吳玉玲，邵明龍，周武林，高惠芳，張顯，徐美娟，楊套偉，饒志明

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

引 言

寶丹酮（boldenone，BD）是一種蛋白同化類固醇，可增加食欲，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，支持氮保留并刺激腎臟中促紅細(xì)胞生成素的釋放，多用于獸醫(yī)和肉類生產(chǎn)行業(yè)[1]。在傳統(tǒng)的類固醇制藥行業(yè)中，寶丹酮主要由1,4-雄烯二酮（ADD）經(jīng)過多步化學(xué)反應(yīng)合成[2]。近年來，寶丹酮的生物方法合成以其溫和的反應(yīng)條件和環(huán)保優(yōu)勢(shì)引起了諸多關(guān)注。Chen 等[3]構(gòu)建了重組P.pastorisGS115，實(shí)現(xiàn)了從雄烯二酮（AD）到ADD 和寶丹酮的生物轉(zhuǎn)化，Eisa 等[1]發(fā)現(xiàn)Pseudomonas aeruginosa能以玉米油植物甾醇為底物，轉(zhuǎn)化生成AD、睪酮和寶丹酮。Tang 等[4]通過重組M.neoaurum和P.pastoris的半連續(xù)發(fā)酵，以植物甾醇為底物，合成了ADD 和寶丹酮。但是由于轉(zhuǎn)化率不高，存在副產(chǎn)物，或者轉(zhuǎn)化過程復(fù)雜，對(duì)寶丹酮的生產(chǎn)造成一定的困難。

目前，已發(fā)現(xiàn)部分微生物含有17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSD），可以催化類固醇的17β 還原反應(yīng)。在體外，大多數(shù)17β-HSD 酶可以催化不同類固醇的17β 還原/氧化之間的可逆反應(yīng)[5-10]（圖1）。但是，不同來源的17β-HSD，在催化17β 位點(diǎn)的還原和氧化方向上具有不同的催化效率[8,11]，F(xiàn)ernández-Cabezón 等[12]將 來 源 于 睪 丸 酮 叢 毛 單 胞 菌（Comamonas testosteroni）和 月 狀 旋 孢 腔 菌（Cochliobolus lunatus）的17β-HSD進(jìn)行異源表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)其具有C-17 還原活性，能以AD 為底物，催化其C-17 的C O 還原生成C—OH 的反應(yīng)。但是由于轉(zhuǎn)化率較低，限制了17β-HSD的工業(yè)應(yīng)用。

圖1 17β-羥基類固醇脫氫酶（17β-HSD）生物催化ADD合成BDFig.1 Bioconversion of ADD to BD by 17β-hydroxysteroid dehydrogenase(17β-HSD)

本研究將以此為基礎(chǔ)，通過同源分析和序列比對(duì)，找到不同來源的17β-HSD，對(duì)其是否具有C-17還原活性進(jìn)行分析，以期篩選到能催化ADD 還原生成寶丹酮的17β-HSD。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

1.1.1 基因、引物、質(zhì)粒和菌株 本實(shí)驗(yàn)所用到的六個(gè)17β -HSD 基因分別來源于Cochliobolus lunatus,Pyrenochaetasp.,Beauveria bassiana,Arthroderma otae,Comamonas testosterone和Burkholderiasp.，經(jīng)過大腸桿菌密碼子優(yōu)化后，由金唯智合成并連接到pUC57 質(zhì)粒上，本實(shí)驗(yàn)所有的菌株、質(zhì)粒和引物見表1。

1.1.2 主要試劑 ADD，寶丹酮標(biāo)準(zhǔn)樣品購(gòu)于上海Sigma-Aldrich；羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）購(gòu)于山東濱州智源生物科技有限公司；DNA 聚合酶，T4 DNA 連接酶和限制性核酸內(nèi)切酶購(gòu)于大連寶生物生物工程有限公司；用于DNA 片段純化和質(zhì)粒提取的mini DNA 快速純化試劑盒和質(zhì)粒miniprep 試劑盒購(gòu)于上海捷瑞生物工程有限公司。其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純及更高。

