封悅洋，王穎，姚明東，肖文海，丁明珠

（1 天津大學(xué)前沿技術(shù)研究院，天津301700； 2 天津大學(xué)合成生物學(xué)前沿科學(xué)中心，天津300072；3天津大學(xué)系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300072）

引 言

糖苷是自然界中最普遍和最重要的物質(zhì)之一，它在細(xì)胞通訊和生命協(xié)調(diào)中起到核心作用。糖苷類衍生物是在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下將糖基連接到苷元上而形成的一類產(chǎn)物。在植物中，糖苷分布廣泛，種類繁多。這些糖苷類衍生物往往表現(xiàn)出良好的溶解、生物活性或穩(wěn)定性[1]。例如紅霉素[2]的糖基化可以提高水溶性，盞燈花素[3]和熊果苷[4]具有抗癌、抗氧化作用，而槲皮素[5]的糖基化可以通過(guò)保護(hù)其敏感化學(xué)基團(tuán)和不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)來(lái)提高其穩(wěn)定性，并對(duì)α-葡萄糖苷酶或P450 酶表現(xiàn)出活性抑制作用[6-7]。

植物提取是獲得糖苷最普遍的方法，而有些植物生長(zhǎng)周期長(zhǎng)[8]，且產(chǎn)量嚴(yán)重依賴于地理位置、季節(jié)環(huán)境等多種因素。天然糖苷的有機(jī)合成仍然存在挑戰(zhàn)，特定糖苷鍵的立體選擇性形成常常受到許多反應(yīng)基團(tuán)的影響[9]，這需要各種保護(hù)和去保護(hù)步驟，由此產(chǎn)生的有毒廢物使其無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。因此，在高市場(chǎng)需求和可持續(xù)性的推動(dòng)下，生物發(fā)酵成為有發(fā)展?jié)摿Φ慕鉀Q方案。隨著微生物細(xì)胞工廠的廣泛應(yīng)用，目前已經(jīng)在大腸桿菌和釀酒酵母等模式生物中合成多種植物糖苷，如紅景天苷[10]、東莨菪素[11]、人參皂苷[12]、香蘭素-4-O-葡糖苷[13]、天竺葵-3-O-葡萄糖苷[14]等。但糖苷在微生物中的產(chǎn)量并不高。主要問(wèn)題在于糖基轉(zhuǎn)移酶與底物的適配性、前體UDP-糖供給不足或者宿主合成的植物苷元含量低不足以進(jìn)行糖基化反應(yīng)、有些植物苷元對(duì)微生物宿主產(chǎn)生毒性等，這些問(wèn)題阻礙了生物合成糖苷產(chǎn)量的提升[15-17]。

槲皮素是自然界中最廣泛的一種黃酮類化合物，有100多種植物含有槲皮素，目前已經(jīng)在植物中鑒定出300 多種不同的槲皮素糖苷類衍生物[15]。早在2004 年就已經(jīng)實(shí)現(xiàn)槲皮素-3-單葡萄糖苷、槲皮素-3,7-雙葡萄糖苷的生物合成[18-19]。由于槲皮素糖苷衍生物具有抗癌、抗氧化等多種生物學(xué)效應(yīng)[20]，成為國(guó)內(nèi)外諸多領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近些年來(lái)隨著合成生物學(xué)和代謝工程的快速發(fā)展，利用工程菌株生物合成槲皮素糖苷取得了巨大的進(jìn)展。本文將以槲皮素糖苷的生物合成為例，對(duì)槲皮素糖苷類衍生物的前體槲皮素和糖基單元以及糖基轉(zhuǎn)移酶的催化反應(yīng)過(guò)程進(jìn)行系統(tǒng)的闡述，對(duì)提高工程菌株生物合成糖苷類化合物進(jìn)行綜述和展望，為以后的深入研究和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 槲皮素糖苷類衍生物

槲皮素分子含有5 個(gè)羥基，又稱為3,5,7,3',4'-五羥基黃酮。槲皮素中的C-3、C-7 和C-4'位羥基易于發(fā)生糖基化反應(yīng)。研究表明，二磷酸尿苷糖（UDP-sugars）是植物糖苷的糖基提供者，槲皮素和二磷酸尿苷糖在糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT）的催化作用下可形成糖苷，如槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-4'-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷。此外，槲皮素分子上可以連接多個(gè)糖基單元，從而形成槲皮素二糖或多糖（圖1），如槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷、槲皮素-3,7-O-雙葡萄糖苷[21]。

