俸婷婷 楊順龍 孫 悅 林 冰* 周 英 趙 致

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)中藥天然藥研發(fā)中心，貴州 貴陽 550025

黃精為百合科植物滇黃精PolygonatumkingianumColl. et Hemsl.、黃精PolygonatumsibiricumRed.或多花黃精PolygonatumcyrtonemaHua的干燥根莖，補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎，用于脾胃氣虛、體倦乏力、胃陰不足、口干食少、肺虛燥咳、勞嗽咳血、精血不足、腰膝酸軟、須發(fā)早白、內(nèi)熱消渴[1]。黃精歷代入藥生制兼用，但傳統(tǒng)以黃精生用“刺入咽喉”，故多炮制后入藥[2]。2015版《中華人民共和國藥典》(一部)收載的黃精加工方法為采挖后除去須根，洗凈，置沸水中略燙或蒸至透心，干燥；飲片的炮制方法為除去雜質(zhì)，洗凈，略潤，切厚片，干燥[1]。

《中華本草苗藥卷》收載黃精，又名ghok naol jad(貴州畢節(jié))、shand ghunx(貴州松桃)、kid vud(貴州黔東南)、kid oub(貴州黔南)，加工方法為挖起根莖后去掉莖稈，洗凈泥沙，除去須根和爛疤，蒸到透心后，曬或烘干?！顿F州中草藥名錄》記載能潤肺養(yǎng)陰、健脾益氣、祛痰、止血、消腫解毒；《苗族藥物集》記載能補虛止咳，恢復(fù)視力；《貴州民間藥物》記載能止咳，接骨[3]。

近年來，隨著藥材規(guī)范化種植的推行，可以把藥材的產(chǎn)地加工和炮制集中在一起，從而達(dá)到降低加工成本和提高飲片質(zhì)量的目的[4]。本研究對黔產(chǎn)黃精的產(chǎn)地加工和炮制一體化進(jìn)行研究，通過化學(xué)等量性研究及初步的生物等效性研究，初步探討黔產(chǎn)黃精產(chǎn)地加工炮制一體化技術(shù)的合理性及可行性。

1 儀器與材料

FA2004分析天平(上海良平儀器儀表有限公司)；0027391數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市環(huán)保儀器廠)；SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵(上海予正儀器設(shè)備有限公司)；GZX-9146MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；HY-0413型中藥粉碎機(環(huán)亞天元機械技術(shù)有限公司)；UV-1801型紫外分光光度計(北京瑞利分析儀器有限公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)。

無水乙醇、濃硫酸(重慶川東化工化學(xué)試劑有限公司，分析純)；蒽酮(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙腈(Fisher公司，色譜純)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究所，1501123)；黃精(貴州大禹王農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司)，經(jīng)貴州大學(xué)熊新源教授鑒定為黃精屬植物多花黃精PolygonatumCyrtonemaHua的干燥根莖；清潔級昆明種小鼠(重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司，SCXK(渝) 2012-0008)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃精加工炮制方法 在傳統(tǒng)方法中，黃精的產(chǎn)地加工和炮制是分開進(jìn)行的，共需要9個步驟，如圖1所示。而產(chǎn)地加工炮制一體化技術(shù)則只需要5個步驟，其中主要是減少了1次洗凈和1次干燥等易使有效成分流失的步驟，如圖2所示。黃精在產(chǎn)地加工過程中需“略燙或蒸至透心”，前期研究發(fā)現(xiàn)燙制方法具有處理時間短、方法簡單且綜合評分較高等優(yōu)點，故本研究中選取燙制方法，設(shè)立“先切后燙”及“先燙后切”兩種一體化技術(shù)。

2.2 黃精多糖的含量測定[1]

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，參照2015年版《中華人民共和國藥典》(一部)黃精中對照品溶液的制備方法，制備葡萄糖對照品溶液，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=11.691C+0.11167，R2=0.9995，表明在葡萄糖濃度在0.0125～0.075 mg·mL-1之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 多糖含量的測定 精密稱取黃精樣品，參照2015年版《中華人民共和國藥典》(一部)黃精中多糖的測定方法，測定3種加工炮制方法黃精中多糖的含量，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值，并按式(1)計算一體化技術(shù)相對傳統(tǒng)技術(shù)的變化率，結(jié)果見表1。一體化技術(shù)先燙后切組的黃精多糖含量略高于傳統(tǒng)技術(shù)組，但一體化技術(shù)先切后燙組的黃精多糖含量低于傳統(tǒng)技術(shù)組。

(1)

式中，Ai為一體化技術(shù)的含量測量值，A0為傳統(tǒng)技術(shù)的含量測量值。

2.3 黃精醇浸物的含量測定[5-6]精密稱取黃精樣品，參照2015年版《中華人民共和國藥典》(四部)熱浸法測定3種加工炮制方法黃精中醇溶性浸出物含量，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。并按式(1)計算一體化技術(shù)相對傳統(tǒng)技術(shù)的變化率，結(jié)果見表1。一體化技術(shù)的黃精醇浸物含量均高于傳統(tǒng)技術(shù)組，但變化率均小于3%。

2.4 黃精水浸物的含量測定[5-6]精密稱取黃精樣品，參照2015年版《中華人民共和國藥典》(四部)熱浸法測定3種加工炮制方法黃精中水溶性浸出物含量，重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。并按式(1)計算一體化技術(shù)相對傳統(tǒng)技術(shù)的變化率，結(jié)果見表1。一體化技術(shù)先燙后切組的黃精水浸物含量與傳統(tǒng)技術(shù)組相當(dāng)，一體化技術(shù)先切后燙組的黃精水浸物含量略低于傳統(tǒng)技術(shù)組。