1.1.3 主要儀器 PCR 儀：德國(guó)Eppendorf 公司；UVP 凝膠成像儀：上海天能；核酸電泳系統(tǒng)：北京市六一儀器廠；蛋白電泳系統(tǒng)：美國(guó)Bio-Rad 公司；賽默飛U3000 高效液相色譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基（g·L-1）：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；LB 固體培養(yǎng)基（g·L-1）：在LB 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加2%的瓊脂粉；根據(jù)具體情況添加抗生素，卡那霉素的工作濃度為20 μg·ml-1。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)所用到的質(zhì)粒如表1，進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的17β-HSD 基因合成并克隆到了質(zhì)粒pUC57-HSD 上。為了構(gòu)建在大腸桿菌中表達(dá)的重組質(zhì)粒，以不同的pUC57-HSD 質(zhì)粒用作模板，將特異的-F(HSD)/-R(HSD)用作引物，并將獲得的PCR 片段進(jìn)行凝膠純化后，用連接酶連接至pET-28a(+)載體的BamH Ⅰ/Hind Ⅲ限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。表1中顯示了6種17β-HSD 基因的特異性-F(HSD)/-R(HSD)引物。然后將這些重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，以構(gòu)建重組菌株BL21/pET28a-HSDCl、 BL21/pET28a-HSDPy、 BL21/pET28a-HSDBb、 BL21/pET28a-HSDAo、 BL21/pET28a-HSDCt 和BL21/pET28a-HSDBu，并 通 過DNA測(cè)序驗(yàn)證。

表1 本研究所用到的菌株、質(zhì)粒及引物Table 1 Strains，plasmids and primers used in this study

1.2.2 17β-HSD 在大腸桿菌中的表達(dá)和純化 將活化后的重組菌株BL21/pET28a-HSD 接種到50 ml LB，于37℃，200 r·min-1培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞在600 nm 的光密度（OD600）達(dá)到0.6～0.8 時(shí)，以0.5 mmol·L-1的終濃度添加IPTG 以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。在25℃下繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，在4℃下以8000 r·min-1離心5 min收獲細(xì)胞，并用10 ml 磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）洗滌3 次。然后將細(xì)胞重懸于5 ml 磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行超聲處理。超聲處理后，以8000 r·min-1的速度離心30 min，從混合物中獲得粗酶，并將其用于后續(xù)研究，包括純化和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白分析。以HisTrapTMHP 親和層析柱[13]中所述的方法進(jìn)行純化，純化后的蛋白用于酶活力測(cè)定和酶學(xué)性質(zhì)分析。以Bradford 法和牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定蛋白濃度[14]。

1.2.3 17β-HSD 酶活性測(cè)定和酶學(xué)性質(zhì)分析 用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)17β-HSD 活性，測(cè)量轉(zhuǎn)化過程中寶丹酮的形成速率。反應(yīng)體系（5 ml）含有50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），200 μmol·L-1ADD（預(yù)溶于2%甲醇），0.5 mmol·L-1NADPH 和適當(dāng)濃度的純化酶。一個(gè)單位活性定義為在37℃和pH 7.5 下1 min 內(nèi)能夠?qū)? μmol·L-1ADD 轉(zhuǎn)化為寶丹酮的17β-HSD 量。HSDPy 分別在不同pH（pH 4～6，50 mmol·L-1Na2HPO4-檸檬酸緩沖液；pH 6～8，50 mmol·L-1Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液；pH 8～10，50 mmol·L-1Na2CO3-NaHCO3緩沖液），不同溫度（20～50℃，每隔5℃為一個(gè)梯度，以及37℃）以及不同金屬離子和EDTA（在反應(yīng)體系中分別添加K+、Na+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Ni2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+、EDTA，終濃度為1 mmol·L-1）條件下反應(yīng)，以測(cè)定不同反應(yīng)條件對(duì)HSDPy酶活性的影響。