1.1 槲皮素的生物合成

槲皮素是一種生物活性黃酮醇，主要存在于洋蔥、蘋果、漿果和西蘭花等經(jīng)常食用的植物性食物中。它具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用，且對(duì)人體無(wú)毒[20]。槲皮素的生物合成，依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和質(zhì)膜上多種酶的協(xié)同作用[22]。其中，第一步是苯丙烷合成途徑，該途徑通過(guò)三個(gè)酶將苯丙氨酸（Phe）轉(zhuǎn)化為4-香豆酰輔酶A。隨后，通過(guò)苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）、肉桂酸4-羥化酶（C4H）和4-香豆酰輔酶A 連接酶（4CL）的依次催化作用[23]，形成4-香豆酰基輔酶A分子。然后，在查爾酮合酶（CHS）作用下將一分子4-香豆?；o酶A與三分子丙二酰基-CoA 縮合，生成柚皮素查爾酮，這是9000 多種黃酮類衍生物的基本骨架[24]。接著，查耳酮異構(gòu)酶（CHI）催化雜環(huán)C 的閉合，生成柚皮素，柚皮素是所有黃酮醇的通用前體。柚皮素借助黃酮3-羥化酶（F3H）合成二氫山柰酚，二氫山柰酚作為黃酮3'-羥化酶(F3'H)的底物生成二氫槲皮素，最后通過(guò)黃酮醇合成酶1（FLS1）的作用合成槲皮素[25]（圖2）。

圖1 槲皮素及其糖苷衍生物Fig.1 Quercetin and its glycoside derivatives

圖2 植物中槲皮素生物合成路徑Fig.2 Biosynthetic pathway for quercetin biosynthesis in plant

目前在多種微生物中實(shí)現(xiàn)了槲皮素的生物合成。利用工程酵母體外添加苯丙氨酸作為初始前體，在酵母中添加植物外源基因，即來(lái)自楊樹（Poplar）的PAL，來(lái) 自 大 豆(Glycine max)的C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3'H 和來(lái)自馬鈴薯(Solanum tuberosum)的FLS，實(shí)現(xiàn)槲皮素的生物合成，產(chǎn)量為0.38 mg/L[26]。在生產(chǎn)對(duì)香豆酸的大腸桿菌中添加6種植物來(lái)源的生物合成酶（即F3'5'H-CPR，4CL,CHS, CHI, FHT, FLS）實(shí)現(xiàn)了槲皮素的生物合成[27]。在鏈霉菌中，使用來(lái)自莢膜紅細(xì)菌（Rhodobacter capsulatus）的酪氨酸氨裂合酶（TAL）進(jìn)行異源生物合成，將L-Tyr直接轉(zhuǎn)化為對(duì)香豆酸，同時(shí)引入荷蘭芹（Petroselinum crispum）來(lái)源的柚皮素3-雙加氧酶（N3DOX）合成二氫山柰酚，最后通過(guò)來(lái)自擬南芥（Arabidopsis thaliana）的F3'H 和FLS1 首次在鏈霉菌中實(shí)現(xiàn)了槲皮素的全合成，產(chǎn)量為0.599 mg/L[28]。在谷氨酸棒狀桿菌中，以咖啡酸作為前體，分別表達(dá)來(lái)自荷蘭芹（Petroselinum crispum）的4CL，矮牽牛（Petunia x hybrida）的CHS、CHI 和F3H 以及來(lái)自非洲黑楊（Populus deltoides）的FLS 實(shí)現(xiàn)槲皮素的生物合成，滴度達(dá)到10 mg/L[29]。

由于槲皮素生物合成路徑所必需的基因數(shù)量多，異源生物合成系統(tǒng)的效率低，因此微生物合成槲皮素產(chǎn)量較低。此外，異源合成途徑中諸多的細(xì)胞色素P450 羥化酶都需要合適的P450 氧化還原酶（CPR）[30]作為還原配體，這也成為槲皮素異源合成的限速步驟之一。近年來(lái)，針對(duì)這一問(wèn)題，在工程酵母中將擬南芥來(lái)源的C4H 和細(xì)胞色素P450 還原酶(ATR2) 配合使用，并過(guò)表達(dá)來(lái)自長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）的CPR 和 矮 牽 牛（Petunia hybrida）的細(xì)胞色素P450 黃酮類單加氧酶(FMO)的融合蛋白CPR-FMO，可以提高類黃酮的生產(chǎn)代謝能力，使得槲皮素的產(chǎn)量達(dá)到20.38 mg/L[31]，這是目前微生物合成槲皮素的最高產(chǎn)量。微生物生物合成槲皮素產(chǎn)量的大幅提升為下一步槲皮素糖苷的生物合成奠定了基礎(chǔ)。

