祝清燦

國藥集團同濟堂(貴州)制藥有限公司，貴州 貴陽 550026

藏藥蟲草清肺膠囊處方由冬蟲夏草、沙棘膏、蛤蚧、南五味子、百部、白及、百合、枇杷葉、甘草、牡蠣組成，收載于《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》內(nèi)科肺系(一)分冊，具有潤肺補氣、清肺化痰、止咳平喘等功效。該制劑藥味多，工藝復(fù)雜，成品內(nèi)容物由提取物和藥材原生粉組成，有效成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，性質(zhì)各異，質(zhì)量研究難度大，原標(biāo)準(zhǔn)只對南五味子、沙棘膏進行薄層色譜法鑒別，采用HPLC法測定南五味子中五味子甲素的含量，質(zhì)量控制有盲點，不能準(zhǔn)確地評估其藥效價值[1]。為保證藥品的安全、有效和質(zhì)量可控，筆者進行了提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，增加了處方中甘草的薄層色譜定性鑒別[3-5]方法。南五味子來源于木蘭科植物華中五味子SchisandrasphenantheraRehd.et Wils. 的干燥成熟果實，其乙醇提取物具有治療肺炎[2]的作用，由于多版(2005版，2010版，2015版)《中華人民共和國藥典》一部對南五味子均采用代表性和專屬性更強的五味子酯甲作為含量測定指標(biāo)性成分，因此本實驗采用高效液相色譜法對復(fù)方中的五味子酯甲進行含量測定研究[5～7]，為提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 2695高效液相色譜儀(在線脫氣機、四元泵、2998PDA二極管陣列檢測器、Empower2化學(xué)工作站)；色譜柱：A：Welch Ultimate XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，B：Kromasil 5-100 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，C：安譜CNW XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；電子分析天平，型號：BS224S，德國賽多利斯公司； YOKO-ZS薄層色譜成像儀，武漢藥科新技術(shù)開發(fā)有限公司；超聲波清洗儀，型號Branson 5510，必能信超聲(上海)有限公司。

五味子酯甲對照品(111529-200302)、甘草對照藥材(180904-201117)均購于中國食品藥品檢定研究院；四氫呋喃、甲醇、乙腈為色譜純，天津市四友精細化學(xué)品有限公司(批號181020)；水為超純化水；其它試劑均為分析純，天津市富宇精細化工有限公司生產(chǎn)；硅膠G預(yù)制板(德國默克公司生產(chǎn)，批號HX242369)。

蟲草清肺膠囊由青海普蘭特藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號為170414、180304、180603、180713、180804、181005、181102、181125、181207、190101。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草薄層色譜定性鑒別供試品溶液的制備 取蟲草清肺膠囊內(nèi)容物3 g，加甲醇[9]50 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL使溶解，濾過，濾液用水飽和正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次50 mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。

對照藥材溶液的制備 取甘草對照藥材0.2 g，加水20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液用水飽和正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次50mL，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為對照藥材溶液。

陰性對照溶液的制備 按處方配比，取除甘草外的其他藥味，按蟲草清肺膠囊制備工藝制成樣品，取3 g按“供試品溶液的制備”的方法制成缺甘草陰性對照溶液。

薄層色譜鑒別方法與結(jié)果 取供試品溶液、甘草對照藥材溶液與陰性對照溶液各2 μL，條帶狀點樣，分別點于1%氫氧化鈉改性的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，分別在日光和紫外燈光下(365 nm)檢視。供試品色譜中在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同顏色的條斑(A)；紫外光燈下顯相同顏色的熒光條斑(B)；甘草陰性對照無干擾。如圖1所示。

2.2 五味子酯甲含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 取五味子酯甲對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含26 μg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物適量，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理[10](功率250 W，頻率40 kHz)40 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 缺南五味子陰性對照的制備 按處方配比，取除南五味子外的其他藥味，按蟲草清肺膠囊制備工藝制成樣品，取1 g按“供試品溶液的制備”的方法制成缺南五味子陰性對照溶液。

2.2.4 色譜條件 采用C18柱，以四氫呋喃-水[11](38∶62)為流動相，檢測波長為254 nm，流速1.0 mL·min-1。理論板數(shù)按五味子酯甲峰計算應(yīng)不低于3000。

2.2.5 專屬性試驗 吸取五味子酯甲對照品溶液、缺南五味子陰性對照溶液、蟲草清肺膠囊供試品溶液各20 μL，按2.2.4色譜條件測定。結(jié)果表明缺南五味子陰性對照無干擾，如圖2所示。

