作用，且能抑制Hepa1-6細胞增殖。本實驗依據(jù)可促進BMSCs增殖且可抑制Hepa1-6增殖的最小藥物濃度為最佳藥物濃度，故選用200 μg/ml扶芳藤提取液作為最佳濃度。

3.2 各組BMSCs Yap蛋白表達變化的比較 見圖1及表3。

圖1 扶芳藤提取液對各組BMSCs Yap蛋白表達變化的影響

表3 各組BMSCs Yap蛋白表達變化的比較（x±s）

由圖1及表3可知，與對照組比較，模型組BMSCs Yap蛋白表達明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，干預組BMSCs Yap蛋白表達相對降低（P<0.05），差異均有統(tǒng)計學意義。

4 討 論

由于BMSCs具有強大的增殖和多向分化的潛能，曾被稱之為組織工程學理想的種子。然而，隨著研究的不斷深入，BMSCs與腫瘤細胞可通過分泌細胞因子與信號分子等途徑相互作用，導致BMSCs形態(tài)結(jié)構、生長、染色體等發(fā)生改變，進而誘導其發(fā)生異常轉(zhuǎn)化［9-10］。其原因可能與體內(nèi)外物理、化學等因素的影響有關，如何避免或減少物理、化學等因素對正常BMSCs的影響，成為了BMSCs應用于臨床治療的一道屏障。

扶芳藤，盛產(chǎn)于我國西南地區(qū)，侗族、瑤族、哈尼族等民間多使用，最早記載于《本草拾遺》：“扶芳藤，味苦，小溫，無毒，主一切血、一切氣、一切冷，去百病……變白不老”。部分藥理學證實扶芳藤提取液中含有衛(wèi)矛醇、黃酮類、兒茶素類等成分，其用途廣泛，效果明顯［5］。肖艷芬等［11］研究證實扶芳藤提取液可提高免疫抑制小鼠免疫功能；肖健等［12］在建立大鼠腦缺血模型后予以扶芳藤提取液治療，發(fā)現(xiàn)扶芳藤提取物對模型大鼠腦組織具有一定保護作用，且該作用可能與抑制白介素-6表達相關。鑒于扶芳藤提取液已有的藥理作用，筆者前期亦通過CCK-8等試驗檢測出該提取液對腫瘤微環(huán)境中BMSCs生長曲線及CCND1/CCNB1蛋白有所改善，但其相關機制研究尚未得知，故本實驗開展細胞毒理實驗，篩選出其最佳濃度來干預體外模擬腫瘤微環(huán)境，檢測小鼠肝癌微環(huán)境中BMSCs Yap蛋白的表達情況，以期觀察該提取物對小鼠肝癌微環(huán)境中BMSCs是否具有保護作用，并探討腫瘤微環(huán)境中BMSCs發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的可能機制。

本實驗通過細胞毒理實驗篩選出200 μg/ml扶芳藤提取液作為藥物最佳濃度，采用Transwell共培養(yǎng)小室，成功建立小鼠BMSCs與Hepa1-6肝癌細胞的共培養(yǎng)體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，模型組BMSCs Yap蛋白表達明顯升高；與模型組比較，干預組BMSCs Yap蛋白表達相對減少。Yap蛋白作為Hippo信號通路的主要效應分子，屬于癌基因，在其信號通路中起著至關重要的作用。LIAN等［13］認為在胚胎干細胞分化過程中，主要效應分子Yap是失活的，而在非分化的干細胞核內(nèi)卻發(fā)現(xiàn)增多的非磷酸化Yap，過度表達的Yap可提高誘導多能干細胞重編程效率，Yap同樣可與多種與干細胞相關的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，從而調(diào)節(jié)干細胞的增殖及分化。本實驗中模型組Yap蛋白表達結(jié)果與文獻［13］結(jié)果相似，而干預組BMSCs Yap蛋白表達相對模型組減少，故認為200 μg/ml扶芳藤提取液對腫瘤微環(huán)境中BMSCs起到一定保護作用。

綜上所述，扶芳藤提取液對小鼠肝癌微環(huán)境中BMSCs Yap蛋白表達起到一定的抑制作用，Yap蛋白的表達可能為腫瘤微環(huán)境中BMSCs發(fā)生惡化的一個關鍵因素。但扶芳藤提取液引導該抑制作用的具體機制及起到抑制作用的藥理成分尚未明了。因此，扶芳藤提取液對于小鼠肝癌微環(huán)境中BMSCs的保護作用機制仍需進一步深入研究。