1.2 UDP-sugars的供給

UDP-sugars 作為糖苷合成的糖基供體主要包括UDP-葡萄糖(UDPG)、UDP-鼠李糖(UDP-Rha)、UDP-半乳糖（UDP-Gal）、UDP-阿拉伯糖（UDPAra）、UDP-木糖（UDP-Xyl）、UDP-葡萄糖醛酸酯（UDP-GlcA）、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDPGlcNAc)。這些UDP-sugars 的生物合成相互關(guān)聯(lián)，其中UDPG 是最重要的前體（圖3）。在微生物中葡萄糖經(jīng)過(guò)葡萄糖激酶磷酸化后形成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)，經(jīng)磷酸變位酶催化生成葡萄糖-1-磷酸(G-1-P)，其作為底物與等摩爾的尿苷三磷酸(UTP)在葡萄糖-1-尿苷轉(zhuǎn)移酶的催化下形成UDPG[32-33]。UDPG 被UDP-葡萄糖-4-表異構(gòu)酶催化形成UDP-半乳糖[34]，而經(jīng)過(guò)UDPG 脫氫酶氧化形成UDP-葡萄糖醛酸酯[35-36]。UDP-葡萄糖醛酸酯經(jīng)過(guò)脫羧反應(yīng)形成UDP-木糖[34-35]，UDP-木糖經(jīng)過(guò)UDP-木糖差向異構(gòu)化合成UDP-阿拉伯糖[37]。UDP-N-乙酰氨基葡萄糖以G-6-P 為前體，通過(guò)己糖胺生物合成(HBS)途徑合成[38]。UDP-鼠李糖廣泛存在于植物中，以UDPG 為底物經(jīng)鼠李糖合成酶（RHM）催化合成[39]。UDP-sugars作為生物代謝中的核心底物還被用于細(xì)胞壁的合成，氨基糖、核酸糖的代謝，以及微生物中次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。因此微生物內(nèi)UDPsugars 供給不足是目前生物合成槲皮糖苷的關(guān)鍵問(wèn)題之一。

1.3 糖基轉(zhuǎn)移酶

糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）可以將糖基供體上的糖基單元轉(zhuǎn)移到苷元上，形成多種糖苷類化合物。GTs 作為一個(gè)龐大的酶家族，根據(jù)其氨基酸序列相似性、形成糖苷的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)和已知底物的特異性，被分為98個(gè)家族。其中1號(hào)GTs家族含有的糖基轉(zhuǎn)移酶數(shù)量最多，且大部分成員在糖基化反應(yīng)中以UDP-sugars 作為糖基轉(zhuǎn)移體，因此又被稱為尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶（UGTs）。植物中繁雜的糖基轉(zhuǎn)移酶可以特異性結(jié)合底物，從而產(chǎn)生不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物。所有植物糖基轉(zhuǎn)移酶中存在一個(gè)保守序列，即植物次生代謝特征序列（PSPG box），它是作為鑒定未知酶是否為糖基轉(zhuǎn)移酶的參考依據(jù)[40-42]。