表1 不同加工炮制方法黃精多糖、醇浸物、水浸物的含量測定結(jié)果

2.5 不同加工炮制方法黃精的高效液相指紋圖譜分析

2.5.1 供試品溶液的制備[7]取干燥至恒重的黃精樣品粉末2 g，加70%的乙醇50 mL，超聲提取30 min，放冷，抽濾，濾渣用同樣方法再次提取，合并2次提取液，旋干。加10 mL甲醇溶解，加入10 g·L-1的殼聚糖冰醋酸溶液100 μL，放過夜，用0.22 μm濾膜濾過后，濾液作為供試品溶液。

2.5.2 色譜條件[7]安捷倫1260高效液相色譜儀，ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈(A，下文用體積分?jǐn)?shù))和水(B)為流動相，采用二元梯度洗脫，梯度程序為0～10 min，5%～10%A；10～30 min，10%～35%A；30～40 min，35%～60%A；40～60 min，60%～100%A。流速1 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。檢測波長分別設(shè)定為210、254、270及290 nm。

2.5.3 高效液相指紋圖譜分析[8-9]將黃精的指紋圖譜峰在2～20 min 共有指紋區(qū)進(jìn)行統(tǒng)計，在210、254、270及290 nm波長下，從3組樣品圖譜的共有指紋區(qū)分別標(biāo)定了11、8、9及9個共有峰，如圖3所示。采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)”進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，設(shè)定傳統(tǒng)技術(shù)組(S0)為參照圖譜，將先切后燙組(S1)和先燙后切組(S2)的色譜峰與參照圖譜進(jìn)行自動匹配，見表2。各加工方法所得黃精指紋圖譜之間的相似度均在0.90以上。并按式(2)計算一體化技術(shù)共有峰面積與稱樣量比值對傳統(tǒng)技術(shù)的變化率。結(jié)果見表3。一體化技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)比較，其變化率的平均值均為正值，表明與傳統(tǒng)技術(shù)相比，一體化技術(shù)能夠更大程度保留黃精中的成分，減少成分流失，并且先燙后切組明顯優(yōu)于先切后燙組。

表3 主要共有峰峰面積與稱樣量(g)比值相對傳統(tǒng)技術(shù)變化率(%)

表 2 不同加工炮制方法黃精的指紋圖譜相似度

(2)

式中，Si為一體化技術(shù)測得的峰面積；mi為一體化技術(shù)試樣質(zhì)量；S0為傳統(tǒng)炮制技術(shù)測得的峰面積；m0為傳統(tǒng)炮制技術(shù)試樣質(zhì)量。

A：210nm；B：254nm；C：270nm；D：290nm。圖3 不同加工炮制方法黃精的指紋圖譜

2.6 不同加工炮制方法黃精的抗疲勞作用研究[10-11]

選取體重在18～22 g之間的雄性小鼠40只，隨機分為4組，即空白對照組、傳統(tǒng)技術(shù)組、先切后燙組和先燙后切組。傳統(tǒng)飲片組、先切后燙組和先燙后切組每只每天以5 g·kg-1黃精提取液灌胃給藥，空白組每天給予相同體積的蒸餾水，連續(xù)給藥10 d。末次給藥后30 min后，在鼠尾根部系上質(zhì)量為小鼠體重6%的重物，置于水深25 cm、水溫25 ℃的水箱中游泳，記錄小鼠游泳至力竭沉沒后10 s仍不能浮出水面的時間作為小鼠力竭性游泳時間，結(jié)果見表4。三種加工炮制方法得到的黃精提取液均能明顯延長小鼠負(fù)重游泳時間(P<0.01)，與空白對照組相比，一體化技術(shù)的先燙后切組延長時間最長，并略優(yōu)于傳統(tǒng)技術(shù)組，先切后燙組延長時間較短。

表4 不同加工炮制方法黃精對小鼠負(fù)重游泳時間的影響

3 討論

本研究從化學(xué)等量性和初步的生物等效性兩方面綜合考察黃精產(chǎn)地加工炮制一體化技術(shù)的合理性和可行性。在化學(xué)等量性方面，一體化技術(shù)先燙后切組多糖、醇浸物、水浸物含量均與傳統(tǒng)技術(shù)相當(dāng)或略優(yōu)，而一體化技術(shù)先切后燙組較傳統(tǒng)技術(shù)相當(dāng)或略差。通過4個波長下指紋圖譜相似性比較，一體化技術(shù)相對于傳統(tǒng)技術(shù)的變化率表明，一體化技術(shù)優(yōu)于傳統(tǒng)技術(shù)，先燙后切組又優(yōu)于先切后燙組。在生物等效性方面，小鼠抗疲勞試驗研究表明，一體化技術(shù)組及傳統(tǒng)技術(shù)組均能明顯延長小鼠負(fù)重游泳時間，且先燙后切組略優(yōu)于傳統(tǒng)技術(shù)組，而先切后燙組較傳統(tǒng)技術(shù)組略差。一體化技術(shù)先切后燙組在多糖、水浸物含量及小鼠負(fù)重游泳時間等指標(biāo)上差于傳統(tǒng)技術(shù)組，其原因可能為先切后使藥材表面積增大，從而在燙制過程中易導(dǎo)致成分流失。

綜上，一體化技術(shù)先燙后切方法與傳統(tǒng)技術(shù)相當(dāng)或略優(yōu)，且減少了加工環(huán)節(jié)，節(jié)約了成本，具有一定的合理性和可行性。作為貴州道地藥材之一，貴州黃精屬植物資源較為豐富[12]。鑒于黃精具有廣泛的藥理作用和復(fù)雜的化學(xué)成分[13-14]，其系統(tǒng)的生物等效性及化學(xué)等量性還有待進(jìn)一步深入研究。