1.2.4 重組菌株BL21/pET28a-HSD 對(duì)ADD 的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化 重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSD 菌株在搖瓶中于37℃，200 r·min-1生長(zhǎng)，在25℃誘導(dǎo)12 h后，將50 ml 培養(yǎng)物于8000 r·min-1離心5 min，并用50 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液（pH 7.5）洗滌三次以收獲細(xì)胞。然后將細(xì)胞重懸（如不特殊說明，細(xì)胞干重23 g·L-1）于含有ADD（如不特殊說明，底物濃度為1 g·L-1）的50 ml 磷酸鹽緩沖液（50 mmol·L-1，pH 7.5）中。細(xì)胞干重測(cè)量方法：取1 ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，于13000 r·min-1，離心5 min 后去除上清液，于80℃下烘干，24 h后稱量細(xì)胞干重。在以前的研究中，HPβ-CD 是ADD 生物轉(zhuǎn)化的最佳助溶劑，ADD 與HPβ-CD 的最佳摩爾比為1∶1[15]。因此，本研究中使用了相同的比例添加助溶劑。對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的不同生物量（9、18、27、36、45 g·L-1）和底物濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g·L-1）進(jìn)行了研究。在5 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的反應(yīng)體系為2 L。于37℃，200 r·min-1條件下進(jìn)行全細(xì)胞生物催化。從反應(yīng)混合物中每隔一定時(shí)間取出1 ml 樣品，經(jīng)過乙酸乙酯充分萃取之后，用于HPLC分析。

1.2.5 分析方法 從反應(yīng)液中取出1 ml 樣品，將樣品置于沸水浴10 min 終止反應(yīng)，用4 ml 乙酸乙酯充分萃取。 離心后，取1 ml 上層溶液通過ThermoFisher HPLC 分析，色譜柱為Diamonsil C18（2），5 μm，250 mm×4.6 mm，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器。在254 nm 處檢測(cè)到ADD 和寶丹酮，流動(dòng)相由甲醇和水（70∶30,體積比）組成。流速為1 ml·min-1，柱溫為30℃[16]。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 17β-羥基類固醇脫氫酶基因的篩選

在目前關(guān)于甾體17β-還原的研究中，發(fā)現(xiàn)了具有17β-還原活性的菌株，但是由于存在活性不高、缺乏對(duì)編碼17β-HSD 基因的鑒定和對(duì)相應(yīng)蛋白質(zhì)的純化和活性分析等問題[1,3,11,17-18]，限制了甾體藥物的大規(guī)模生產(chǎn)。需要進(jìn)一步豐富酶資源，以及選取合適的宿主進(jìn)行表達(dá)，實(shí)現(xiàn)寶丹酮的經(jīng)濟(jì)高效合成[19]。以成功表達(dá)甾體17β還原活性的酶[12]為基礎(chǔ)，根據(jù)其氨基酸序列，跨種屬地在多種分枝桿菌、紅球菌等宿主間，以及原核和真核生物間，進(jìn)行了17β-HSD 序列的同源性分析和序列比對(duì)[20]，結(jié)果如圖2所示。

由圖可知，來源于Cochliobolus lunatus、Comamonas testosterone和Mycobacterium neoaurumVKM Ac-1815D 的17β-HSD 分別被分到三個(gè)獨(dú)立的簇。對(duì)序列的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析[21]，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)17β-HSD 屬于短鏈脫氫酶家族，具有一段輔因子結(jié)合特征序列TGXXXGXG 或TGXXGXXG 和活性位點(diǎn)特征序列YXXXK。分別選取了來源于真菌Cochliobolus lunatus（GenBank ID：AAR04485.1），Pyrenochaetasp.（GenBank ID：OAL44739.1，同源性96%） ，Beauveria bassiana（GenBank ID：XP_002844741.1，同 源 性 93%），Arthroderma otae（GenBank ID：XM_002844695.1，同源性80%）和來源 于 細(xì) 菌Comamonas testosterone（GenBank ID：CAA44977.1） ，Burkholderiasp. （GenBank ID：SIO70547.1，同源性48%）的六種不同17β-HSD，用于進(jìn)行下一步研究。由于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景比較清楚、培養(yǎng)周期短、目標(biāo)基因表達(dá)水平高等優(yōu)勢(shì)，將這六種不同17β-HSD 在大腸桿菌中進(jìn)行了異源表達(dá)，以驗(yàn)證它們是否能夠成功地表達(dá)生物學(xué)活性[22]。