圖3 UDP-sugars生物合成途徑Fig.3 UDP-sugars biosynthesis pathway

Willits 等[43]最早在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)槲皮糖苷的合成。他們將擬南芥中的AtUGT73B2 克隆至大腸桿菌中，酶純化后，以槲皮素為底物進(jìn)行孵育，HPLC檢測(cè)得到槲皮素-7-O-葡萄糖苷和槲皮素-3,7-O-雙葡糖苷。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，大腸桿菌過(guò)表達(dá)AtUGT73B2，體外飼喂槲皮素進(jìn)行發(fā)酵，HPLC 檢測(cè)同樣得到與體外實(shí)驗(yàn)相同的產(chǎn)物。隨后Lim 等[44]分析了擬南芥中91 種糖基轉(zhuǎn)移酶的體外活性，發(fā)現(xiàn)AtUGT88A1 可以體外合成四種槲皮素單糖苷，分別是槲皮素-7-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3'-O-葡萄糖苷、槲皮素-4'-O-葡萄糖苷；AtUGT76E12 和AtUGT71C1 分別合成槲皮素-3,7-O-雙葡糖苷和槲皮素-7,3'-O-雙葡糖苷。利用大腸桿菌過(guò)表達(dá)擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶并外加槲皮素作為底物，HPLC 檢測(cè)可以發(fā)現(xiàn)AtUGT76E12 和AtUGT71C1 合成3-O-，7-O-，3'-O-，3,7-di-O-，7,3'-di-O-葡糖苷，AtUGT74F1 合成4'-O-葡萄糖苷。因?yàn)锳tUGT73B3 在大腸桿菌體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中特異性合成單一產(chǎn)物槲皮素-3-O-葡萄糖苷且產(chǎn)量最高（8.96 mg/L），Lim 等[44]將表達(dá)AtUGT73B3 的大腸桿菌在發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，得到槲皮素-3-O-葡萄糖苷產(chǎn)量為99.3 mg/L，產(chǎn)率為10%。近幾年通過(guò)對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶的研究以及宿主內(nèi)UDP-sugars 代謝路徑的改造合成了多種槲皮素糖苷衍生物，表1 綜述了各種槲皮素糖苷的生物合成。

2 槲皮素糖苷類衍生物的微生物合成

宿主內(nèi)UDP-sugars 的供給以及糖基轉(zhuǎn)移酶的選擇對(duì)糖苷的生產(chǎn)至關(guān)重要。為提高工程菌株中糖基前體的供給，常用的策略包括過(guò)表達(dá)天然UDP-sugar 合成路徑中的基因、敲除消耗UDPsugars 的非必需途徑，以減弱天然代謝網(wǎng)絡(luò)對(duì)UDPsugars 的調(diào)控。對(duì)不同來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶的篩選以及酶改造可以提高糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)UDP-sugars 的親和力從而提高糖苷的合成。

表1 槲皮素糖苷在大腸桿菌中的生物合成Table 1 Biosynthesis of quercetin glycosides in E.coli

2.1 糖基轉(zhuǎn)移酶功能性改造

雖然有些UGT 具有廣泛的底物特異性，但大部分糖基轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)出糖供體和底物特異性[56-57]。例如來(lái)自植物的F7GAT 是一種類黃酮7-O-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，其Arg350 與UDP-GlcA 葡糖醛酸部分的陰離子羧酸鹽接近，Ser127 可能也與它的羧酸氧形成氫鍵。這兩個(gè)氨基酸對(duì)于識(shí)別UDP- GlcA 至關(guān)重要[58]。紅雛菊(Bellis perennis)中的BpUGT94B1 也是UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶，其分子模擬表明，Arg25的長(zhǎng)帶正電荷側(cè)鏈在葡萄糖醛酸C6位置的負(fù)電荷羧基附近延伸，與之相互作用，識(shí)別這種糖[59]。UDPG 中的葡萄糖部分主要與PSPG Box 中的最后兩個(gè)殘基谷氨酸和色氨酸相互作用，使2-，3-，4-OH 形成多個(gè)氫鍵。這些殘基和區(qū)域是糖識(shí)別和結(jié)合的決定因素[15]。

由于還沒(méi)有UGTs 被報(bào)道使用UDP-木糖作為糖供體，Han 等[60]利用模擬的UGT 進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，尋找對(duì)UDP-木糖親和力高的糖基轉(zhuǎn)移酶。AtUGT78D3（以UDP-Ara 為底物）由于其三維結(jié)構(gòu)已被確定，所以被用于對(duì)接研究。AtUGT78D3 的His 380 會(huì)與UDP-木糖的磷酸相結(jié)合，這種結(jié)合導(dǎo)致槲皮素的3-羥基(糖附著位點(diǎn))與UDP-木糖之間的距離為4.45 ?(1 ?=0.1 nm) [圖4(a)]。這表明，UDP-木糖和槲皮素與AtUGT78D3 的結(jié)合可能是無(wú)效的。用Gln380 取代His380 后，槲皮素的3-羥基與UDP-木糖的距離為3.67 ?，因此AtUGT78D3(H380Q)使得UDP-木糖與槲皮素的結(jié)合更加緊密[圖4(a)]。對(duì)接結(jié)果通過(guò)定點(diǎn)突變進(jìn)行了驗(yàn)證，UGT78D3(H380Q)對(duì)UDP-木糖表現(xiàn)出明顯的親和力。通過(guò)過(guò)表達(dá)基因ugd，增強(qiáng)UDPG 到UDP-GlcA的轉(zhuǎn)化，敲除UDP-葡萄糖醛酸C-4-脫羧酶(編碼基因arnA)減少UDP-GlcA 的消耗[61]，最終得到槲皮素-3-O- 糖 150 mg/L[50]。 來(lái) 自 苜 蓿（Medicago truncatula）的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT71G1 通過(guò)酶工程[62]改造表明，UGT71G1 突變體F148V 和Y202A 顯著改變了槲皮素糖基化的區(qū)域選擇性[圖4(b)]，從識(shí)別B 環(huán)的3'-O-位轉(zhuǎn)為識(shí)別C 環(huán)的3-O-位，主要產(chǎn)生槲皮素3-O-葡萄糖[63-64]。

