劉 艷 張 慧 熊然英 楊朝蓮

貴州省六盤(pán)水市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所，貴州 六盤(pán)水 553001

錦雞兒又名陽(yáng)雀花，為豆科錦雞兒屬植物錦雞兒Caraganasinica(Buc’hoz.)Rehd.的干燥根[1]，分布于河北、新疆、山東、江蘇、浙江、江西、福建、河南、湖南、四川、云南和貴州等地，具補(bǔ)肺健脾、活血祛風(fēng)的功效，主治高血壓、虛勞倦怠、肺虛久咳、婦女血崩、白帶、乳少、風(fēng)濕骨痛、痛風(fēng)、半身不遂、跌打損傷[2]。民間藥用錦雞兒屬植物主要有錦雞兒、中間錦雞兒、藏錦雞兒等。貴州藥用錦雞兒屬植物為錦雞兒，主要含有黃酮、二苯乙烯、萜類(lèi)、甾體等成分[3-5]，其中黃酮類(lèi)成分有抗菌、抗氧化[6]等活性。因此本研究以錦雞兒總黃酮為質(zhì)量控制指標(biāo)，測(cè)定黔產(chǎn)錦雞兒藥材中總黃酮含量。目前文獻(xiàn)報(bào)道錦雞兒屬黃酮的研究主要為施蛟等對(duì)中間錦雞兒黃酮類(lèi)成分的化學(xué)研究、鄭敏燕等對(duì)藏錦雞兒總黃酮含量的初步研究及樸惠順等對(duì)小葉錦雞兒與朝鮮錦雞兒總黃酮含量的比較研究[7-9]，尚未對(duì)黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮進(jìn)行研究，為了更好地發(fā)展貴州民族藥，開(kāi)發(fā)利用黔產(chǎn)錦雞兒，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)，采用紫外分光光度法進(jìn)一步研究黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮的最佳提取方法，為黔產(chǎn)錦雞兒的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材 采自貴州省六盤(pán)水市、安順市、興義市、畢節(jié)市、貴陽(yáng)市、銅仁、凱里、都勻、遵義、威寧等地，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)藥大學(xué)周漢華副教授鑒定為豆科錦雞兒屬植物錦雞兒Caraganasinica(Buc’hoz)Rehd.的干燥根。

1.2 試藥與試劑 蘆丁對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：10080-201610，UV含量92.6%)。試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為自制二級(jí)純凈水。

1.3 儀器 Thermo Evolution 220紫外分光光度計(jì)(賽默飛(上海)儀器有限公司)，ME104E萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，AG135十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，HH恒溫水浴鍋(江蘇中大儀器科技有限公司)，SB-5200DTDN超聲波提取器(寧波新芝生物科技有限公司)，DFY-300搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取120 ℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品約20 mg，精密稱(chēng)定，置 100 mL量瓶中，加乙醇適量，振搖使溶解，稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 mL含無(wú)水蘆丁0.2 mg)。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的確定 取蘆丁對(duì)照品溶液3 mL，置25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加氫氧化鈉試液10 mL，搖勻，加水至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，按紫外-可見(jiàn)分光光度法《中國(guó)藥典》2015年版四部 (通則0401)，于400～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描。結(jié)果蘆丁對(duì)照品溶液在509.98 nm處有最大吸收，故選510 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。吸收光譜如圖1所示。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL，分別置25 mL容量瓶中，按2.2項(xiàng)下自“加水至6 mL”起，同法操作，分別在510 nm處測(cè)定其吸光度。以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度(mg/mL)(X)為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程得：Y=13.375X-0.0055，r=0.9998。在0.00865～ 0.05189 mg/mL范圍內(nèi)，線性良好。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)選提取方法 根據(jù)初步試驗(yàn)的結(jié)果，乙醇作為提取溶劑，回流提取作為提取方法，選用L9(34)正交試驗(yàn)表，以直接影響總黃酮收率的提取倍數(shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素3個(gè)水平，見(jiàn)表1；對(duì)黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮的最佳提取方法進(jìn)行優(yōu)選，見(jiàn)表2、表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析表