圖2 17β-HSD的同源性分析和序列比對(duì)Fig.2 Homology analysis and sequence alignment of 17β-HSD

2.2 重組17β-HSD的構(gòu)建表達(dá)和活性分析

由于難以從天然來源直接獲得高效表達(dá)17β-HSD 的菌株，因此嘗試使用大腸桿菌作為表達(dá)宿主通過DNA 重組技術(shù)，異源過表達(dá)17β-HSD[23-25]。根據(jù)1.2.1 節(jié)中的方法，進(jìn)行重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSD 的構(gòu)建，PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳，顯示目的基因的條帶大小約為820 bp，重組質(zhì)粒經(jīng)過BamH Ⅰ和Hind Ⅲ進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖3 所示。由圖可知，兩個(gè)目的條帶的大小分別約為5.40 kb 和820 bp，表明目的基因成功連接到pET28a(+)載體上，測(cè)序結(jié)果也表明各個(gè)重組pET28a-HSD質(zhì)粒構(gòu)建成功。

按照1.2.2 節(jié)所述的方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以及SDS-PAGE 分析，結(jié)果如圖4 所示。由圖可知，目的蛋白條帶約在30×103處，與預(yù)期的目的17β-HSD 蛋白大小一致，可以初步確認(rèn)各個(gè)17β-HSD在大腸桿菌BL21中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。

圖3 重組質(zhì)粒pET28a-HSD酶切驗(yàn)證Fig.3 Identification of recombinant pET28a-HSD by enzyme digestion

六種重組17β-HSD 在大腸桿菌中成功表達(dá)之后，為了進(jìn)一步分析各種不同17β-HSD 在重組大腸桿菌中的活性，考察了各個(gè)重組BL21/pET28a-HSD對(duì)底物ADD 的轉(zhuǎn)化情況，結(jié)果如表2。發(fā)現(xiàn)BL21/pET28a-HSDCl、 BL21/pET28a-HSDPy 和 BL21/pET28a-HSDBb 具有17β-還原催化的活性，在轉(zhuǎn)化過程中生成了寶丹酮，其中BL21/pET28a-HSDPy 對(duì)ADD的轉(zhuǎn)化率最高，在12 h內(nèi)轉(zhuǎn)化1 g·L-1ADD生成了0.72 g·L-1寶 丹 酮，比BL21/pET28a、BL21/pET28a-HSDCl、 BL21/pET28a-HSDBb、 BL21/pET28a-HSDAo、BL21/pET28a-HSDCt 和 BL21/pET28a-HSDBu 分 別 高 88.1%、24.3%、68.1%、86.0%、87.1%和87.5%。這些結(jié)果表明HSDPy 具有更高的催化潛力，因此對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。

2.3 重組酶HSDPy的酶學(xué)性質(zhì)分析

圖4 重組大腸桿菌17β-HSD SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of 17β-HSD expression in recombinant E.coli

表2 重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSD轉(zhuǎn)化ADDTable 2 Conversion of ADD by recombinant E.coli BL21/pET28a-HSD

圖5 pH（a）和溫度（b）對(duì)HSDPy酶活性的影響Fig.5 Effects of pH(a)and temperature(b)on activity of HSDPy

圖6 不同金屬離子及EDTA對(duì)HSDPy酶活性的影響Fig.6 Effect of different metal ions and EDTA on activity of HSDPy