圖4 糖基轉(zhuǎn)移酶功能性改造范例Fig.4 Paradigms for functional modification of glycosyltransferases

結(jié)構(gòu)域交換也是一種酶工程策略，可生成用于糖基化反應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶嵌合體。糖基轉(zhuǎn)移酶的UGT74F1 和UGT74F2 通過(guò)交換結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生了嵌合體，該嵌合體改變了槲皮素上原有糖基化位點(diǎn)的偏好和特異性，產(chǎn)生了對(duì)槲皮素的4-OH 糖基化的新偏好，并且UGT74F1單個(gè)突變N142Y 也增加了對(duì)槲皮素4'-OH的催化選擇性[65][圖4(c)]。

2.2 UDP-sugars內(nèi)源合成途徑的優(yōu)化

在大腸桿菌中合成槲皮素糖苷衍生物是目前的研究熱點(diǎn)[66-67]。通過(guò)對(duì)大腸桿菌天然UDP-sugars代謝途徑進(jìn)行調(diào)控從而提高糖基前體的供給[68]。大腸桿菌中UDPG 的天然代謝路徑是從外界攝取葡萄糖開始，經(jīng)過(guò)葡萄糖激酶、磷酸變位酶和UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷轉(zhuǎn)移酶得到UDPG。

Pandey 等[69]將來(lái)自皮諾卡氏菌(Nocardia farcinica)的葡萄糖磷酸變位酶（編碼基因nfa44530）引入大腸桿菌，該酶催化從G-6-P 到G-1-P 的生化反應(yīng)。將基因naf44530與galU融合過(guò)表達(dá)，提高了合成UDP-sugars重要前體UDPG的供給。而G-6-P是合成UDPG 的前體，在大腸桿菌中G-6-P 會(huì)被6-磷酸葡萄糖1-脫氫酶和磷酸葡糖異構(gòu)酶分別轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯(6-phosphogluconolactone)和果糖-6-磷酸（F-6-P）。利用堿基突變破壞染色體上的zwf和pgi基因，減少G-6-P 的消耗。同樣的方法破壞UDPG 水解酶減少UDPG 的降解，同時(shí)過(guò)表達(dá)來(lái)自棘孢小單孢菌(Micromonospora echinosporasp.Calichenesis)的UDP-葡萄糖脫氫酶增加了UDPG 向UDP- GlcA 的碳通量。由于大腸桿菌中沒(méi)有從UDP-GlcA 到UDP-Xyl 的天然代謝途徑，通過(guò)引入棘孢小單孢菌的UDP-葡萄糖醛酸脫氫酶實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌中UDP-Xyl 的生物合成(圖5)。通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶AtGt3催化3-OH 的糖基化反應(yīng)，最終實(shí)現(xiàn)了槲皮素-3-木糖的生物合成[49]。

相似的方法也用于槲皮素-3-葡糖苷酸的合成。Kim 等[51]通過(guò)過(guò)表達(dá)大腸桿菌內(nèi)源基因ugd，敲除UDP-葡萄糖醛酸C-4 脫羧酶阻斷UDP-GlcA 向UDP-戊酮糖的轉(zhuǎn)化。經(jīng)糖基轉(zhuǎn)移酶VvUGT 催化，槲皮素-3-葡糖苷酸產(chǎn)量為687 mg/L(圖5)。