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

由方差分析，該實(shí)驗(yàn)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著性。所以由直觀分析應(yīng)選擇A2B2C3實(shí)驗(yàn)方案，即是料液比1∶100倍(50 mL)，回流提取3次，每次60 min。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照A2B2C3的條件提取3次，進(jìn)行吸光度測(cè)定，其總黃酮含量的平均值為2.83%，RSD為1.18%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，利用正交實(shí)驗(yàn)方法確定的A2B2C3為最佳提取工藝。

2.6 供試品溶液的制備 黔產(chǎn)錦雞兒藥材粉碎過(guò)篩，取0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，稱(chēng)重，水浴回流提取3次，每次60 min，放冷，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，合并續(xù)濾液備用。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液3 mL置25 mL容量瓶中，按2.2項(xiàng)下自“加水至6 mL”起，按實(shí)驗(yàn)方法操作連續(xù)測(cè)定6次吸光度，結(jié)果為0.324、0.314、0.324、0.329、0.322、0.325，平均值為0.323，RSD為1.54%。表明精密良好。

2.7.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液3 mL置25 mL容量瓶中，按2.2項(xiàng)下自“加水至6 mL”起，同法操作，在顯色后0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 min在510 nm處測(cè)定，其吸光度分別為0.392、0.398、0.403、0.404、0.404、0.405、0.404、0.404、0.403、0.402，平均值為0.402，RSD為0.99%，表明黔產(chǎn)錦雞兒供試品溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn) 黔產(chǎn)錦雞兒供試品溶液6份，分別取3 mL置25 mL的容量瓶中，按2.2項(xiàng)下自“加水至6 mL”起，同法操作，顯色后在510 nm處測(cè)定，其吸光度分別為0.364、0.365、0.364、0.371、0.379、0.375，平均值為0.370，RSD為1.73%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性較好。

2.7.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量的黔產(chǎn)錦雞兒樣品6份，每份約0.25 g，分別精密加入蘆丁對(duì)照品6 mg，進(jìn)行含量測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果蘆丁的平均回收率為99.50%(n=6)，RSD=1.88%。見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.8 黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮含量測(cè)定 10批黔產(chǎn)錦雞兒樣品按最佳提取條件提取，分別精密量取3 mL置25 mL的容量瓶中，再按2.2項(xiàng)下自“加水至6 mL”起，同法操作，在510 nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮的含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 黔產(chǎn)錦雞兒藥材總黃酮含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，用分光光度法測(cè)定黔產(chǎn)錦雞兒中總黃酮含量簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可作為黔產(chǎn)錦雞兒中總黃酮含量的一種方法。

正交試驗(yàn)中通過(guò)極差分析得到：極差C>極差A(yù)>極差B，因此比較得到影響總黃酮提取因素的主次為提取次數(shù)>提取倍數(shù)>提取時(shí)間。結(jié)果表明，黔產(chǎn)錦雞兒總黃酮的最佳提取條件為：選用乙醇作為溶劑，料液比1∶100倍，回流提取3次，每次60 min ，合并濾液。該工藝合理，可作為黔產(chǎn)錦雞兒藥材中總黃酮的提取方法。

文獻(xiàn)報(bào)道藏錦雞兒中總黃酮平均含量為1.64%，小葉錦雞兒與朝鮮錦雞兒總黃酮含量均小于1%，安徽產(chǎn)錦雞兒總黃酮平均含量為3.37%，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得黔產(chǎn)錦雞兒材總黃酮的平均含量為2.57%，說(shuō)明錦雞兒屬植物不同種之間總黃酮含量不同，不同產(chǎn)地間錦雞兒的質(zhì)量存在一定差異，不同地理環(huán)境，生態(tài)條件對(duì)錦雞兒藥材質(zhì)量有一定影響。本實(shí)驗(yàn)可以為黔產(chǎn)錦雞兒的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。