將重組酶純化后，按照1.2.3 節(jié)的方法，分析了HSDPy的最適pH、最適溫度以及金屬離子對(duì)其酶活性的影響。如圖5、圖6 所示，重組HSDPy 的最適反應(yīng)pH 為7.5，在最適條件pH 下，將純酶放置于不同的溫度下進(jìn)行反應(yīng)，然后檢測(cè)酶活性，以確定其最適反應(yīng)溫度。結(jié)果表明，隨著反應(yīng)溫度升高，HSDPy的相對(duì)酶活也逐漸提高，在溫度達(dá)到37℃時(shí)，重組酶的酶活力達(dá)到最高，然后隨著溫度的上升，酶活迅速下降。因此，可以確定重組HSDPy 在pH 為7.5條件下的最適反應(yīng)溫度為37℃。該重組酶的最佳pH 和溫度與先前的研究一致[15]。在上述最適的反應(yīng)pH 和溫度的條件下，在反應(yīng)體系中添加不同的金屬離子和EDTA（終濃度為1 mmol·L-1），檢測(cè)相應(yīng)的酶活，其中Na+、K+和EDTA 對(duì)重組HSDPy 的酶活性影響較小，Mg2+、Mn2+、Ca2+、Ni2+、Fe2+使酶活顯著降低，F(xiàn)e3+、Zn2+使酶失活。

2.4 重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy 轉(zhuǎn)化ADD生產(chǎn)寶丹酮

根據(jù)2.2 節(jié)的結(jié)果，經(jīng)過6 株重組菌對(duì)ADD 的轉(zhuǎn)化能力驗(yàn)證和比較后，確定了重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy 的催化活性最高，為了進(jìn)一步提高寶丹酮的產(chǎn)量，對(duì)底物濃度、生物量等全細(xì)胞催化的條件進(jìn)行了優(yōu)化[15,26]。

生物量對(duì)生物轉(zhuǎn)化具有重要影響，在轉(zhuǎn)化過程中會(huì)影響底物的吸收和細(xì)胞的呼吸[27]。針對(duì)重組菌BL21/pET28a-HSDPy 不同生物量轉(zhuǎn)化ADD 生成寶丹酮的研究結(jié)果如圖7(a)所示。隨著生物量的增加，寶丹酮的產(chǎn)量也逐漸增加，在生物量達(dá)到36 g·L-1時(shí)，達(dá)到最大值，對(duì)應(yīng)寶丹酮的產(chǎn)量為0.85 g·L-1。當(dāng)生物量大于36 g·L-1時(shí)，ADD 的轉(zhuǎn)化率在12 h 內(nèi)不再增加。轉(zhuǎn)化率降低的原因可能是高密度細(xì)胞抑制細(xì)胞傳質(zhì)效率和細(xì)胞呼吸，進(jìn)而降低了細(xì)胞對(duì)底物的利用。在重組大腸桿菌表達(dá)11β-羥基類固醇脫氫酶，催化氫化可的松合成為11β-氫化可的松的過程中，也出現(xiàn)了類似結(jié)果[28]。

由于ADD 難溶于水，在轉(zhuǎn)化過程中會(huì)限制重組菌對(duì)底物的利用[29]，過量的底物對(duì)細(xì)胞有毒害作用，因此將ADD 轉(zhuǎn)化為寶丹酮時(shí)需要在合適的底物濃度下進(jìn)行。隨著底物濃度的增加，ADD 的轉(zhuǎn)化率逐漸增加，如圖7(b)所示。底物濃度超過2 g·L-1后，寶丹酮的產(chǎn)量不再提高，表明底物濃度為2 g·L-1的條件下，已經(jīng)達(dá)到了最大的底物利用率。之后底物濃度再升高，寶丹酮的產(chǎn)量反而降低，可能是由于高濃度底物對(duì)17β-HSD活性的抑制作用[30]。

在上述最佳條件下，將重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy 在5 L 發(fā)酵罐中進(jìn)行了從ADD 到寶丹酮的轉(zhuǎn)化。如圖8(a)所示，生物轉(zhuǎn)化12 h 后，從2 g·L-1ADD 中獲得了1.46 g·L-1寶丹酮，在轉(zhuǎn)化過程中未檢測(cè)到副產(chǎn)物。由于大部分已鑒定的17β-HSD 可以催化可逆的氧化還原反應(yīng)[6-7]，推測(cè)大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy 無法將ADD 完全轉(zhuǎn)化為寶丹酮可能是因?yàn)榇嬖诳赡娴姆磻?yīng)。由于全細(xì)胞催化受到高濃度底物的限制，可以使用同一批生物催化劑通過分批補(bǔ)料策略來獲得更高的寶丹酮產(chǎn)量。