2.3 UDP-sugars合成路徑的正交化設(shè)計(jì)

大部分UDP-sugars 的合成依賴于G-6-P 至G-1-P 的生物轉(zhuǎn)化，由于G-6-P 還會(huì)用于糖酵解和戊糖磷酸途徑（PPP），因此G-6-P 的合成被認(rèn)為是主要瓶頸[70]。因此有必要新建一條UDP-sugars 合成路徑，該路徑與宿主內(nèi)源UDP-sugars 合成路徑正交，分別用于糖苷合成和菌體生長(zhǎng)。植物蔗糖合酶（sucrose synthase,SUS,EC 2.4.1.13）,以NDP-葡萄糖和果糖為底物催化合成蔗糖，同時(shí)，蔗糖合酶也可將蔗糖直接水解為果糖和UDPG，從而進(jìn)行UDPsugars 的合成（圖6）。Pei 等[48]通過(guò)將大豆蔗糖合酶(GmSUS)與UDP-葡萄糖-4-表異構(gòu)酶偶聯(lián)，合成UDP-半乳糖，通過(guò)對(duì)槲皮素具有高活性的矮牽牛糖基轉(zhuǎn)移酶（PhUGT）合成槲皮素-3-半乳糖苷。糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)后會(huì)生成一分子UDP，UDP 在蔗糖合酶和UDP-葡萄糖-4-表異構(gòu)酶催化下再生出UDPGal(圖6)。這種UDP-sugars 再生系統(tǒng)不僅降低了所需的UDP-sugars底物成本，而且還避免了UDP對(duì)產(chǎn)物的抑制[16,71-72]。這一策略使得槲皮素-3-半乳糖苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)到92%，產(chǎn)物最終滴度為2134 mg/L[48]。

圖5 大腸桿菌中UDP-sugars內(nèi)源合成路徑優(yōu)化Fig.5 Optimization of UDP-sugars endogenous synthesis pathway in E.coli

圖6 大腸桿菌中UDP-sugars合成路徑的正交化設(shè)計(jì)Fig.6 Orthogonal design of UDP-sugars synthesis pathway in E.coli

另一種蔗糖代謝路徑來(lái)自于雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescentis)。將雙歧桿菌蔗糖磷酸化酶(BaSP)引入大腸桿菌，蔗糖被分解為果糖和G-1-P，果糖用于生長(zhǎng)目的，G-1-P 在尿苷轉(zhuǎn)移酶（來(lái)自于雙歧桿菌）催化下用于合成UDPG 的前體。為了防止G-1-P 轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)前體，敲除了參與G-1-P 代謝的幾種內(nèi)源基因[73]，如pgm和葡萄糖-1-磷酸酶編碼基因agp。通過(guò)敲除基因ushA和半乳糖操縱子有效地防止UDPG 的代謝（圖6）。同時(shí)過(guò)表達(dá)擬南芥來(lái)源的鼠李糖合成酶（MUM4）保證了UDPRha 的供給[74]。引入擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶(AtGt)最終槲皮素-3-鼠李糖苷的產(chǎn)量為1120 mg/L[47]。

3 展 望

以槲皮素為例，綜述了微生物生產(chǎn)糖苷類化合物的合成策略。著重?cái)⑹隽碎纹に氐纳锖铣赏緩?，所需的糖基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)結(jié)構(gòu)改造調(diào)整糖基轉(zhuǎn)移酶的特異性，以及調(diào)控內(nèi)源路徑和引入正交化的UDP-sugars 合成路徑來(lái)提升前體UDP-sugars 的供給等工程策略，實(shí)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)和糖苷合成之間的平衡。這些策略使微生物高產(chǎn)糖苷類化合物成為可能，但在實(shí)際生產(chǎn)中仍存在一系列挑戰(zhàn)，如過(guò)表達(dá)酶的不溶性、工業(yè)放大中苷元轉(zhuǎn)運(yùn)以及廉價(jià)混合碳原的生物利用效率等。未來(lái)通過(guò)使用分子伴侶和助溶蛋白標(biāo)簽將會(huì)改善酶的可溶性表達(dá)，通過(guò)引入轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或調(diào)控細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)有望提高苷元的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。

盡管大規(guī)模糖苷類生物合成還處于起步階段，但隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，微生物在特定代謝產(chǎn)物的合成方面已經(jīng)取得了許多進(jìn)展。尤其是人工合成酵母的問(wèn)世[75-76]，可以讓人們更理性更高效地實(shí)現(xiàn)基因的大片段重組和優(yōu)良底盤菌株的構(gòu)建。隨著人類對(duì)微生物體系越來(lái)越深入的認(rèn)識(shí)，以及糖基化策略的不斷改良，將會(huì)開啟生物合成糖苷類化合物的新時(shí)代。