采用二極管陣列檢測器對供試品溶液中的五味子酯甲色譜峰進行峰光譜掃描和純度檢測，結(jié)果峰純度角度<峰純度閾值，供試品中五味子酯甲光譜圖與譜庫中五味子酯甲標(biāo)準(zhǔn)光譜圖匹配理想，說明五味子酯甲色譜峰為純峰，專屬性考察符合要求。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取五味子酯甲對照品適量，置50 mL容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含五味子酯甲0.2370 mg)，作為儲備液。分別精密吸取該儲備液1 mL、2 mL、3 mL、5mL、10 mL，置25 mL容量瓶中，分別用甲醇定容，制成系列濃度對照品溶液I～V(濃度分別為0.009 48 mg·mL-1，0.018 96 mg·mL-1，0.028 44 mg·mL-1，0.047 40 mg· mL-1，0.094 80 mg·mL-1)。分別精密吸取系列濃度對照品溶液I～V各20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.4 色譜條件” 測定各自峰面積。以進樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，求得五味子酯甲的線性回歸方程為：Y=1.21×106X-1.48×104，r=0.999 98。結(jié)果表明：五味子酯甲進樣量在0.1896～1.896 μg的范圍內(nèi)與峰面積值呈良好的線性關(guān)系，可用外標(biāo)一點法計算含量。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取五味子酯甲對照品溶液(28.44 μg·mL-1)20 μL，重復(fù)進樣5次，按“2.2.4色譜條件”測定，五味子酯甲峰面積積分值的RSD=0.64%，符合精密度要求。

2.2.8 重復(fù)性試驗 取蟲草清肺膠囊(批號180603)，研細，混勻，取6份，每份約1g，精密稱定，按2.2.1方法制備供試品溶液，按“2.2.4色譜條件”測定，RSD=1.40%，表明重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收試驗 取蟲草清肺膠囊(批號180603，含五味子酯甲0.864 mg·g-1)，研細，混勻，取6份，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液25 mL(每1 mL含五味子酯甲18.96 μg)，按“2.2.1”的方法制備供試品溶液。按“2.2.4色譜條件”測定含量，計算五味子酯甲的平均回收率為99.98%，RSD=1.5%，表明方法的準(zhǔn)確度較好。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收實驗測定結(jié)果

2.2.10 穩(wěn)定性考察 取“2.2.8重復(fù)性試驗”制備的供試品溶液，按“2.2.4 色譜條件”測定，分別于0、2、4、8、15 h測定其峰面積，RSD=0.4%，結(jié)果表明供試品溶液在15h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.11 色譜柱考察 取蟲草清肺膠囊(批號180713)，采用3種品牌的色譜柱測定五味子酯甲的含量，A：Welch Ultimate XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)，B：Kromasil 5-100 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；C：安譜CNW XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，測得色譜峰分離良好，含量結(jié)果無顯著差異，RSD=2.2%，表明含量測定方法耐用性和穩(wěn)定性好。

2.2.12 樣品測定 取10批蟲草清肺膠囊，按照“2.2.4色譜條件”測定五味子酯甲含量，結(jié)果見表2。

表2 十批成品中五味子酯甲含量測定結(jié)果

根據(jù)測定結(jié)果，十批樣品中五味子酯甲平均含量為0.254 mg/粒，考慮到南五味子原料含量的波動，建議蟲草清肺膠囊每粒含五味子酯甲不少于0.2 mg。

3 討論

蟲草清肺膠囊處方中共有10味藥材，原標(biāo)準(zhǔn)對冬蟲夏草、蛤蚧進行顯微鑒別，對沙棘膏、南五味子進行薄層色譜鑒別，對南五味子中五味子甲素進行含量測定。國家食品藥品監(jiān)督管理局在批準(zhǔn)蟲草清肺膠囊標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)正時建議：增加專屬性強的鑒別項；參照藥典修訂南五味子的含量測定指標(biāo)成分及測定方法。在實驗過程中，筆者分別對處方中百部、甘草、白及、百合、枇杷葉、牡蠣藥材進行薄層色譜鑒別方法研究，結(jié)果顯示：除甘草外，其余5味藥鑒別方法均不理想，陰性有干擾，故本實驗僅報道甘草的薄層色譜鑒別方法。

3.1 薄層色譜條件選擇 分別使用德國默克公司和青島海洋化工廠兩種品牌的硅膠G薄層板，溫度在5 ℃、20 ℃、35 ℃，相對濕度在18%、40%、88%的環(huán)境中進行甘草的薄層色譜鑒別實驗，分離效果均較好，表明所建立的方法穩(wěn)定，耐用性好。

3.2 高效液相色譜法供試品溶液制備 實驗考察了乙醇、甲醇、三氯甲烷對五味子酯甲提取效果的影響，結(jié)果表明：甲醇的提取效果最好。同時，對取樣量、提取方式、提取時間進行了考察，最終采用取1 g供試品，精密加入甲醇25 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)40 min的提取方法。

3.3 高效液相法色譜條件的選擇 分別考察采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸和四氫呋喃-水為流動相時的分離情況，結(jié)果表明，以四氫呋喃-水為流動相時，各色譜峰的分離效果較好。 采用二極管陣列檢測器對供試品溶液和五味子酯甲對照品溶液在210～400 nm范圍內(nèi)進行全波長掃描，結(jié)果表明，五味子酯甲在波長[12]254 nm處的峰純度較高，專屬性較強，由此確定檢測波長為254 nm。

本實驗表明，甘草的薄層色譜鑒別方法專屬性強，陰性樣品無干擾，得到的TLC圖譜班點清晰，分離度符合要求，Rf值適中。五味子酯甲含量測定方法專屬性強，穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、耐用性好，準(zhǔn)確度高。本實驗結(jié)果可為提高蟲草清肺膠囊的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。