圖7 大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy的不同生物量（a）和不同底物濃度（b）對(duì)寶丹酮生產(chǎn)的影響Fig.7 Effects of different biomasses of E.coli BL21/pET28a-HSDPy(a)and substrate concentration(b)on BD production

圖8 分批轉(zhuǎn)化（a）和補(bǔ)料分批轉(zhuǎn)化（b）ADD合成寶丹酮的過程Fig.8 Batch conversion(a)and fed-batch conversion(b)of ADD to synthesize BD

補(bǔ)料分批轉(zhuǎn)化的結(jié)果如圖8(b)所示。生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中ADD 的初始濃度為2 g·L-1，每12 h 將1.7 g·L-1ADD 補(bǔ)充到轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中，以使生物催化反應(yīng)在最佳底物濃度的條件下繼續(xù)進(jìn)行?？梢钥闯觯谇皟膳磻?yīng)中，寶丹酮的產(chǎn)量穩(wěn)定增加。但是，在第三批轉(zhuǎn)化過程中寶丹酮的生產(chǎn)率逐漸下降，這主要是由于高濃度產(chǎn)物的限制。在生物轉(zhuǎn)化38 h 后，從5.40 g·L-1ADD 中獲得了3.66 g·L-1寶丹酮，生產(chǎn)率為0.10 g·L-1·h-1，比優(yōu)化之前（0.72 g·L-1、0.06 g·L-1·h-1）提高了60.5%，產(chǎn)量是優(yōu)化之前的4.1倍。

總之，這些結(jié)果證明，通過補(bǔ)料分批策略對(duì)重組大腸桿菌BL21/pET28a-HSDPy 進(jìn)行全細(xì)胞生物催化可以實(shí)現(xiàn)較高的寶丹酮產(chǎn)量。此外，與甾醇的發(fā)酵生產(chǎn)相比，本研究所提出的生物轉(zhuǎn)化過程相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要無菌環(huán)境并且從轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中純化寶丹酮也相對(duì)簡(jiǎn)單。該研究為制藥工業(yè)中寶丹酮的生產(chǎn)提供了有前景的生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和有效的方法。

3 結(jié) 論

本研究鑒定了來源于Pyrenochaetasp.的17β-HSD 具有較高的還原活性（對(duì)ADD 的轉(zhuǎn)化率為72%），研究了其酶學(xué)性質(zhì)（最適pH 為7.5，最適溫度為37℃，以及除了Na+、K+，大部分金屬離子會(huì)抑制其活性）。

在大腸桿菌中以ADD 為底物實(shí)現(xiàn)了寶丹酮的生物合成，并且通過全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化（最佳轉(zhuǎn)化生物量為36 g·L-1和最佳底物濃度為2 g·L-1），以及分批補(bǔ)料策略（初始底物濃度2 g·L-1，補(bǔ)料兩次，共進(jìn)行三批轉(zhuǎn)化），使寶丹酮的產(chǎn)量由最初的0.72 g·L-1提高到3.66 g·L-1，產(chǎn)量提高了4.1 倍。另外，在轉(zhuǎn)化過程中未檢測(cè)到副產(chǎn)物。

后續(xù)研究可通過構(gòu)建輔酶循環(huán)體系（例如共表達(dá)6-磷酸葡萄糖脫氫酶[15,31]，為反應(yīng)提供可再生的還原力）進(jìn)一步提升寶丹酮的產(chǎn)量。還可通過更換底盤細(xì)胞（如以釀酒酵母為底盤細(xì)胞[32-34]，利用葡萄糖為底物合成寶丹酮）進(jìn)一步降低生產(chǎn)的成本。

本研究提供了一種在單次生物轉(zhuǎn)化中獲得寶丹酮的有效方法，為生物合成寶丹酮提供了可能。